甘藍(lán)BoSVP mRNA運(yùn)輸鑒定及其對(duì)砧木SVP轉(zhuǎn)錄表達(dá)的影響

陶 鵬 趙彥婷 岳智臣 雷娟利 李必元

(浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜研究所，浙江 杭州 310021)

植物MADS-box 蛋白家族由一類包含MADS-box結(jié)構(gòu)域的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子組成[1－2]，在植物花器官分化、開花時(shí)間調(diào)控以及果實(shí)成熟中扮演著重要的角色[3－4]。SVP 蛋白包含典型的MICK 結(jié)構(gòu)域，屬于MADS-box 蛋白家族中StMADS11 亞家族的一員。此外，SVP 是植物開花負(fù)調(diào)控因子[5－6]。SVP 可與FLC(FLOWERING LOCUS C)形成復(fù)合體抑制開花啟動(dòng)基因的表達(dá)，從而實(shí)現(xiàn)開花推遲[7]。研究顯示SVP 蛋白也可以通過直接結(jié)合pri-miR172a 啟動(dòng)子，以抑制miR172 的轉(zhuǎn)錄，通過調(diào)控miR172 及其靶基因的表達(dá)推遲開花[8]。SVP 蛋白還可以通過結(jié)合到FT與SOC1 基因的啟動(dòng)子CArG 盒上以抑制FT、TSF和SOC1 的轉(zhuǎn)錄表達(dá)，從而推遲開花[9－10]。

在模式植物擬南芥中，AGL24 是SVP的旁系同源基因，兩者基因序列相似，但生物學(xué)功能相反[11]。在擬南芥(Arabidopsis thaliana)中，AtAGL24 是一種劑量依賴型的開花促進(jìn)基因，在頂端分生組織中調(diào)控開花[12]。前期研究發(fā)現(xiàn)，菜心(Brassica campestrisL. ssp.chinensisvar.utilisTsen et lee)BrAGL24 的mRNA 可在甘藍(lán)/菜心異源嫁接體中進(jìn)行長(zhǎng)距離運(yùn)輸[13]。在擬南芥和青花菜中也發(fā)現(xiàn)AGL24 的mRNA 可長(zhǎng)距離移動(dòng)并促進(jìn)接穗提前開花[14]。而序列相似的SVP基因是否也具有mRNA 長(zhǎng)距離運(yùn)輸?shù)奶匦陨胁磺宄?。目前常采用?gòu)建異源嫁接體并結(jié)合轉(zhuǎn)錄組測(cè)序來批量研究穗砧之間的mRNA 運(yùn)輸。在葡萄嫁接體中，通過轉(zhuǎn)錄組測(cè)序檢測(cè)到3 333 個(gè)基因的mRNA 可在穗砧之間運(yùn)輸[15]。在煙草/擬南芥異源嫁接體中檢測(cè)到擬南芥中有138 個(gè)基因的mRNA 運(yùn)輸?shù)綗煵葜衃16]。在煙草/番茄異源嫁接中鑒定到1 096 個(gè)基因的mRNA 穿過嫁接連接處進(jìn)行垂直方向的運(yùn)輸[17]。本研究構(gòu)建了甘藍(lán)/菜心異源嫁接體，并對(duì)砧木菜心花序軸進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，利用種間差異序列在菜心轉(zhuǎn)錄組測(cè)序文庫中篩選到來自甘藍(lán)(Brassica oleraceavar L.capitataL.)的BoSVPmRNA read，比較砧木菜心中外源BoSVP和內(nèi)源BrSVP之間的read 數(shù)量差異，分析嫁接體的砧木菜心花序軸和菜心實(shí)生苗花序軸中SVP的轉(zhuǎn)錄表達(dá)情況，以期為深入解析甘藍(lán)/菜心嫁接誘導(dǎo)接穗提早開花的分子機(jī)制提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料及取樣

甘藍(lán)G27 和49 菜心種子來自浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜所。將甘藍(lán)G27 種子播于穴盤中，49 菜心種子晚一周播種。待甘藍(lán)G27 生長(zhǎng)至45 d，將其莖尖嫁接到49菜心的花序軸上，構(gòu)建甘藍(lán)/菜心嫁接體，留6 株49 菜心實(shí)生苗繼續(xù)生長(zhǎng)作為對(duì)照組。嫁接后30 d，對(duì)甘藍(lán)/菜心嫁接體的嫁接處下方1 cm 的菜心花序軸進(jìn)行取樣(標(biāo)記為T1、T2 和T3)，對(duì)菜心實(shí)生苗相對(duì)應(yīng)部位的花序軸進(jìn)行取樣作為對(duì)照組(標(biāo)記為T4、T5、T6)。RNA提取、轉(zhuǎn)錄組測(cè)序工作均由北京百邁客公司完成。

1.2 甘藍(lán)BoSVP 和菜心BrSVP 的mRNA 全長(zhǎng)序列的獲得

參考甘藍(lán)SVP基因(Bo4g149800)序列，從甘藍(lán)實(shí)生苗的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序文庫中篩選甘藍(lán)SVP基因的read，并拼接獲得甘藍(lán)SVP基因的mRNA 全長(zhǎng)序列，命名BoSVP。參考白菜Brassica rapassp.pekinensis SVP基因(Bra030228)的序列，從菜心實(shí)生苗的花序軸的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序文庫中篩選菜心SVP的read，拼接并獲得菜心SVP基因(命名為BrSVP)的mRNA 全長(zhǎng)序列。

1.3 甘藍(lán)BoSVP 和菜心BrSVP 的雜合SNP 分析和種間差異序列的選擇

基于甘藍(lán)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序各樣品的read，使用TopHat2[18]與甘藍(lán)參考基因組序列進(jìn)行比對(duì)，使用GATK The Genome Analysis Toolkit[19]軟件識(shí)別測(cè)序樣品與參考基因組間的單堿基錯(cuò)配，識(shí)別潛在的單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism，SNP)位點(diǎn)，并標(biāo)注BoSVP中雜合的SNP 位點(diǎn)?；诓诵霓D(zhuǎn)錄組測(cè)序各樣品的read，使用TopHat2 與白菜參考基因組序列進(jìn)行比對(duì)，使用GATK 識(shí)別測(cè)序樣品與參考基因組中的單堿基錯(cuò)配，使用簡(jiǎn)并堿基標(biāo)注菜心BrSVP的雜合SNP 位點(diǎn)。GATK 識(shí)別標(biāo)準(zhǔn)如下:(1)35 bp 范圍內(nèi)連續(xù)出現(xiàn)的單堿基錯(cuò)配不超過3 個(gè)；(2)經(jīng)過序列深度標(biāo)準(zhǔn)化的SNP 質(zhì)量值大于2.0。使用Clustal Omega 將BoSVP和BrSVP進(jìn)行序列比對(duì)，在5′UTR、編碼區(qū)以及3′UTR 中均勻標(biāo)注種間差異序列并進(jìn)行編號(hào)，以備后期篩選read。

1.4 種間差異序列的比較評(píng)估

為評(píng)估種間差異序列的準(zhǔn)確性，以每一個(gè)種間差異序列及其反向互補(bǔ)序列作為檢索序列，使用UltraEdit 軟件在砧木菜心T1、T2 和T3 文庫中篩選菜心BrSVP的read，并統(tǒng)計(jì)數(shù)量。由于每個(gè)文庫中的read 總數(shù)不一致，需要對(duì)種間差異序列檢索到read 數(shù)量進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。本研究采用RPKM reads per kilobase per million mapped reads 的計(jì)算方法對(duì)所獲得read 數(shù)量進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，使用Excel 表格制圖。計(jì)算相鄰兩組read 數(shù)量的標(biāo)準(zhǔn)偏差，評(píng)估種間差異序列的準(zhǔn)確性。

1.5 BoSVP mRNA 運(yùn)輸分析

分別以種間差異序列G7 和G8 及其對(duì)應(yīng)的反向互補(bǔ)序列作為檢索序列，使用UltraEdit 軟件在甘藍(lán)/菜心嫁接的砧木菜心花序軸轉(zhuǎn)錄組測(cè)序文庫(T1～T3)和對(duì)照組菜心實(shí)生苗的花序軸轉(zhuǎn)錄組測(cè)序文庫(T4～T6)中篩選來自甘藍(lán)的BoSVP的mRNA 運(yùn)輸?shù)膔ead，并以R 開頭分別命名為R1、R2、……。為進(jìn)一步驗(yàn)證從甘藍(lán)中篩選出來的read 來自于甘藍(lán)的BoSVP序列，將篩選出的reads 與BrSVP和BoSVP序列進(jìn)行比對(duì)。如果read 的序列與BoSVP序列一致，說明甘藍(lán)BoSVP的mRNA 長(zhǎng)距離運(yùn)輸?shù)搅苏枘静诵闹小?/p>

1.6 SVP 基因表達(dá)分析

采用RPKM 作為衡量轉(zhuǎn)錄表達(dá)水平的指標(biāo)，計(jì)算甘藍(lán)/菜心嫁接體的砧木菜心花序軸和菜心實(shí)生苗的花序軸中SVP的轉(zhuǎn)錄表達(dá)情況。

2 結(jié)果與分析

2.1 甘藍(lán)和菜心SVP 基因序列的比較及雜合SNP的鑒定

以甘藍(lán)全基因組測(cè)序數(shù)據(jù)為參考，分析甘藍(lán)BoSVP基因的SNP 變異情況，結(jié)果顯示BoSVP基因在5′UTR、編碼區(qū)和3′UTR 均未發(fā)現(xiàn)SNP 變異位點(diǎn)，無雜合SNP 位點(diǎn)。參考白菜全基因組數(shù)據(jù)，基于菜心葉片轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)，分析49 菜心BrSVP基因的SNP變異情況，結(jié)果顯示BrSVP在編碼區(qū)中存在4 個(gè)雜合位點(diǎn)(圖1)。

將甘藍(lán)BoSVP和菜心BrSVP的mRNA 全長(zhǎng)序列進(jìn)行比對(duì)，顯示兩者在序列上相似性極高。當(dāng)除去菜心的4 個(gè)雜合SNP，兩者在編碼區(qū)中只有4 個(gè)核苷酸的差異。而在5′UTR 和3′UTR 之間分別存在6 和16個(gè)核苷酸的差異。避開雜合SNP 的干擾，在SVP基因全長(zhǎng)mRNA 上選擇了9 條種間差異序列，依次命名為C1～C9，分布在5′UTR、編碼區(qū)以及3′UTR 上，每條種間差異序列總長(zhǎng)為30 nt，每條種間差異序列在BoSVP和BrSVP之間至少存在1 個(gè)nt 的差異(圖1)。

圖1 甘藍(lán)BoSVP 和菜心BrSVP 的mRNA 序列比對(duì)Fig.1 Sequence alignment of mRNA of BoSVP and BrSVP

2.2 種間差異序列的評(píng)估分析

本研究使用菜心的9 條種間差異序列(C1～C9)在菜心轉(zhuǎn)錄組測(cè)序文庫T1～T3 中分析菜心BrSVP基因的轉(zhuǎn)錄本read 數(shù)量，將其標(biāo)準(zhǔn)化并作圖。結(jié)果顯示使用相同種間差異序列在不同文庫中(T1、T2 和T3)檢索到read 數(shù)量重復(fù)性較好。而使用不同的種間差異序列(C1～C9)在相同文庫中的檢索所獲得的read數(shù)量之間有較大誤差，其中使用位于5′UTR 的C1 和3′UTR 的C9 在T1/T2/T3 文庫中檢索到的read 數(shù)量均明顯低于C2～C8 檢索所獲得的read 數(shù)量(圖2)。比較相鄰兩個(gè)種間差異序列檢索所獲得的read 數(shù)量標(biāo)準(zhǔn)差發(fā)現(xiàn)，使用C7 和C8 進(jìn)行檢索，兩者read 數(shù)量之間的差異最小。位于3′UTR 的C7 和C8 在BoSVP和BrSVP中分別存在4 個(gè)和5 個(gè)nt 的差異，序列本身的特異性較高，檢索獲得的read 數(shù)量之間的差異小，重復(fù)性最好。

圖2 檢索所獲read 數(shù)量的標(biāo)準(zhǔn)化值Fig.2 The standardized value of the number of the retrieved reads

2.3 甘藍(lán)BoSVP 基因mRNA 運(yùn)輸研究

本研究使用特異性和重復(fù)性較好的G7 和G8 序列在砧木菜心的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序文庫(T1～T3)和菜心實(shí)生苗的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序文庫(T4～T6)中篩選來自甘藍(lán)的BoSVPmRNA read。在菜心實(shí)生苗的花序軸轉(zhuǎn)錄組測(cè)序文庫(對(duì)照組)中均未找到甘藍(lán)BoSVPread，而在嫁接苗菜心的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序文庫中找到了潛在的異源read(表1)。

表1 甘藍(lán)BoSVP mRNA 運(yùn)輸?shù)膔ead 數(shù)量Table 1 The number of transported reads of BoSVP mRNA

為驗(yàn)證砧木菜心中識(shí)別的異源read 是否來自接穗甘藍(lán)的BoSVP，從T1～T3 文庫中提取這些異源read序列，實(shí)際獲得的異源read 共有11 個(gè)，并命名為R1～R11(圖3)。來自T1 文庫中的R3 中同時(shí)含有完整的G7 和G8 種間差異序列，使用G7 和G8 均能檢索到，R3 在G7 和G8 中各計(jì)入1 次。對(duì)上述提取的11 條運(yùn)輸read 進(jìn)行序列比對(duì)，結(jié)果顯示R1～R11 均屬于甘藍(lán)的BoSVP基因。R1 3′端有一段34 nt 的序列不屬于BoSVP基因(圖3)，將其分別在甘藍(lán)基因組和白菜基因組進(jìn)行比對(duì)，顯示R1 的這段34 nt 的序列仍屬于甘藍(lán)基因組。

圖3 砧木菜心中的異源read(R1～R11)與甘藍(lán)BoSVP和菜心BrSVP 的序列比對(duì)Fig.3 The heterologous reads (R1-R11) from rootstocks of the grafted seedlings were aligned with BoSVP and BrSVP

2.4 甘藍(lán)BoSVP 基因mRNA 運(yùn)輸對(duì)砧木菜心中SVP 轉(zhuǎn)錄表達(dá)量的影響

砧木菜心花序軸中SVP基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)包括內(nèi)源的BrSVPmRNA 和外源的BoSVPmRNA。為比較內(nèi)源BrSVPmRNA 和外源BoSVPmRNA 之間數(shù)量，本研究使用C7/G7 和C8/G8 兩組種間差異序列在砧木菜心轉(zhuǎn)錄組測(cè)序文庫T1/T2/T3 中進(jìn)行檢索。結(jié)果顯示在T1、T2 和T3 中外源運(yùn)輸?shù)腂oSVPmRNA read 數(shù)量明顯少于內(nèi)源表達(dá)的BrSVPmRNA read 數(shù)量(圖4)。對(duì)菜心實(shí)生苗的花序軸和甘藍(lán)/菜心嫁接體的菜心花序軸中的SVP基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)情況進(jìn)行分析，結(jié)果顯示SVP基因在菜心實(shí)生苗花序軸(對(duì)照組)和嫁接苗的菜心花序軸中的轉(zhuǎn)錄表達(dá)量差異小于2 倍，P值等于0.81，兩組數(shù)據(jù)差異不顯著(圖5)。

圖4 不同文庫中內(nèi)源BrSVP 和外源BoSVP read 數(shù)量Fig.4 The number of endogenous BrSVP reads and exogenous BoSVP reads in different library

圖5 SVP 基因在菜心花序軸中的轉(zhuǎn)錄表達(dá)量(P 值＝0.81)Fig.5 The transcriptional expression of SVP gene in inflorescence stems of Caixin (P value＝0.81)

3 討論

利用甘藍(lán)和菜心SVP基因之間的種間差異序列，在甘藍(lán)/菜心異源嫁接體的砧木菜心花序軸的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序文庫中可以準(zhǔn)確篩選到甘藍(lán)BoSVPmRNA 長(zhǎng)距離運(yùn)輸?shù)膔ead。選擇的種間差異序列中不能出現(xiàn)雜合的SNP。由于自身的雜合SNP 可能會(huì)導(dǎo)致異源BoSVP的錯(cuò)誤識(shí)別。所以選擇種間差異序列進(jìn)行菜心BrSVP內(nèi)源表達(dá)評(píng)估時(shí)候，應(yīng)盡量避免使用位于mRNA 兩端的種間差異序列。在分析菜心砧木轉(zhuǎn)錄組測(cè)序文庫中鑒定異源甘藍(lán)的BoSVPmRNA 的reads時(shí)，種間差異序列中的差異核苷酸越多，其特異性越高，所獲得的異源甘藍(lán)BoSVPmRNA 可信度越高。使用不同位置的種間差異序列評(píng)估菜心內(nèi)源BrSVPread值時(shí)，顯示位于BrSVP5′UTR 和3′UTR 兩端的種間差異序列獲得菜心內(nèi)源BrSVPread 值與其他差異序列所獲得值的偏差較大，可能與mRNA 兩端所獲得測(cè)序機(jī)會(huì)較少有關(guān)。

本研究利用G7 和G8 在砧木菜心的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序文庫中鑒定到來自甘藍(lán)BoSVP的11 條mRNA read，在每個(gè)嫁接體的砧木菜心的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序文庫中均找到了1～3 個(gè)甘藍(lán)BoSVPread。mRNA 的長(zhǎng)距離運(yùn)輸是一個(gè)極其復(fù)雜的過程，當(dāng)前尚未形成統(tǒng)一的觀點(diǎn)[20－21]。前期研究認(rèn)為mRNA 運(yùn)輸可能與mRNA 的序列和基序有關(guān)[22]。SVP與AGL24 在序列上具有相似性，同時(shí)兩者均具有mRNA 運(yùn)輸?shù)奶匦訹13]，暗示某些保守的序列決定了SVP基因的mRNA 的運(yùn)輸。比如，擬南芥GAI基因mRNA 在3′UTR 區(qū)和編碼區(qū)的特定基序和序列介導(dǎo)了其mRNA 在嫁接體中的運(yùn)輸[23]，馬鈴薯(Solanum tuberosum)StBEL5 基因的mRNA 可在韌皮部移動(dòng)，其3′UTR 決定了mRNA 的穩(wěn)定性及其運(yùn)輸?shù)礁康哪芰24－25]。但一些研究推測(cè)伴胞中mRNA 的豐度是mRNA 長(zhǎng)距離運(yùn)輸?shù)年P(guān)鍵因素[26－27]。后期研究需要明確BoSVPmRNA 運(yùn)輸?shù)姆肿訖C(jī)制。BoSVP的mRNA 從接穗甘藍(lán)運(yùn)輸?shù)秸枘静诵闹校ㄟ^比較砧木菜心中異源BoSVPmRNA 的reads 和內(nèi)源BrSVPmRNA 的read 數(shù)量，顯示運(yùn)輸?shù)秸枘静诵闹械腂oSVPmRNA 的read 占內(nèi)源BrSVPread 的不足1%(圖4)。BoSVP的mRNA 運(yùn)輸并不能明顯改變砧木菜心中SVP的表達(dá)量。SVP基因在甘藍(lán)/菜心嫁接體的菜心花序軸和菜心實(shí)生苗花序軸中的轉(zhuǎn)錄表達(dá)量沒有差異，說明BoSVPmRNA 的運(yùn)輸幾乎不影響砧木菜心中SVP的表達(dá)水平，推測(cè)BoSVPmRNA 的運(yùn)輸不會(huì)影響菜心中SVP在花序軸中的功能。砧木菜心中異源BoSVPmRNA read 全部來自于接穗甘藍(lán)，理論上將會(huì)導(dǎo)致莖尖中甘藍(lán)BoSVP的mRNA 含量減少。甘藍(lán)BoSVP是抑制開花基因，接穗甘藍(lán)中SVPmRNA 的持續(xù)減少，可能促進(jìn)甘藍(lán)提早開花。前期利用甘藍(lán)/菜心的異源嫁接促進(jìn)了接穗甘藍(lán)的提前開花[28－29]。在甘藍(lán)/菜心嫁接體中，發(fā)現(xiàn)砧木菜心的開花促進(jìn)基因AGL24 的mRNA 從砧木運(yùn)輸?shù)浇铀敫仕{(lán)中[13]。甘藍(lán)/菜心嫁接促進(jìn)接穗甘藍(lán)提早開花可能是大量開花促進(jìn)基因mRNA 向上運(yùn)輸和開花抑制基因mRNA 向下運(yùn)輸綜合導(dǎo)致的結(jié)果。一些研究認(rèn)為植物中一些基因的mRNA 可作為信號(hào)在穗砧中進(jìn)行長(zhǎng)距離運(yùn)輸并參與生長(zhǎng)發(fā)育調(diào)控[30－31]，SVP和AGL24 均為開花調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子基因，SVP和AGL24 運(yùn)輸?shù)膍RNA 有可能在甘藍(lán)/菜心嫁接體中發(fā)揮調(diào)控開花的作用。

4 結(jié)論

本研究結(jié)果表明，甘藍(lán)BoSVPmRNA 可從接穗甘藍(lán)運(yùn)輸?shù)秸枘静诵闹?，但不影響砧木菜心中SVP基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)量，同時(shí)證明其旁系同源基因SVPmRNA也可長(zhǎng)距離運(yùn)輸。由于未提出與BoSVPmRNA 運(yùn)輸直接相關(guān)的序列和結(jié)構(gòu)，后期應(yīng)將mRNA 運(yùn)輸屬性與基因序列和結(jié)構(gòu)進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析。本研究為植物基因mRNA 運(yùn)輸機(jī)制研究提供了基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。