微囊藻毒素-LR慢性暴露對水雍菜光合生理的影響

陳國元，廖騰芳，李青松

(廈門理工學院 環(huán)境科學與工程學院, 福建 廈門 361024)

近幾十年來，水體富營養(yǎng)化已成為全球主要的環(huán)境問題之一。但從資源的角度看，富營養(yǎng)化水體也是一種不可多得的農(nóng)業(yè)資源。如何在有效治理水體富營養(yǎng)化的同時，合理利用這些富營養(yǎng)化水體資源進行農(nóng)業(yè)生產(chǎn)，是迫切需要研究解決的問題。水生植物不僅可以吸收水中的氮和磷，抑制藻類生長[1-2]，還可以提高水體的自凈能力，種植水生植物可以作為富營養(yǎng)化水體修復的主要生物調(diào)控措施[3]。水生蔬菜是水生植物的重要組成部分，其可以通過采摘避免莖葉腐爛，從而有效降低水體中的營養(yǎng)鹽。已有研究證明，種植水生蔬菜不僅對富營養(yǎng)化水體中的氮、磷具有良好的去除效果[4]，同時部分水生蔬菜體內(nèi)含有的大量抑藻活性物質(zhì)，可以對有害藻類產(chǎn)生化感抑制[5-6]。另外，水生蔬菜作為食材具有很高的營養(yǎng)價值和可觀的經(jīng)濟價值。因此，在富營養(yǎng)化水體中種植水生蔬菜可以實現(xiàn)從單純的治理污水變?yōu)槔梦鬯?。但是水體富營養(yǎng)化過程中往往伴隨著藻類水華，其中以微囊藻水華發(fā)生頻率最高[7]。水華微囊藻中的優(yōu)勢種類通常具有產(chǎn)毒能力[8]，因此微囊藻毒素(MCs)在富營養(yǎng)化水體中最為常見[9]。目前，已經(jīng)鑒定出100多種MCs異構體[10]，其中LR型(MC-LR)是一種毒性較強，且廣泛分布于自然水體中的變體類型[11-12]。水體中存在的MC-LR可誘導植物形態(tài)、生理生化反應發(fā)生改變，具體表現(xiàn)為植株鮮質(zhì)量、葉片長度、葉面積、根系長度、根系活力、氮代謝及抗氧化系統(tǒng)等方面的變化[13-14]。目前，自然水體中檢測到的溶解態(tài)MC-LR質(zhì)量濃度大部分低于30 μg/L[9，11-12]。大量研究表明，MC-LR對植物的影響(促進、抑制或無顯著影響)與其暴露的質(zhì)量濃度、時間及植物種類密切相關[14-17]。因此，在富營養(yǎng)化水體中種植水生蔬菜，必需了解其在相應質(zhì)量濃度MCs慢性暴露情況下的生長及生理變化，才能確定其是否適合在含有MCs的富營養(yǎng)化水體中生長。光合作用是植物生長發(fā)育的基礎，也是植物生長發(fā)育的關鍵驅動力[18]。研究植物光合作用與環(huán)境因子的關系，有助于了解植物在外界脅迫下的生長機制。因此，研究環(huán)境相關質(zhì)量濃度MCs暴露條件下水生蔬菜的光合生理特性，可以揭示水生蔬菜在生理、形態(tài)及生物化學方面對MCs脅迫的響應，對于富營養(yǎng)化水體中水生蔬菜的種植具有重要指導意義。

水雍菜(Ipomoeaaquatica)為旋花科番薯屬一年或多年蔓生草本植物，其莖葉含有豐富的營養(yǎng)物質(zhì)，既可食用又有一定的藥用功效。水雍菜經(jīng)濟價值高，適應性強，栽培范圍廣泛。已有研究表明，水雍菜浮床具有很好的氮磷去除效果，并具有很好的水質(zhì)改善效果[19-20]。因此，水雍菜可以作為富營養(yǎng)化水體植物修復的候選水生蔬菜品種，但尚未見其在MC-LR暴露條件下光合生理響應的有關研究報道。為此，本試驗研究環(huán)境相關質(zhì)量濃度(0～30 μg/L)MC-LR暴露對水雍菜光合生理特性的影響，以期揭示MC-LR對水雍菜光合反應系統(tǒng)的影響機制，為富營養(yǎng)化水體中水雍菜的種植提供理論指導。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

水雍菜苗購至湖南佳禾特菜果蔬有限公司，分別選擇株高(約15 cm)一致、生長良好的水雍菜苗，自來水沖洗干凈后再用蒸餾水清洗，最后將其在山崎牌通用型無土栽培蔬菜營養(yǎng)液(上海芽芽綠化有限公司產(chǎn)品)中預培養(yǎng)1周，選取生長良好的植株用于后續(xù)試驗。MC-LR(Calbiochem，德國)，純度≥95%，購于上海恒遠生物科技有限公司。

1.2 試驗方法

培養(yǎng)液的配制：根據(jù)產(chǎn)品說明，先將山崎牌通用型無土栽培蔬菜營養(yǎng)液按照1∶300稀釋，然后分別添加MC-LR溶液，使MC-LR質(zhì)量濃度分別為0，1，10和30 μg/L。

試驗設計：將生長良好的水雍菜苗植入一系列內(nèi)裝200 mL含不同質(zhì)量濃度MC-LR培養(yǎng)液的250 mL廣口錐形瓶內(nèi)，錐形瓶底層鋪有厚度5 cm、粒徑4 mm的玻璃珠，加入對植物生長無顯著影響的微生物抑制劑C16H18NaN3O4S(MERCK)100 mg/L。以MC-LR質(zhì)量濃度為0 μg/L的培養(yǎng)組為對照組。每個錐形瓶內(nèi)植入1株水雍菜苗，對照組及每個處理組均設置3個平行試驗。試驗于MGC-450BPY-2智能型光照培養(yǎng)箱中進行，條件為：恒溫光照((25±1) ℃，3 000 lx)，12 L/12 D。為防止爛根，每天上午09：00和下午16：00各曝氣2 h，每3 d換1次培養(yǎng)液。培養(yǎng)30 d后原位測定葉片葉綠素SPAD值及葉綠素熒光參數(shù)，并采樣測定葉片中H2O2含量及1，5-二磷酸核酮糖羧化酶(Rubisco)、Rubisco活化酶(RCA)的活性。

1.3 測定方法

1.3.1 葉綠素SPAD值及葉綠素熒光參數(shù)的測定 選取水雍菜苗頂部完全展開的葉片，使用SPAD-502葉綠素儀(日本柯尼卡美能達公司)測定葉綠素SPAD值。葉綠素熒光參數(shù)使用Yaxin-1161G葉綠素熒光儀(北京雅欣理儀科技有限公司)測定。測量前將葉片用黑色不透明塑料袋包裹，暗適應處理20 min后采用脈沖瞬態(tài)熒光動力學模式測量，參數(shù)設置為：飽和脈沖強度3 000 μmol/(m2·s)，光化光強度1 000 μmol/(m2·s)，測量總時長100 s，遠紅光時長10 s，測量完畢直接在熒光儀上讀出光系統(tǒng)Ⅱ(PSⅡ)最大量子產(chǎn)量(Fv/Fm)、PSⅡ有效量子產(chǎn)量(ΦPSⅡ)、光化學淬滅系數(shù)(qP)和非光化學淬滅系數(shù)(qN)。

1.3.2 H2O2含量的測定 葉片經(jīng)去離子水洗滌3次后，用吸水紙吸干剪碎。稱取0.1 g葉片組織，加入2 mL 0.05 mol/L磷酸緩沖液(pH 7.0)，4 ℃下研磨成漿，過濾后6 000g離心25 min，得上清液[21]，然后采用植物過氧化氫(H2O2)酶聯(lián)免疫分析試劑盒(上海恒遠生物科技有限公司)，在SpectraMax M2多功能酶標儀(美國Molecular Devices公司)上測定H2O2含量，檢測范圍為40～1 600 μg/L。

1.3.3 Rubisco和RCA活性的測定 稱取0.2 g葉片組織，加入5 mL預冷到4 ℃的提取緩沖液 (100 mmol/L Tris-HCl(pH 7.8)，20 mmol/L KCl和1 mmol/L EDTA)，20 000g離心15 min，上清液即為粗酶液[22]，然后用植物Rubp羧化酶(Rubisco)酶聯(lián)免疫分析試劑盒(上海恒遠生物科技有限公司)測定Rubisco活性，檢測范圍為12～400 IU/L。

稱取0.2 g 葉片組織，加入 600 μL預冷到4 ℃的提取緩沖液(50 mmol/L Tricine緩沖液(pH 7.0)，100 mmol/L MgCl2,10 mmol/L NaHCO3,1 mmol/L EDTA,1 mmol/L ATP,10 mmol/L DTT,1 mmol/L PMSF,2 mmol/L Benzamide,0.01 mmol/L Leupeptin)，20 000g離心20 min，上清液即為粗酶液[23]，然后用植物Rubisco活化酶(RCA)酶聯(lián)免疫分析試劑盒(上海恒遠生物科技有限公司)測定RCA活性，檢測范圍為1～40 U/L。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與處理

運用SPSS 10.0軟件及Sigmaplot 10.0軟件對試驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析和作圖。首先利用ANOVA分析不同處理對水雍菜葉片光合系統(tǒng)各項指標的影響，然后采用最小顯著性差異法(LSD)比較不同處理的差異顯著性(P<0.05)。

2 結果與分析

2.1 低質(zhì)量濃度MC-LR慢性暴露對水雍菜葉片葉綠素SPAD值及H2O2含量的影響

由圖1可知，1 μg/L MC-LR處理組中水雍菜葉片的葉綠素SPAD值較對照組上升了2.21%，10 μg/L MC-LR處理組中葉片的葉綠素SPAD值較對照組降低了5.63%，但二者均與對照組差異不顯著(P>0.05)，而30 μg/L MC-LR處理組中葉片的葉綠素SPAD值較對照降低了16.55%，與對照存在顯著差異(P<0.05)。

圖柱上標不同小寫字母表示不同處理間差異顯著(P<0.05)。下同Different lowercase letters indicate significant difference among different treatments (P<0.05). The same below圖1 MC-LR慢性暴露條件下水雍菜葉片的葉綠素SPAD值及H2O2含量的變化Fig.1 Chlorophyll SPAD value and H2O2 content in leaves of Ipomoea aquatica after chronic exposure to MC-LR

由圖1還可知，1 μg/L MC-LR處理組中水雍菜葉片的H2O2含量較對照組上升了3.72%，但與對照組差異不顯著(P>0.05)；10 和30 μg/L MC-LR處理組中葉片的H2O2含量較對照組分別上升了17.13%和43.80%，且與對照組的差異均達到了顯著水平(P<0.05)。

2.2 低質(zhì)量濃度MC-LR慢性暴露對水雍菜葉片葉綠素熒光參數(shù)的影響

葉綠素熒光參數(shù)的變化與光合作用過程密切相關。由圖2可知，1和10 μg/L MC-LR處理組中水雍菜葉片的葉綠素光系統(tǒng)Ⅱ(PSⅡ)最大量子產(chǎn)量(Fv/Fm)值較對照組分別上升了2.61%和降低了5.22%，但與對照組差異均不顯著(P>0.05)，而30 μg/L MC-LR處理組中水雍菜葉片的Fv/Fm值較對照組降低了16.53%，差異達到了顯著水平(P<0.05)。PSⅡ有效量子產(chǎn)量(ΦPSⅡ)的變化趨勢與Fv/Fm類似，具體表現(xiàn)為，1和10 μg/L MC-LR處理組中水雍菜葉片的ΦPSⅡ值較對照組分別上升了2.05%和降低了7.13%，但與對照組差異均不顯著(P>0.05)，而30 μg/L MC-LR處理組中葉片的ΦPSⅡ值較對照組顯著降低了21.93%(P<0.05)。

圖2 MC-LR慢性暴露條件下水雍菜葉片F(xiàn)v/Fm和ΦPSⅡ的變化Fig.2 Fv/Fm and ΦPSⅡ in leaves of Ipomoea aquatica after chronic exposure to MC-LR

由圖3可知，1 μg/L MC-LR處理組中水雍菜葉片的qP值較對照組上升了3.15%，但與對照組差異不顯著(P>0.05)；10 和30 μg/L MC-LR處理組中葉片的qP值較對照組分別下降了12.04%和27.23%，且與對照組差異均達到了顯著水平(P<0.05)。

圖3 MC-LR慢性暴露條件下水雍菜葉片qP和qN的變化Fig.3 qP and qN in leaves of Ipomoea aquatica after chronic exposure to MC-LR

由圖3還可知，1 μg/L MC-LR處理組中水雍菜葉片的qN值較對照組上升了7.98%，但與對照組差異不顯著(P>0.05)；10和30 μg/L MC-LR處理組葉片的qN值較對照組分別上升了80.70%和29.56%，且二者與對照組差異均達到了顯著水平(P<0.05)；30 μg/L MC-LR處理組葉片的qN值較10 μg/L處理組下降28.30%，且二者之間存在顯著差異(P<0.05)。

2.3 低質(zhì)量濃度MC-LR慢性暴露對水雍菜葉片Rubisco和RCA活性的影響

由圖4可知，1 μg/L MC-LR處理組中水雍菜葉片的Rubisco活性較對照組上升了2.97%，但與對照組差異不顯著(P>0.05)，10和30 μg/L MC-LR處理組中水雍菜葉片的Rubisco活性較對照組均顯著降低(P<0.05)，降幅分別為17.62%和35.25%。1 μg/L MC-LR處理組中水雍菜葉片的RCA活性較對照組上升了3.88%，但與對照組差異并不顯著(P>0.05)，而10和30 μg/L MC-LR處理組中葉片的RCA活性分別較對照組顯著降低了14.35%和32.04%(P<0.05)。

圖4 MC-LR慢性暴露條件下水雍菜葉片Rubisco和RCA活性的變化Fig.4 Rubisco and RCA activities in leaves of Ipomoea aquatica after chronic exposure to MC-LR

3 討 論

3.1 低質(zhì)量濃度MC-LR慢性暴露對水雍菜葉片葉綠素含量的影響

植物葉綠素能夠捕獲光能并將其轉化為化學能，是植物光合作用的主要物質(zhì)基礎，其含量是衡量植物光合能力的關鍵參數(shù)，也是衡量植物對逆境脅迫適應性的一個重要指標[24-25]。葉片葉綠素SPAD值與葉綠素含量之間存在極顯著的正相關性，其可以表征葉片中葉綠素的相對含量[26-28]。本研究中，30 μg/L MC-LR處理組水雍菜葉片的葉綠素SPAD值顯著低于對照組(P<0.05)，說明30 μg/L MC-LR慢性暴露30 d后可以顯著降低水雍菜葉片的葉綠素含量。已有研究指出，植物體內(nèi)的葉綠素含量處于葉綠素合成與降解的動態(tài)平衡中[29]，而植物體內(nèi)葉綠素的合成是一個非常復雜的過程，容易受到外界不良環(huán)境條件的影響[30]。植物在受到外界環(huán)境脅迫時，其體內(nèi)會產(chǎn)生過量的活性氧(ROS)，從而促進葉綠素降解[31]。大量研究表明，一定水平的MC-LR暴露會誘導植物產(chǎn)生氧化應激反應，導致其體內(nèi)產(chǎn)生大量ROS[14，32]，H2O2即是植物體內(nèi)主要的ROS之一。本研究發(fā)現(xiàn)，30 μg/L MC-LR處理組水雍菜葉片的H2O2含量較對照組上升了43.80%，表明30 μg/L MC-LR慢性暴露引起了水雍菜嚴重的氧化應激反應，從而破壞了葉綠素合成與降解的動態(tài)平衡，葉綠素降解速率高于合成速率，導致葉片葉綠素含量顯著下降。

3.2 低質(zhì)量濃度MC-LR慢性暴露對水雍菜葉片光合熒光參數(shù)的影響

葉綠素光合熒光參數(shù)可以反映光合過程中光能的吸收和轉化、能量的傳遞與分配及光系統(tǒng)Ⅱ(PSⅡ)反應中心的活性情況等[33-34]。光合熒光參數(shù)對環(huán)境脅迫非常敏感，可以用其變化來評估植物的光合生理狀態(tài)[35]。在植物的光合熒光參數(shù)中，F(xiàn)v/Fm表示PSⅡ反應中心處于開放狀態(tài)時的最大光化學效率，可以用于評估PSⅡ的最大光能轉化效率。Fv/Fm值是研究外界環(huán)境因子對植物光合作用影響的重要指標，植物在受到外界脅迫時，F(xiàn)v/Fm變化幅度很大，因此很多學者以Fv/Fm來評估植物的光合活性[16，36]。本研究表明，MC-LR對水雍菜葉片F(xiàn)v/Fm的影響具有劑量效應，這與時玥等[37]、王余等[38]的研究結果一致。時玥等[37]研究表明，1和10 μg/L MC-LR暴露21 d對水稻葉片的Fv/Fm值無顯著影響，而500 μg/L MC-LR暴露會導致水稻葉片的Fv/Fm極顯著下降；王余等[38]研究表明，1 μg/L MC-LR暴露7 d對水稻葉片的Fv/Fm無顯著影響，而100 μg/L MC-LR暴露會導致水稻葉片的Fv/Fm顯著下降。但Machado等[16]的研究卻表明，微囊藻提取液(內(nèi)含10和50 μg/L MC-LR)作用14 d，野胡蘿卜(Daucuscarota)葉片的Fv/Fm顯著上升;作用28 d，10 μg/L MC-LR處理組葉片的Fv/Fm仍然顯著高于對照組，而50 μg/L MC-LR處理組葉片的Fv/Fm與對照組無顯著性差異。Corbel等[39]研究表明，藍藻提取液(內(nèi)含5～100 μg/L MC-LR)灌溉培養(yǎng)90 d后，番茄葉片的Fv/Fm未出現(xiàn)顯著變化。以上結果說明，MC-LR對植物的影響與暴露劑量、暴露時間及植物種類有關。有研究表明，當植物受到環(huán)境脅迫而PSⅡ反應中心受到損傷時，F(xiàn)v/Fm會顯著下降[40]，其值降低是植物受抑制的特征之一[41]。因此，30 μg/L MC-LR慢性脅迫對水雍菜葉片的PSⅡ反應中心造成了一定損傷，PSⅡ活性下降，導致其光能轉化效率降低，從而導致水雍菜的生長受到抑制。

ΦPSⅡ表示PSⅡ反應中心部分關閉情況下的實際光化學效率，可以評估PSⅡ天線系統(tǒng)吸收的能量用于光合作用的比例。PSⅡ反應中心的實際光化學效率是植物光合作用的關鍵限制因子，ΦPSⅡ值越高表明PSⅡ的光合效率越高[42]。本研究表明，30 μg/L MC-LR處理組水雍菜葉片的ΦPSⅡ顯著降低，表明30 μg/L MC-LR脅迫對水雍菜的實際光化學效率有顯著抑制作用，限制了水雍菜光合機構將所捕獲的光能以更高的速度和效率轉化為化學能，阻礙了為碳同化提供充足能量，從而限制了光合效率。

植物生長過程中，葉片葉綠素吸收的光能可以通過光合電子傳遞、葉綠素熒光發(fā)射和熱耗散3種途徑來消耗[24]。在光合熒光參數(shù)中，光化學淬滅系數(shù)qP反映了PSⅡ開放反應中心所占的比例，即將PSⅡ天線色素捕獲的光子能量用于光化學電子傳遞的份額；非光化學淬滅參數(shù)qN是指天線色素吸收的光能中不能用于電子傳遞而以熱的形式耗散掉的光能部分[43]。當積累在PSⅡ反應中心的光能過剩時，植物會通過提高qN及時耗散能量，熱耗散是植物保護PSⅡ而抵抗逆境的重要機制[44]。本研究表明，與對照相比，10 μg/L MC-LR處理組水雍菜葉片的qP值顯著下降，qN值顯著上升，說明在10 μg/L MC-LR脅迫下，水雍菜PSⅡ開放反應中心所占比例和參與CO2固定的電子數(shù)減少，葉片光合過程中的光化學淬滅受到一定程度的抑制，水雍菜PSⅡ將吸收過剩的能量通過熱耗散的形式進行釋放，以保護自身組織免受過剩光能的損害。30 μg/L MC-LR處理組水雍菜葉片的qP和qN值均顯著低于10 μg/L MC-LR處理組，說明在30 μg/L MC-LR脅迫下，水雍菜葉片光合機構損傷嚴重，葉片中參與光化學反應的能量顯著降低，同時其熱耗散能力減弱。

3.3 低質(zhì)量濃度MC-LR慢性暴露對水雍菜葉片光合酶活性的影響

Rubisco是光合作用的關鍵酶，其活性影響植物的光合能力，并決定植物的光合速率[45]。有研究表明，Rubisco蛋白占植物葉片中溶解性蛋白(SP)的30%以上，SP含量與Rubisco蛋白含量及其活性之間有密切關系[46]。MC-LR暴露對植物葉片氮循環(huán)及蛋白質(zhì)含量有顯著影響[13，32]。Jiang等[32]研究發(fā)現(xiàn)，1～10 μg/L MC-LR作用14 d后苦草葉片的SP含量下降。Chen等[13]研究發(fā)現(xiàn)，9.9～29.8 μg/L MC-LR作用30 d后，菖蒲幼苗葉片的氮代謝受到抑制，SP含量顯著降低，MC-LR質(zhì)量濃度越高，抑制程度越嚴重。大量研究表明，植物葉片中的葉綠素含量與蛋白質(zhì)含量呈顯著正相關[27-28]。因此30 μg/L MC-LR處理組水雍菜葉片葉綠素含量的顯著降低也表明了其蛋白含量有所下降，從而減弱了葉片的Rubisco活性。另外，Rubisco活性不僅受Rubisco蛋白含量的影響，而且與Rubisco活化狀態(tài)密切相關。而Rubisco活化狀態(tài)受到RCA活性的影響。RCA是一種葉綠體酶，通過碳同化反應參與Rubisco的分離和活化[47]。RCA通過構象變化去除Rubisco活性位點緊密結合的抑制劑，從而保持分子在光合作用期間的活性[48]。Scales等[49]研究表明，氧化還原狀態(tài)是影響RCA活性的因素之一。Kumar等[50]研究發(fā)現(xiàn)，小麥體內(nèi)的總抗氧化能力與葉片RCA活性呈顯著正相關。本研究中，10和30 μg/L MC-LR處理組水雍菜葉片的H2O2含量顯著上升，說明水雍菜處于一定程度的氧化脅迫中，RCA活性受到抑制，從而導致Rubisco活性下降。

綜上所述，在本試驗設置的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，MC-LR慢性暴露30 d后對水雍菜葉片光合生理特性的影響呈現(xiàn)出明顯的劑量效應。具體表現(xiàn)為，1 μg/L MC-LR對水雍菜葉片葉綠素熒光參數(shù)及Rubisco、RCA活性均無顯著影響；10 μg/L MC-LR對水雍菜產(chǎn)生了一定程度的氧化脅迫，H2O2含量升高，水雍菜通過提高熱耗散能力來保護其光合系統(tǒng)，但是Rubisco和RCA受到抑制，其活性顯著下降；30 μg/L MC-LR對水雍菜產(chǎn)生了嚴重的氧化脅迫，H2O2含量顯著上升，而葉片光合系統(tǒng)對光能的吸收和轉化、能量的傳遞與分配及PSⅡ反應中心的活性和光合酶活性都受到嚴重抑制。