基于RSAP標記的10個白楊派無性系指紋圖譜構(gòu)建及遺傳分析

程瑋哲，樊軍鋒，高建社，周永學

(西北農(nóng)林科技大學 林學院，陜西 楊凌712100)

楊樹為楊柳科(Salicaceae)楊屬(PopulusL.)落葉喬木，其分布范圍廣，生長迅速，具有較強的抗逆性。既是良好的用材和綠化造林樹種，又可作為林木遺傳研究的優(yōu)良材料[1-3]。楊樹作為雌雄異株植物(極少雌雄同株)，某些派間及種間可雜交，從而形成雜種[4]。同時育種研究中培育的優(yōu)良雜種、無性系，單從形態(tài)學上很難區(qū)分，這為后續(xù)良種鑒定及進一步遺傳研究帶來困難[5]。隨著現(xiàn)代分子生物學的發(fā)展，DNA分子標記技術(shù)在分析物種遺傳關(guān)系、鑒別品種、構(gòu)建遺傳圖譜等方面具有不可替代的作用[6]，這也極大地推進了楊樹遺傳改良研究及良種生產(chǎn)推廣產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。

限制性位點擴增多態(tài)性(restriction site amplified polymorphism，RSAP)技術(shù)，是杜曉華[7]開發(fā)的基于限制性酶切位點的分子標記技術(shù)。該技術(shù)利用生物基因組上廣泛分布的限制性酶切位點，無需限制性酶切及其他復(fù)雜步驟，僅一個簡單的PCR反應(yīng)即可實現(xiàn)對DNA限制性位點多態(tài)性的檢測，具有引物設(shè)計簡便、操作簡單、產(chǎn)物特異性強、結(jié)果穩(wěn)定、中等產(chǎn)率等特點，是RFLP和AFLP技術(shù)的簡化[8-9]。該分子標記技術(shù)目前已運用于紫菜[10]、辣椒[11]、石斛[12]、紅花檵木[13]等植物的研究中，但尚未見運用于楊樹的研究報道。呂志華等[14]以馬鈴薯為試驗材料，比較了3種分子標記RSAP、SSR和SRAP的分析效力，證明RSAP標記能較好地分析馬鈴薯的遺傳關(guān)系，3種標記均有各自的優(yōu)缺點，在研究植物遺傳多樣性時可綜合3種標記結(jié)果，能使分析更全面、客觀。王津果等[15]采用RSAP標記的15對引物組合分析龍須菜3個種群的遺傳多樣性，3個種群的14個個體共擴增出146個多態(tài)位點，平均每對引物擴增近10個多態(tài)位點，多態(tài)性比率為22%，種群間的遺傳差異大。中國農(nóng)業(yè)科學院的鄒自征[16]利用正交試驗對RSAP-PCR反應(yīng)體系進行了優(yōu)化，確定了反應(yīng)最佳體系及退火溫度，并分別采用3種分子標記RSAP、SRAP、SSR和田間性狀對16份苧麻種質(zhì)進行了親緣關(guān)系聚類，證明RSAP標記用于苧麻是可行的，并用55個RSAP標記、40個SSR標記和8個SRAP標記成功構(gòu)建了苧麻連鎖遺傳圖譜。

在運用RSAP分子標記進行植物遺傳關(guān)系等的研究中，前人大多以瓊脂糖電泳和聚丙烯酰胺電泳為檢測手段，位點讀取存在人為誤差，而高靈敏度、高精度的毛細管電泳檢測法可自動檢測位點信息，使試驗結(jié)果更加精準[17]。在楊屬植物遺傳研究中，試驗對象大多以種群或一定區(qū)域的楊屬植物為主[18-20]，極少見對優(yōu)良無性系或近緣種的相關(guān)研究。本試驗以白楊派10個優(yōu)良無性系為材料，運用RSAP分子標記結(jié)合高精度毛細管電泳檢測法，分析白楊派無性系間的遺傳多樣性及親緣關(guān)系，構(gòu)建10個無性系的指紋圖譜，以期證明RSAP在楊樹上的適用性，為楊樹種質(zhì)資源保護與品系鑒定提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗所用楊樹材料共10個，均采自西北農(nóng)林科技大學渭河試驗站種質(zhì)資源庫(表1)。包括秦白楊系列中的秦白楊1號、3號、5號無性系及其父母本84K、I-101，新疆楊以及4個白楊派無性系毛白楊30號、07-17-18、07-23-23、07-30-11。2020年5月于試驗站苗圃采集無病蟲害的健康新生嫩葉，每個楊樹材料分別采集4～5片，置于液氮中充分研磨后保存于-80 ℃冰箱。

表1 10個供試白楊派無性系及其遺傳背景Table 1 Ten clones of Sect. Leuce and their genetic background

1.2 DNA提取

稱取適量(0.1～0.2 g)供試楊樹嫩葉，采用改進的CTAB法[21]提取各無性系新生嫩葉基因組DNA。用超微量分光光度計(Nanodrop2000，美國)檢測DNA的濃度及純度，將檢測后的DNA稀釋至20 ng/μL，并于-20 ℃保存?zhèn)溆茫褂脮r取出保存于4 ℃。

1.3 引物篩選及RSAP-PCR反應(yīng)

9條RSAP引物的選擇參考張明科等[22]的研究，兩兩組成36對引物組合，由上海生工生物工程股份有限公司合成。首先用8%聚丙烯酰胺凝膠電泳對36對引物組合進行初篩，對擴增清晰、多態(tài)性高的引物組合重復(fù)電泳3次，最終選出6對擴增狀況較好且重復(fù)性強的引物組合(表2)。將6對RSAP引物對供試楊樹無性系的熒光PCR產(chǎn)物送至上海生工生物工程股份有限公司進行STR分型檢測。RSAP反應(yīng)總體系為20 μL：5 U/μLTaq酶 0.2 μL，10 μmol/L dNTP 1.5 μL，10×Taq buffer(MgCl2) 2.5 μL，10 μmol/L正、反引物各1 μL，20 ng/μL模板DNA 2 μL，ddH2O補足20 μL。反應(yīng)程序為：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性1 min，35 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，5個循環(huán)；94 ℃變性1 min，退火溫度(表2)下退火1 min，72 ℃延伸1 min，35個循環(huán)；72 ℃延伸10 min；4 ℃保存。

表2 篩選的RSAP引物序列Table 2 Sequences of selected RSAP primers

1.4 10個白楊派無性系擴增結(jié)果的多態(tài)性分析

利用Excel 2010將試驗數(shù)據(jù)統(tǒng)計為“0/1”格式(有帶記為“1”，無帶記為“0”)，并運用POPGENE 32軟件分析電泳結(jié)果，統(tǒng)計各引物組合對10個供試白楊派無性系擴增的位點總數(shù)、多態(tài)性位點數(shù)，計算多態(tài)性位點百分率、觀測等位基因數(shù)、有效等位基因數(shù)、Shannon信息指數(shù)及Nei’s基因多樣性指數(shù)等遺傳多樣性相關(guān)指標[23-24]。

1.5 10個白楊派無性系指紋圖譜的構(gòu)建

結(jié)合擴增結(jié)果中多態(tài)性和遺傳多樣性指標，選取多態(tài)性高且能區(qū)分所有無性系的引物對Rs2/Rs4和Rs2/Rs7，構(gòu)建10個白楊派無性系的DNA指紋圖譜。

1.6 10個白楊派無性系間的遺傳相似系數(shù)及聚類分析

利用NTSYS 2.1軟件Similarity程序組中的SimQual計算各無性系間的遺傳相似系數(shù)，構(gòu)建遺傳相似系數(shù)矩陣；基于UPGMA法進行聚類分析，構(gòu)建樹狀聚類圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 10個白楊派無性系的RSAP擴增結(jié)果

由表3可知，6對引物組合對10個白楊派無性系的擴增總位點數(shù)為143個，平均每個引物組合擴增23.83個，其中Rs2/Rs7引物組合擴增位點數(shù)最多，為30個；引物組合Rs1a/Rs6擴增位點數(shù)最少，為16個。多態(tài)性位點總數(shù)為133個，平均每個引物組合擴增22.17個，具有較高的多態(tài)性。平均多態(tài)性位點百分率為93.01%，引物組合Rs1a/Rs6和Rs5/Rs7的位點多態(tài)率為100%，引物組合Rs2/Rs3位點多態(tài)率最低。觀測等位基因數(shù)和有效等位基因數(shù)的平均值分別為1.930和1.559；Shannon信息指數(shù)為0.212～0.426，平均為0.326；Nei’s基因多樣性指數(shù)為0.348～0.611，平均為0.488。上述結(jié)果表明，10個白楊派無性系間遺傳變異性強，遺傳多樣性豐富。

表3 10個白楊派無性系的RSAP多態(tài)引物擴增結(jié)果Table 3 Amplification of 10 clones of Sect. Leuce by RSAP polymorphic primers

2.2 10個白楊派無性系的DNA數(shù)字化指紋圖譜

綜合分析6對引物組合擴增位點的多態(tài)性，選取2個引物組合的6個多態(tài)性位點,即可將10個白楊派無性系有效鑒別?；?個多態(tài)性引物組合構(gòu)建的10個白楊派無性系指紋圖譜見表4。由表4可知，引物組合Rs2/Rs4可對秦白楊1號、秦白楊3號、秦白楊5號、84K、新疆楊、07-23-23進行單獨鑒別，結(jié)合引物組合Rs2/Rs7可對其余無性系I-101、毛白楊30號、07-17-18、07-30-11進行鑒別。

表4 基于2個多態(tài)性引物組合的10個白楊派無性系的指紋圖譜Table 4 Fingerprinting of 10 clones of Sect. Leuce based on 2 polymorphic primer combinations

2.3 10個白楊派無性系的遺傳相似系數(shù)與聚類結(jié)果

基于RSAP分子標記的10個白楊派無性系的遺傳相似系數(shù)矩陣見表5。由表5可以看出，10個白楊派無性系間的遺傳相似系數(shù)為0.400～0.817，平均遺傳相似系數(shù)為0.594，變幅為0.417，表明無性系間具有遺傳多樣性，遺傳變異豐富。秦白楊系列的秦白楊1號、3號和5號遺傳關(guān)系較近，遺傳相似系數(shù)為0.764～0.817，平均遺傳相似系數(shù)為0.794；07系列的07-17-18、07-23-23和07-30-11的遺傳相似系數(shù)為0.695～0.765，平均遺傳相似系數(shù)為0.732。84K、I-101與秦白楊系列的平均遺傳相似系數(shù)分別為0.624和0.585，I-101與07系列的平均遺傳相似系數(shù)為0.699，表明父母本與子代的親緣關(guān)系相近。新疆楊、毛白楊30號無性系與其余無性系遺傳背景差異相對較大，因此遺傳相似系數(shù)也偏低。

表5 10個白楊派無性系間的遺傳相似系數(shù)Table 5 Genetic similarity coefficient among 10 clones of Sect. Leuce

由圖1可見，依據(jù)遺傳相似系數(shù)構(gòu)建的樹狀聚類圖與實際生物學分類大致相符。在遺傳相似系數(shù)0.510處，10個白楊派無性系被分為兩大類，第一大類為秦白楊系列、84K、I-101及07系列，第二大類為新疆楊和毛白楊30號。第一大類中秦白楊系列與其父本84K聚為一類，07系列與其母本I-101聚為一類，表明秦白楊系列與其父本84K親緣關(guān)系較近。秦白楊1號、秦白楊3號和秦白楊5號聚在一起，07-17-18、07-30-11和07-23-23聚在一起，表明秦白楊系列與07系列分別具有相似的遺傳背景，遺傳差異較小。

圖1 基于遺傳相似系數(shù)的10個白楊派無性系的樹狀聚類結(jié)果Fig.1 Dendrogram clustering of 10 clones of Sect. Leuce based on genetic similarity coefficient

3 結(jié)論與討論

袁佳秋等[25]利用EST-SSR分子標記技術(shù)對12個黑楊無性系進行了遺傳結(jié)構(gòu)和親緣關(guān)系分析，從30對引物中篩選出18對多態(tài)性引物，多態(tài)性比率為70.5%，無性系間的遺傳相似系數(shù)為0.602～0.904，遺傳距離較近。樊蓉等[26]對9個白楊品種進行SRAP分析，篩選的14對多態(tài)性引物能較好地反映白楊品種遺傳多樣性水平，且多態(tài)性比率為85.63%，白楊品種間的遺傳相似系數(shù)為0.400～0.760。藕丹[24]以美洲黑楊青楊派雜種無性系為材料，建立了穩(wěn)定高效的SCoT-PCR反應(yīng)體系，并運用SCoT標記分析無性系間的遺傳關(guān)系，平均每個引物擴增9.07條多態(tài)性條帶，多態(tài)性比率為74.8%。本試驗將RSAP分子標記應(yīng)用于楊樹資源，且運用高效、靈敏的毛細管電泳檢測擴增產(chǎn)物，平均多態(tài)性位點百分率為93.01%，遺傳相似系數(shù)變幅為0.417，相較于前人研究的其他分子標記[25-27]，兼具較高的引物多態(tài)性和遺傳多樣性。

遺傳相似系數(shù)是評價親緣關(guān)系的常用指標，無性系間的遺傳相似系數(shù)在一定程度上反應(yīng)其親緣關(guān)系的遠近[28-30]。本試驗遺傳相似系數(shù)表明10個無性系間具有一定的遺傳差異，毛白楊30號、新疆楊與秦白楊系列和07系列具有相對較大的遺傳背景差異，秦白楊系列無性系中秦白楊1號、3號和5號遺傳相似性大，07系列中的07-17-18、07-23-23和07-30-11無性系間遺傳相似系數(shù)高，遺傳差異小。聚類分析結(jié)果顯示，84K較母本I-101優(yōu)先與秦白楊系列聚類，而07系列與其母本I-101聚類，這與張海燕等[31]研究結(jié)果存在差異，因此推測在基因基礎(chǔ)上秦白楊系列與84K親緣關(guān)系較近，在實際生長中則可能受環(huán)境、表型性狀基因調(diào)控等因素影響，秦白楊系列的表型遺傳了母本I-101的優(yōu)良干形特征。秦白楊系列的3個無性系聚為一類，07系列的3個無性系聚為一類，說明其遺傳基礎(chǔ)相近或相同，這與實際親緣關(guān)系相符。

本試驗通過基于限制性位點的RSAP分子標記，分析了10個白楊派無性系的遺傳多樣性水平，并采用2個引物組合的6個多態(tài)位點構(gòu)建了指紋圖譜，為楊樹新品種保護與選育奠定了基礎(chǔ)。從本試驗針對楊樹開展的RSAP分子標記的運用結(jié)果來看，RSAP擴增位點數(shù)量多且擴增位點多態(tài)性比率高，能用較少的引物對無性系(品種)進行鑒別，具有一定可行性，可應(yīng)用于楊樹分子生物學研究。