Wnt通路中亮氨酸重復序列G蛋白偶聯(lián)受體5/6在兒童急性淋巴細胞白血病中的表達及意義

李 宣，王文鵬，周 敏，徐曉蕊，高吉照

徐州醫(yī)科大學附屬醫(yī)院兒科，江蘇徐州 221002

急性淋巴細胞白血病(acute lymphoblastic leukemia，ALL)是一種惡性血液系統(tǒng)疾病，起源于B或T淋巴細胞在骨髓內的異常增殖，其發(fā)病機制暫不明確。ALL是兒童期最常見的腫瘤性疾病，其中以B-ALL最常見，約占兒童ALL的80%[1]。隨著化療方案的不斷改進，ALL患兒的5年無病生存率可達80%[2]，但仍有一部分患兒出現(xiàn)耐藥和復發(fā)，甚至死亡。Wnt/β-連環(huán)蛋白信號通路的異常激活與ALL的發(fā)病關系密切，富含亮氨酸重復序列G蛋白受體(leucine-rich repeat-containing G-protein coupled receptor，LGR)5/6是Wnt/β-連環(huán)蛋白信號通路中的重要因子，參與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展。本研究通過檢測ALL患兒骨髓細胞中LGR5和LGR6 mRNA及蛋白的表達，探討其在兒童ALL中的表達及意義。

對象和方法

對象選取2017年1月至2020年2月于徐州醫(yī)科大學附屬醫(yī)院就診的新發(fā)ALL和免疫性血小板減少癥(immue thrombocytopenia，ITP)患兒為研究對象。ALL患兒入組標準：新發(fā)ALL患兒經(jīng)誘導化療第33天骨髓達完全緩解者。排除標準：(1)誘導緩解治療期間放棄治療、轉外、死亡者；(2)經(jīng)誘導化療第33天骨髓未緩解者；(3)伴髓系標記者；(4)有其他惡性疾病者；(5)確診前使用激素及其他免疫抑制劑者；(6)不同意入組者。納入研究的ALL患兒39例，其中男22例、女17例，年齡1.4～12歲，平均年齡(6.2±3.6)歲。以治療前作為初發(fā)組，經(jīng)誘導化療第33天骨髓達完全緩解時為緩解組；根據(jù)危險度分層再分為低危組(n=16)、中危組(n=9)和高危組(n=14)，ALL分層標準為與兒童ALL危險度相關的因素：包括(1)診斷時年齡<1歲或≥10歲；(2)診斷時外周血白細胞計數(shù)>50×109/L；(3)診斷時已發(fā)生中樞神經(jīng)系統(tǒng)白血病(central nervous system leukemia，CNSL)或睪丸白血病(testicular leukemia，TL)；(4)免疫表型為T系ALL；(5)細胞及分子遺傳學特征：染色體數(shù)目<45的低二倍體、t(9；22)(q34；q11.2)/BCR-ABL1、t(4；11)(q21；q23)/MLL-AF4或其他MLL基因重排、t(1；19)(q23；p13)/E2A-PBX1；(6)潑尼松反應不良；(7)誘導緩解治療第15天骨髓原始及幼稚淋巴細胞≥25%；(8)微小殘留病灶(minimal residual disease，MRD)水平：誘導緩解治療結束(化療第33天)MRD≥1×10-4(本研究骨髓符合完全緩解標準)，或鞏固治療開始前(第12周)MRD≥1×10-3。在上述危險因素的基礎上將兒童ALL的臨床危險度分為3型：低危組：不具備上述任何一項危險因素者。中危組：具備以下任何1項或多項者：(1)診斷時年齡≥10歲或<1歲；(2)診斷時外周血白細胞計數(shù)≥50×109/L；(3)診斷時已發(fā)生CNSL和/或TL；(4)免疫表型為T系ALL；(5)t(1；19)(q23；p13)/E2A-PBX1陽性；(6)初診危險度為低危，在誘導緩解治療第15天骨髓原始及幼稚淋巴細胞≥25%；(7)誘導緩解治療末(第33天)MRD≥l×10-4，且<1×10-2。高危組：具備以下任何1項或多項者：(1)t(9；22)(q34；q11．2)/BCR-ABL1陽性；(2)t(4；11)(q21；q23)/MLL-AF4或其他MLL基因重排陽性；(3)潑尼松反應不良；(4)初診危險度為中危經(jīng)誘導緩解治療第15天骨髓原始及幼稚淋巴細胞≥25%；(5)誘導緩解治療結束(化療第33天)MRD>1×10-2(本研究骨髓符合完全緩解標準)，或鞏固治療開始前(第12周)MRD≥1×10-3[3]。ITP患兒30例納入對照組，其中男20例、女10例，年齡0.3～12歲，平均年齡(4.6±3.5)歲。各組年齡和性別構成比差異無統(tǒng)計學意義。ALL患兒的診斷、危險度分層和誘導化療方案依據(jù)《兒童急性淋巴細胞白血病診療建議(第4次修訂)》[3]，ITP患兒的診斷依據(jù)《兒童原發(fā)性免疫性血小板減少癥診療建議》[4]。本研究獲得本院倫理委員會批準(XZFY2020-KL153- 01)。

主要試劑與儀器淋巴細胞分離液(MP Biomedicals公司，美國)、TRIzol(Invitrogen 公司，美國)、cDNA第一鏈合成試劑盒(Thermo Fisher公司，美國)、全蛋白抽提試劑盒(中國江蘇凱基生物技術股份有限公司)、BCA蛋白含量檢測試劑盒(中國江蘇凱基生物技術股份有限公司)、兔抗-GAPDH(中國江蘇凱基生物技術股份有限公司)、兔抗-LGR5(Abcamplc公司，英國)、兔抗-LGR6(Abcam公司，英國)，普通梯度PCR儀(美國ABI Veriti 96 well Thermal cycler)、Western blot檢測試劑盒(中國江蘇凱基生物技術股份有限公司)、熒光定量PCR循環(huán)儀(ABI Step one plus Real time-PCR system，美國)、多功能酶標儀(MD Spectramac M3，美國)；引物由中國凱基生物技術股份有限公司設計合成。

標本制備分別取初發(fā)組、緩解組及對照組骨髓血3 ml，乙二胺四乙酸抗凝，密度梯度離心法分離單個核細胞，磷酸鹽平衡生理鹽水(phosphate buffer saline，PBS)液洗滌3次，將單個核細胞和血漿分別移至不同EP管，-80 ℃凍存。

逆轉錄聚合酶鏈反應逆轉錄聚合酶鏈反應法檢測骨髓細胞中LGR5和LGR6 mRNA表達水平。依據(jù)TRIzol說明書提取總RNA。取5 μl RNA至495 μl 1×TE緩沖液中，測定其在260 nm和 280 nm處吸光光密度(optical density，OD)值；OD260/OD280在1.8～2.1，提取的RNA的純度很高，符合實驗要求。依據(jù)cDNA第一鏈合成試劑盒說明書進行逆轉錄合成cDNA。LGR5上游引物：5’-CATCAGCTATGTGCCCCCAA- 3’，下游引物：5’-AAAGCCTGGACGGGGATTTC- 3’，片段長度99 bp；LGR6上游引物：5’-ACCCCCTGACGGCTTACCT- 3’，下游引物：5’-GCTTGTCCTGGGATGTGTGAG- 3’，片段長度133 bp；GAPDH上游引物：5’-CAAATTCCATGGCACCGTCA- 3’，下游引物：5’-AGCATCGCCCCACTTGATTT- 3’，片段長度109 bp。擴增：往0.1 ml PCR管中依次加入如下組份：2×熒光探針10 μl、模板(cDNA稀釋10倍)1 μl、引物混合(上游/下游各為10 μmol/L)2 μl、0.1% 超純水7 μl。反應條件：95 ℃預變性5 min；95 ℃變性15 s，60 ℃退火20 s，72 ℃延伸40 s，共40個循環(huán)；95 ℃變性15 s，驟冷至60 ℃，制作溶解曲線。

蛋白質印跡蛋白質印跡法檢測骨髓單個核細胞中LGR5、LGR6蛋白表達水平。蛋白提?。篜BS洗滌細胞2次；加入胰蛋白酶消化液，37 ℃消化后移至離心管中離心，再加入PBS離心洗滌2次；根據(jù)細胞數(shù)量加入裂解緩沖液(每1 ml冷裂解緩沖液加入10 μl磷酸酶抑制劑、1 μl蛋白酶抑制劑和5 μl 100 mol/L 苯甲基磺酰氟)，置于4 ℃搖床平臺上，振蕩15 min，離心15 min，取上清，分裝保存于-70 ℃。蛋白定量：稀釋待測樣品總體積為20 μl，加入聚氰基丙烯酸正丁酯工作液200 μl，混勻后37 ℃放置30 min，在562 nm波長下比色，記錄吸光值，通過標準曲線和樣品的體積計算樣品的蛋白濃度。聚丙烯酰胺凝膠電泳與轉膜：吸取樣品加入樣品孔中，樣品旁孔加入蛋白Marker；選擇合適的電壓水平，待目的條帶進入凝膠最佳分離區(qū)(大約凝膠的2/3)時，停止電泳；切下目的條帶轉膜；轉膜結束后，取出硝酸纖維素膜做好標記，用等滲緩沖鹽溶液洗膜 5 min×3次。免疫印跡：將硝酸纖維素膜放入平皿中封閉；封閉結束后，用等滲緩沖鹽溶液洗膜5 min×3次；將膜放入含一抗的平皿中，4 ℃搖床振蕩孵育過夜；第2天取出，室溫振蕩30 min，吸棄一抗，TBST洗膜10 min×3次；加入稀釋的二抗，室溫搖床振蕩反應2 h；結束后，回收二抗，TBST洗膜5 min×3次。取出硝酸纖維素膜，滴加工作液(EcL化學發(fā)光試劑盒中的A、B兩種液體按1∶1等體積混合)，用保鮮膜覆蓋。使用G：BOX chemiXR5成像，使用Gel-Pro32軟件對結果進行灰度分析。

統(tǒng)計學處理采用SPSS 24.0 統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學分析。計量資料采用Kolmogorov-Smirnov檢驗判斷正態(tài)性，正態(tài)分布的計量資料以均數(shù)±標準差表示，初發(fā)組、緩解組與對照組比較采用獨立樣本t檢驗，初發(fā)組與緩解組比較采用配對t檢驗。多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析，多組間兩兩比較方差齊時采用LSD法并作Bonferroni校正，方差不齊時采用Dunnett’ T3法[5]。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

LGR5和LGR6的mRNA表達初發(fā)組LGR5 mRNA的相對表達低于緩解組(t=-12.921，P=0.000)和對照組(t=-7.954，P=0.000)，差異有統(tǒng)計學意義；緩解組和對照組之間LGR5 mRNA的相對表達差異無統(tǒng)計學意義(t=-1.396，P=0.167)(表1)。初發(fā)組低危、中危、高危組LGR5 mRNA的相對表達不同，差異有統(tǒng)計學意義(F=5.057，P=0.012)，其中低?；純篖GR5 mRNA的相對表達高于中危(P=0.038)和高危(P=0.030)患兒，差異有統(tǒng)計學意義；中危和高?；純篖GR5 mRNA的相對表達差異無統(tǒng)計學意義(P=1.000)；緩解組低危、中危、高危組LGR5 mRNA的相對表達不同，差異有統(tǒng)計學意義(F=5.034，P=0.012)，其中低?；純篖GR5 mRNA的相對表達高于中危(P=0.039)和高危(P=0.030)患兒，差異有統(tǒng)計學意義；中危和高?；純篖GR5 mRNA的相對表達差異無統(tǒng)計學意義(P=1.000)(表2)。

初發(fā)組LGR6 mRNA的相對表達高于緩解組(t=12.532，P=0.000)和對照組(t=7.658，P=0.000)，差異有統(tǒng)計學意義；緩解組和對照組之間的LGR6 mRNA的相對表達差異無統(tǒng)計學意義(t=-0.450，P=0.654)(表1)。初發(fā)組低危、中危、高危組LGR6 mRNA的相對表達不同，差異有統(tǒng)計學意義(F=4.688，P=0.016)，其中低危患兒LGR6 mRNA的相對表達低于中危(P=0.045)和高危(P=0.042)患兒，差異有統(tǒng)計學意義，中危和高?；純篖GR6 mRNA的相對表達差異無統(tǒng)計學意義(P=1.000)；緩解組低危、中危、高危組LGR6 mRNA的相對表達不同，差異有統(tǒng)計學意義(F=5.628，P=0.007)，其中低?；純篖GR6 mRNA的相對表達低于中危(P=0.026)和高危(P=0.021)患兒，差異有統(tǒng)計學意義，中危和高?；純篖GR6 mRNA的相對表達差異無統(tǒng)計學意義(P=1.000)(表2)。

LGR5和LGR6的蛋白表達初發(fā)組LGR5 蛋白的相對表達低于緩解組(t=-6.864，P=0.000)和對照組(t=-6.404，P=0.000)，差異有統(tǒng)計學意義；緩解組和對照組LGR5蛋白的相對表達差異無統(tǒng)計學意義(t=-0.884，P=0.380)(表1、圖1)。初發(fā)組低危、中危、高危組LGR5蛋白的相對表達不同，差異有統(tǒng)計學意義(F=4.632，P=0.016)，其中低?；純篖GR5蛋白的相對表達高于中危(P=0.045)和高危(P=0.045)患兒，差異有統(tǒng)計學意義；中危和高?；純褐gLGR5蛋白的相對表達水平差異無統(tǒng)計學意義(P=1.000)；緩解組低危、中危、高危組LGR5蛋白的相對表達不同，差異有統(tǒng)計學意義(F=45.969，P=0.006)，其中低危患兒LGR5 蛋白的相對表達高于中危(P=0.034)和高危(P=0.011)患兒，差異有統(tǒng)計學意義；中危和高?；純褐gLGR5蛋白的相對表達水平差異無統(tǒng)計學意義(P=1.000)(表3、圖1)。

初發(fā)組LGR6蛋白的相對表達高于緩解組(t=23.508，P=0.000)和對照組(t=13.075，P=0.000)，差異有統(tǒng)計學意義；緩解組和對照組LGR6蛋白的相對表達差異無統(tǒng)計學意義(t=1.845，P=0.069)(表1)。初發(fā)組低危、中危、高危組LGR6蛋白的相對表達不同，差異有統(tǒng)計學意義(F=6.368，P=0.004)，其中低?；純篖GR6蛋白的相對表達低于中危(P=0.020)和高危(P=0.011)患兒，差異有統(tǒng)計學意義；中危和高?；純篖GR6蛋白的相對表達水平差異無統(tǒng)計學意義(P=1.000)；緩解組低危、中危、高危組LGR6蛋白的相對表達不同，差異有統(tǒng)計學意義(F=5.750，P=0.007)，其中低?；純篖GR6蛋白的相對表達低于中危(P=0.023)和高危(P=0.020)患兒，差異有統(tǒng)計學意義；中危和高?；純篖GR6蛋白的相對表達水平差異無統(tǒng)計學意義(P=1.000)(表3、圖2)。

表1 各組LGR5和LGR6 mRNA和蛋白的相對表達

表2 各危險度分組中LGR5和LGR6 mRNA的相對表達

表3 各危險度分組中LGR5和LGR6蛋白的相對表達

Mr：相對分子質量；1：緩解組；2：中危初發(fā)組；3：低危初發(fā)組；4：高危初發(fā)組；5：對照組

1：緩解組；2：中危初發(fā)組；3：低危初發(fā)組；4：高危初發(fā)組；5：對照組

討 論

Wnt信號通路在進化過程中高度保守，在調節(jié)細胞增殖、遷移、凋亡和分化及調控正常組織重建等生命活動中發(fā)揮重要的作用，Wnt信號通路有多條途徑，其中研究最為廣泛的是經(jīng)典Wnt信號通路，亦稱為Wnt/β-連環(huán)蛋白通路[6]。當細胞外存在Wnt信號時，Wnt配體蛋白與受體結合，并募集散亂蛋白與細胞膜上的卷曲蛋白受體(frizzled，F(xiàn)z)結合，使糖原合成激酶- 3β-支架蛋白-大腸腺瘤息肉蛋白-酪蛋白激酶1降解復合體無法降解胞質內的β-連環(huán)蛋白，使β-連環(huán)蛋白在胞內累積并進入細胞核，與核內T細胞因子/淋巴樣增強因子結合，從而調控下游靶基因的轉錄。有研究顯示，在ALL患兒中β-連環(huán)蛋白表達水平明顯高于非惡性血液病患兒[7]，因此，Wnt/β-連環(huán)蛋白信號通路的異常激活與兒童ALL的發(fā)病關系密切。

LGR是一種7次跨膜受體，分為A、B、C 3個亞型，其中參與Wnt/β-連環(huán)蛋白信號通路的B型受體家族只有3種密切相關的受體即LGR4、LGR5、LGR6[8]，B型受體在多種腫瘤的發(fā)病中具有重要作用，尤其是LGR5和LGR6被認為是癌癥干細胞的標志物。LGR5和LGR6是特異性頂部盤狀底板反應蛋白(R-spondins，RSPOs)的特異性配體，RSPOs通過LGR與鋅環(huán)指3(zinc and ring finger 3，ZNRF3)和環(huán)指蛋白43(ring finger protein 43，RNF43)結合，抑制ZNRF3/RNF43的泛素連接酶活性，使FZ受體在質膜上積聚，從而促進Wnt/β-連環(huán)蛋白信號通路的激活[9- 10]。有研究顯示Fz4在ALL患兒中表達增高，可能通過激活Wnt/β-連環(huán)蛋白信號通路，參與兒童ALL的發(fā)病[5]。因此，LGR5、LGR6作為具有特定配體的Wnt/β-連環(huán)蛋白信號通路中的相關受體，可能成為獨特的治療靶標。

雖然LGR5與LGR6在序列上有50%的同源性[11]，但是LGR5和LGR6在不同腫瘤中發(fā)揮不同作用。有研究表明LGR5的高表達對膠質瘤細胞的克隆和致瘤能力非常重要[12]。另外，在腦膠質瘤細胞中，LGR5可以通過抑制β-連環(huán)蛋白的磷酸化激活Wnt/β-連環(huán)蛋白通路，使LGR5陽性的細胞具有更高的侵襲性和轉移性[13]。因此，在腦膠質瘤中LGR5發(fā)揮促癌作用。但是，Cosgun等[14- 16]通過小鼠實驗發(fā)現(xiàn)，當LGR5在B-ALL細胞中缺失時，核內β-連環(huán)蛋白大量積累并且其下游靶基因的表達也增加，表明在B細胞環(huán)境中LGR5是Wnt/β-連環(huán)蛋白信號通路的重要負調控因子。但LGR5發(fā)揮負向調控作用的機制暫不清楚，可能通過減少Wnt/FZ復合物對脂蛋白受體5/6的進入引起，但也可能是RSPOs通過LGR5與ZNRF3/RNF43結合觸發(fā)更多的間接作用，其具體機制有待進一步研究。本研究顯示，初發(fā)組LGR5 mRNA和蛋白的相對表達均低于緩解組和對照組；在兒童ALL中，低?；純篖GR5 mRNA和蛋白的相對表達均高于中危和高?；純骸Ｒ虼?，本研究認為在兒童ALL中，LGR5在Wnt/β-連環(huán)蛋白信號通路中發(fā)揮負向調控作用，LGR5的低表達使Wnt/β-連環(huán)蛋白信號通路異常激活，從而參與兒童ALL的發(fā)病，并且其表達變化與兒童ALL的危險度分層和治療效果關系密切。

有研究指出，LGR6在卵巢癌及食管癌中表達水平增高，認為LGR6高表達導致Wnt/β-連環(huán)蛋白信號通路異常激活，促進腫瘤的發(fā)生發(fā)展進程[17- 18]。本研究顯示，初發(fā)組LGR6 mRNA和蛋白的相對表達均高于緩解組和對照組，在兒童ALL中，低?；純篖GR5 mRNA和蛋白的相對表達均高于中危和高?；純?。并且，另有研究顯示，F(xiàn)Z4在初發(fā)組表達均明顯高于緩解組和對照組，在低?；純褐斜磉_均低于中危和高?；純篬11]。因此，在兒童ALL中LGR6通過與RSPOs和ZNRF3/RNF43結合，使FZ受體在膜上積聚，從而在Wnt/β-連環(huán)蛋白信號通路中發(fā)揮正向調控作用，參與兒童ALL的發(fā)病。但也有研究認為LGR6為腫瘤抑制因子[19- 20]。LGR5和LGR6在腫瘤中發(fā)揮正向調控作用，是因為其與RSPOs配體和ZNRF3/RNF43結合，使FZ在胞膜上累積，導致Wnt/β-連環(huán)蛋白信號通路異常激活。但其在腫瘤中發(fā)揮抑癌作用的機制暫不明確?？傊?，LGR5和LGR6在腫瘤發(fā)生過程中的作用可能是其生物學功能整合的結果，可能與細胞環(huán)境、RSPOs家族成員的表達方式及相互作用有關，其在不同類型的腫瘤進展過程中可能發(fā)揮復雜甚至相反的作用。

綜上，本研究表明在兒童ALL中，LGR5在Wnt/β-連環(huán)蛋白信號通路中發(fā)揮負向調控作用，LGR6在Wnt/β-連環(huán)蛋白信號通路中發(fā)揮正向調控作用，LGR5低表達和LGR6高表達，使Wnt/β-連環(huán)蛋白信號通路異常激活，參與兒童ALL的發(fā)病。LGR5和LGR6表達水平的變化可能與兒童ALL危險度分層和治療效果關系密切。并且已有研究通過小鼠實驗發(fā)現(xiàn)，LGR5-單甲基阿司他丁單藥治療可顯著降低B-ALL的負擔，地塞米松處理不僅增強LGR5在細胞表面的持續(xù)表達，而且增強LGR5-單甲基阿司他丁的療效，并且認為LGR5是根除白血病起始細胞的一個很有前途的靶點[15- 16]。因此，檢測LGR5和LGR6表達水平的變化對判斷兒童ALL的發(fā)病、危險分層及治療效果有一定意義，LGR5和LGR6有望成為治療兒童ALL的靶點，可能為兒童ALL的治療提供新的方法。