芪仙通絡方及其拆方對腦梗死大鼠神經(jīng)功能及神經(jīng)營養(yǎng)因子表達的影響*

周勝強 李 博 王 琦 周春吉 劉 芳 鄧奕輝

（1.湖南省中醫(yī)藥研究院，湖南 長沙 410006；2.湖南中醫(yī)藥大學，湖南 長沙 410208；3.湖南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院，湖南 長沙 410007；4.南華大學第一附屬醫(yī)院，湖南 衡陽421001）

腦梗死急性期時間窗內(nèi)靜脈溶栓、機械取栓是目前西醫(yī)治療本病的有效方法，但此方法存在治療時間窗窄、出血風險高等缺點，臨床獲益者不到5%［1］。對于遺留肢體癱瘓、麻木等神經(jīng)功能障礙的患者，仍然缺乏安全、高效的治療措施，是目前醫(yī)學界亟待解決的難點［2］。而傳統(tǒng)中醫(yī)藥對于本病的防治積累了豐富的經(jīng)驗，具有獨特的優(yōu)勢，有望為本病的干預開辟新的途徑［3］。芪仙通絡方系國醫(yī)大師劉祖貽教授根據(jù)其“氣陽主用”腦病創(chuàng)新理論研制成的中風病效驗方［4］，主要針對中風病腎虛血瘀證，在補腎填精、活血通絡的基礎(chǔ)上加以溫補腎中陽氣，經(jīng)多年臨床實踐證實有效性和安全性確切［5-6］。本研究旨在通過動物實驗，比較芪仙通絡方及其拆方對腦梗死大鼠神經(jīng)功能、梗死周邊區(qū)域缺血損傷神經(jīng)元及神經(jīng)纖維病理形態(tài)以及神經(jīng)營養(yǎng)因子表達影響的差異，探討芪仙通絡方組方配伍的意義，以期佐證“氣陽主用”創(chuàng)新理論的臨床指導價值。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 健康雄性SPF級SD大鼠，體質(zhì)量（240±30）g，購自湖南斯萊克景達實驗動物有限公司，許可證號：SCXK（湘）2016-0002。飼養(yǎng)于湖南省中醫(yī)藥研究院SPF級實驗動物中心。飼養(yǎng)環(huán)境溫度（24±0.5）℃，相對濕度50%，自由飲食進水，晝夜光照節(jié)律。適應性喂養(yǎng)1周后用于實驗。

1.2 藥物與試劑 芪仙通絡方：黃芪30 g，淫羊藿15 g，枸杞子30 g，制首烏 15 g，丹參30 g，葛根 30 g，水蛭9 g，山楂15 g組成。補腎活血拆方：枸杞子30 g，制首烏15 g，丹參30 g，葛根 30 g，水蛭9 g，山楂15 g組成。益氣溫陽拆方：黃芪30 g，淫羊藿15 g。中藥飲片均購自湖南省中醫(yī)藥研究院附屬醫(yī)院，由藥劑科田其學主任藥師鑒定為正品，符合2015年版《中國藥典》規(guī)范。芪仙通絡方水煎后濃縮成生藥質(zhì)量濃度1.566 g/mL，補腎活血拆方水煎濃縮成1.161 g/mL，益氣溫陽拆方水煎濃縮成0.405 g/mL，4℃冰箱保存?zhèn)溆?。胞磷膽堿鈉膠囊（齊魯制藥有限公司，0.1 g×40粒/盒，國藥準字H20020220）生理鹽水溶解后稀釋成0.0054 g/mL的水溶液備用。甘氨酸銀染液套裝（Servicebio，貨號G1052）；Anti-BDNF Rabbit pAb（Servicebio，貨號 GB11559）；Anti-GDNF Rabbit pAb（Servicebio，貨號 GB11403）；Anti-NGF Rabbit pAb（Servicebio，貨號GB11143）；HRP標記山羊抗兔（Servicebio，貨號GB23301）；免疫組化試劑盒（Servicebio，貨號G1215）；尼氏體染色液（Servicebio，貨號G1036）。

1.3 主要儀器 大腦中動脈栓塞（MCAO）線栓（廣州佳靈生物技術(shù)有限公司，規(guī)格3600AAA）；組織脫水機（武漢俊杰電子有限公司，型號JJ-12J）；石蠟包埋機（武漢俊杰電子有限公司，型號JB-P5）；石蠟切片機（上海徠卡儀器有限公司，型號RM2016）；組織攤片機（浙江省金華市科迪儀器設備有限公司，型號KD-P）；微波爐（格蘭仕微波爐電器有限公司，型號P70D20TLP4）；正置光學顯微鏡（日本尼康，型號NIKON ECLIPSE E100）。

1.4 造模方法 參照課題組前期研究方法［7］，采用線栓法復制大鼠MCAO模型。大鼠造模前12 h禁食，不禁水。將大鼠10%水合氯醛腹腔注射麻醉后仰臥位固定于手術(shù)操作臺上，取頸部正中切口，分離左側(cè)頸總動脈、頸外動脈、頸內(nèi)動脈。結(jié)扎頸總動脈、頸外動脈。動脈夾夾閉頸內(nèi)動脈，于頸總動脈上端近分叉處約4 mm處用注射器針頭刺一小孔，將直徑為0.28 mm的線栓插入頸內(nèi)動脈，插入深度由分叉部計約18.0 mm，固定線栓，依次關(guān)閉切口。假手術(shù)組切開皮膚，暴露頸總、頸外和頸內(nèi)動脈，不插入線栓，其余步驟和手術(shù)組相同。大鼠清醒后，采用Longa評分法評定神經(jīng)功能［8］，評分越高，神經(jīng)功能缺損越嚴重，選取1～3分者納入實驗，死亡大鼠予以隨機替補。

1.5 分組與給藥 將30只造模成功的大鼠按隨機數(shù)字表法隨機分為模型組、芪仙通絡全方組（補腎活血、益氣溫陽藥）、拆方1組（補腎活血藥）、拆方2組（益氣溫陽藥）、胞磷膽堿組，每組6只。另設假手術(shù)組6只。于MCAO術(shù)后第3天開始灌胃干預，芪仙通絡全方組給藥劑量為15.66 g/（kg·d），拆方1組為11.61 g/（kg·d），拆方2組為4.05 g/（kg·d），胞磷膽堿組為0.054 g/（kg·d），假手術(shù)組和模型組予以蒸餾水灌胃，連續(xù)給藥12 d。

1.6 標本采集與檢測 各組大鼠在末次灌胃后4 h，10%水合氯醛腹腔注射麻醉，打開胸腔暴露心臟，剪開右心耳，同時夾閉腹主動脈，將注射器針頭經(jīng)心尖插入至主動脈端并固定好，用100 mL生理鹽水通過注射器快速注入，待心臟無血污流出及前爪、肺部顏色變成白色后，改用100 mL 4%多聚甲醛灌注，然后開顱取腦，去除小腦、腦干及嗅球后，將大腦置于4%多聚甲醛中固定，4℃冰箱保存，用于尼氏染色、鍍銀染色和免疫組化檢測。1）神經(jīng)功能評價。分別于造模后第3天、第7天、第14天采用改良神經(jīng)功能缺損評分（mNSS）［9］評定大鼠的神經(jīng)功能，對大鼠的運動、感覺、反射和平衡能力進行全面評價，總分為18分，分值越高代表神經(jīng)功能缺損越嚴重。2）神經(jīng)元及神經(jīng)纖維病理形態(tài)觀察。于造模后第14天通過尼氏染色檢測神經(jīng)元尼氏小體含量，觀察梗死周邊區(qū)域神經(jīng)元病理形態(tài)改變，通過鍍銀染色觀察神經(jīng)纖維病理形態(tài)改變。腦組織常規(guī)脫水、透明、浸蠟、包埋，4 μm連續(xù)冠狀切片，60℃烤片2 h后常規(guī)脫蠟至水，然后將腦組織切片放入尼氏體染色液染色2～5 min或甘氨酸銀染液中染色8～10 min，脫水后，中性樹膠封片。每張切片在光學顯微鏡下高倍鏡視野（400倍）觀察梗死周邊區(qū)域，每只大鼠分別隨機取1張切片，每張切片觀察5個視野，拍照采集圖像，采用Image Pro Plus 6.0圖像分析軟件計算單位面積尼氏小體或神經(jīng)纖維積分光密度，取平均光密度（MOD）值對尼氏小體或神經(jīng)纖維進行病理形態(tài)定量分析。3）腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（BDNF）、膠質(zhì)細胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（GDNF）、神經(jīng)生長因子（NGF）表達檢測。于造模后第14天通過免疫組化檢測梗死周邊區(qū)域神經(jīng)營養(yǎng)因子BDNF、GDNF、NGF表達水平。將常規(guī)脫蠟至水的腦組織切片，置于EDTA（PH9.0）抗原修復液中進行抗原修復20 min，放入3%雙氧水溶液室溫避光孵育25 min，滴加3%BSA室溫封閉30 min，加入Anti-BDNF Rabbit pAb（1∶200）、Anti-GDNF Rabbit pAb（1∶200）、Anti-NGF Rabbit pAb（1∶200），4 ℃冰箱孵育過夜，滴加與一抗相應種屬的二抗（HRP標記），室溫孵育50 min，DAB顯色，蘇木素復染細胞核，脫水后中性樹膠封片。每張切片在光學顯微鏡下高倍鏡視野（400倍）觀察梗死周邊區(qū)域，每只大鼠隨機取1張切片，每張切片觀察5個視野，拍照采集圖像，采用Image Pro Plus 6.0圖像分析軟件計算神經(jīng)纖維MOD值，進行病理形態(tài)定量分析。

1.7 統(tǒng)計學處理 應用SPSS 22.0統(tǒng)計軟件。計量資料以（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠MCAO術(shù)后不同時間點mNSS比較 見表1。大鼠腦梗死造模后，模型組mNSS明顯升高，經(jīng)芪仙通絡方及其拆方、陽性藥胞磷膽堿干預后，各給藥組（第7天、第14天）mNSS均明顯低于模型組（P＜0.01），而分別與拆方1組、拆方2組及胞磷膽堿組比較，芪仙通絡全方組（第7天、第14天）mNSS顯著降低（P＜0.05）。

表1 各組大鼠MCAO術(shù)后不同時間點mNSS比較（分，±s）

表1 各組大鼠MCAO術(shù)后不同時間點mNSS比較（分，±s）

注：與模型組比較，**P＜0.01；與芪仙通絡全方組比較，△P＜0.05。下同。

組別n 3 d 7 d 14 d假手術(shù)組模型組芪仙通絡全方組拆方1組拆方2組胞磷膽堿組6 6 6 6 6 6 0.00±0.00 9.52±0.43 9.46±0.32 9.37±0.38 9.46±0.27 9.54±0.22 0.00±0.00 8.95±0.21 6.47±0.28**7.07±0.26**△7.98±0.32**△8.07±0.13**△0.00±0.00 6.91±0.38 4.36±0.19**5.32±0.37**△6.05±0.24**△6.11±0.52**△

2.2 各組大鼠梗死周邊區(qū)域神經(jīng)元及神經(jīng)纖維病理形態(tài)比較 如圖1、表2所示，尼氏染色可見假手術(shù)組神經(jīng)元結(jié)構(gòu)清晰，胞漿內(nèi)分布有深藍色片狀的尼氏小體，以胞漿周邊分布最為密集。模型組梗死周邊區(qū)域神經(jīng)元結(jié)構(gòu)模糊，尼氏小體含量明顯減少，以細小顆粒為主，著色不均。各給藥組梗死周邊區(qū)域尼氏小體的含量均有不同程度的增加，胞漿著色較深。經(jīng)定量分析，尼氏小體MOD值均明顯高于模型組（P＜0.01），而與拆方1組、拆方2組及胞磷膽堿組分別比較，芪仙通絡全方組尼氏小體MOD值最高（P＜0.05）。如圖2、表2所示，鍍銀染色可見假手術(shù)組神經(jīng)纖維形態(tài)完整，分布密集，排列有序，距離較長，呈黑色，背景金黃色；模型組梗死周邊區(qū)域可見大量神經(jīng)纖維斷裂，結(jié)構(gòu)破壞，散亂無章，參差不齊，彎曲收縮球形，僅極少數(shù)保持連續(xù)完整；各給藥組梗死周邊區(qū)域神經(jīng)纖維均有不同程度的芽生修復，經(jīng)定量分析，神經(jīng)纖維MOD值均明顯高于模型組（P＜0.01），而與拆方1組、拆方2組及胞磷膽堿組分別比較，芪仙通絡全方組神經(jīng)纖維MOD值最高（P＜0.05）。

表2 各組大鼠梗死周邊神經(jīng)元及神經(jīng)纖維病理形態(tài)比較（±s）

表2 各組大鼠梗死周邊神經(jīng)元及神經(jīng)纖維病理形態(tài)比較（±s）

組別假手術(shù)組模型組芪仙通絡全方組拆方1組拆方2組胞磷膽堿組n 6 6 6 6 6 6尼氏小體0.016±0.005 0.004±0.001 0.014±0.006**0.010±0.002**△0.007±0.003**△0.005±0.001**△神經(jīng)纖維0.187±0.012 0.109±0.017 0.167±0.011**0.145±0.018**△0.131±0.012**△0.133±0.014**△

圖1 各組大鼠腦梗死周邊神經(jīng)元病理形態(tài)（尼氏染色，400倍）

圖2 各組大鼠腦梗死周邊神經(jīng)纖維病理形態(tài)（鍍銀染色，400倍）

2.3 各組大鼠梗死周邊神經(jīng)營養(yǎng)因子表達比較 如圖3、表3所示，BDNF、GDNF及NGF主要表達位于細胞間質(zhì)及細胞質(zhì)，呈棕黃色，細胞核為藍色；假手術(shù)組可見BDNF、GDNF及NGF一定量表達，模型組表達稍增加；與模型組比較，各給藥組BDNF、GDNF及NGF表達均顯著增加（P＜0.01）；與拆方1組、拆方2組及胞磷膽堿組分別比較，芪仙通絡全方組BDNF、GDNF及NGF表達增加程度最顯著（P＜0.05）。

表3 各組大鼠梗死周邊神經(jīng)營養(yǎng)因子表達比較（±s）

表3 各組大鼠梗死周邊神經(jīng)營養(yǎng)因子表達比較（±s）

組別假手術(shù)組模型組芪仙通絡全方組拆方1組拆方2組胞磷膽堿組n 6 6 6 6 6 6 BDNF 0.008±0.002 0.012±0.003 0.018±0.004**0.016±0.002**△0.014±0.003**△0.014±0.001**△GDNF 0.009±0.002 0.011±0.003 0.019±0.003**0.015±0.001**△0.012±0.002**△0.013±0.001**△NGF 0.002±0.000 0.004±0.001 0.015±0.002*0.010±0.001**△0.007±0.002**△0.008±0.003**△

圖3 各組大鼠腦梗死周邊神經(jīng)營養(yǎng)因子表達（IHC染色，400倍）

3 討 論

芪仙通絡方由黃芪、淫羊藿、制首烏、枸杞子、丹參等藥組成。方中黃芪為君藥，大補元氣；淫羊藿、制首烏、枸杞子為臣藥，淫羊藿佐君藥黃芪益氣溫陽、溫補腎中陽氣，配伍制首烏、枸杞子補腎填精，達到助陽生陰之用；丹參等活血通絡為佐藥。諸藥合用，共奏益氣溫陽、補腎活血之功。經(jīng)查閱文獻發(fā)現(xiàn)，目前針對腦梗死腎虛血瘀證的治療，廣大醫(yī)家大多采用單純補腎填精、活血通絡法或補腎益氣活血法或補腎活血基礎(chǔ)上加以附子、干姜等剛猛的溫陽藥治療［10-13］，而在補腎填精、活血通絡藥的基礎(chǔ)上，加以柔和的益氣溫陽藥、意在少火生氣者則未見報道。課題組前期臨床研究表明，芪仙通絡方能顯著改善腦梗死恢復及后遺癥期患者的神經(jīng)功能，提高其日常生活活動能力，改善腎虛血瘀證中醫(yī)證候，且未見任何不良反應發(fā)生［5］。實驗研究證實，本方能顯著促進MCAO大鼠神經(jīng)功能恢復，上調(diào)缺血海馬區(qū)BDNF表達，抑制膠質(zhì)細胞過度活化，促進內(nèi)源性神經(jīng)再生［7］。結(jié)果說明“氣陽主用”腦病創(chuàng)新理論指導下的芪仙通絡方在治療腦梗死后神經(jīng)功能障礙方面優(yōu)勢明顯，組方配伍獨特，臨床實用性較強。

國際腦卒中治療臨床前研究指南指出，多重指標綜合評價MCAO模型很重要，組織學和行為學的結(jié)果都應該評價［14］。首先在行為學層面，由于大腦中動脈供血的區(qū)域包括額頂顳葉皮質(zhì)、邊緣系統(tǒng)、丘腦、單側(cè)豆狀核及內(nèi)囊，依據(jù)缺血部位及程度的不同，可表現(xiàn)為運動、感覺、反射、平衡或認知功能受損。而目前廣泛采用的動物行為學評價主要有Longa評分法［8］和Bederson分級法［15］。這些評分法雖然操作簡便，但相對較為粗糙、主觀，僅評價運動功能，有其局限性。而mNSS包括運動、感覺、反射和平衡4項測試，能夠較全面反映腦損傷及恢復的程度。其次在組織學層面，尼氏小體是神經(jīng)元活性的指標，由粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)及游離核糖核蛋白體共同構(gòu)成，主要功能是合成蛋白質(zhì)。生理情況下，尼氏小體的數(shù)量可反映神經(jīng)細胞合成蛋白質(zhì)的能力，而當神經(jīng)元受損等病理狀態(tài)下，胞質(zhì)內(nèi)的尼氏小體可溶解、減少或消失，如細胞不死亡，則尼氏小體可逐步恢復。因此通過尼氏小體染色密度大小和深淺可以反映神經(jīng)元的功能狀態(tài)［16］。鍍銀染色又稱甘氨酸銀染色，能將神經(jīng)細胞軸突和樹突、神經(jīng)細胞內(nèi)原纖維等染成黑色，切片的其他組織及背景呈現(xiàn)金黃色，常用于研究神經(jīng)纖維的病理改變，可用來了解神經(jīng)纖維變性或修復程度［17］。本實驗發(fā)現(xiàn)，造模后腦梗死大鼠肢體運動、感覺、平衡等神經(jīng)功能均受損，梗死周邊組織出現(xiàn)明顯的缺血損傷病理改變，而芪仙通絡方及其補腎活血藥拆方、益氣溫陽藥拆方以及胞磷膽堿干預均可使其病理形態(tài)發(fā)生逆轉(zhuǎn)，梗死周邊區(qū)域神經(jīng)元尼氏小體含量增多，神經(jīng)纖維均有不同程度的芽生修復，其中又以補腎活血、益氣溫陽立法的芪仙通絡全方組作用最明顯，提示補腎活血藥與益氣溫陽藥配伍使用，可產(chǎn)生協(xié)同作用，間接佐證了“氣陽主用”創(chuàng)新理論對于治療腦梗死后神經(jīng)功能障礙具有的重要臨床指導價值。

神經(jīng)營養(yǎng)因子是由多種細胞分泌的一類對外周和中樞發(fā)揮營養(yǎng)作用的物質(zhì)，促進和支持靶細胞的生長、分化、修復和存活，調(diào)節(jié)神經(jīng)系統(tǒng)的代謝和功能。BDNF、GDNF以及NGF是神經(jīng)營養(yǎng)因子家族的重要成員，是腦內(nèi)重要的神經(jīng)修復促進因子，在腦缺血損傷修復過程中能夠在突觸水平、軸突水平和細胞水平上調(diào)節(jié)神經(jīng)的再生重塑［18］。本研究顯示，假手術(shù)組可見BDNF、GDNF及NGF一定量表達，模型組表達稍增加，而各給藥組表達均較模型組明顯增加，其中芪仙通絡全方組表達增加程度最顯著，表明芪仙通絡方及其拆方均能顯著促進腦梗死大鼠梗死周邊區(qū)域神經(jīng)營養(yǎng)因子BDNF、GDNF、NGF蛋白表達，其中芪仙通絡全方作用優(yōu)于單純補腎活血藥和益氣溫陽藥，提示腦缺血后大鼠腦組織可反應性增加梗死周邊組織神經(jīng)營養(yǎng)因子BDNF、GDNF、NGF的合成和分泌，但這種能力非常有限，而芪仙通絡方全方較拆方更能顯著上調(diào)這種趨勢。因此，通過調(diào)節(jié)神經(jīng)營養(yǎng)因子表達可能是芪仙通絡方及其拆方修復缺血損傷神經(jīng)元及神經(jīng)纖維、改善受損神經(jīng)功能的分子機制。

綜上所述，本研究從動物整體水平證實了芪仙通絡方及其拆方治療腦梗死后神經(jīng)功能障礙的療效，同時初步揭示了其分子機制，并為中醫(yī)藥運用“氣陽主用”腦病創(chuàng)新理論治療中風病提供了實驗證據(jù)。然而，梗死周邊區(qū)域病理形態(tài)的改善是否是由于神經(jīng)元自身修復或再生或軸突-髓鞘重塑則有待進一步深入研究。