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    13種抗生素對快生長分枝桿菌的體外抑菌效果評價

    2021-09-07 06:03:24于霞任汝顏文舒安梁倩董玲玲黃海榮
    中國防癆雜志 2021年9期
    關(guān)鍵詞:米卡環(huán)素膿腫

    于霞 任汝顏 文舒安 梁倩 董玲玲 黃海榮

    快生長分枝桿菌(rapidly growing mycobacteria,RGM)是非結(jié)核分枝桿菌(nontuberculous mycobacteria,NTM)的一種,生長速度較快,在羅氏或7H10培養(yǎng)基上一周內(nèi)可見菌落生長。近年來,全球RGM感染的發(fā)病率在不斷增加[1-2],但是根據(jù)臨床癥狀或影像學(xué)特征,通常很難區(qū)分RGM感染和結(jié)核分枝桿菌感染[3];膿腫分枝桿菌、龜分枝桿菌和偶發(fā)分枝桿菌是最常見的致病RGM。膿腫分枝桿菌是最常見的引起NTM肺病的菌種,約50%的NTM肺病由其引起,臨床癥狀與肺結(jié)核相似,難以鑒別。此外,膿腫分枝桿菌也常引起皮膚軟組織和骨關(guān)節(jié)感染。偶發(fā)分枝桿菌與膿腫分枝桿菌類似,既可引起肺病,也可引起皮膚軟組織和骨關(guān)節(jié)感染[4]。而龜分枝桿菌主要引起人類的皮膚、骨骼和軟組織感染,極少引起肺部感染。近年來,龜分枝桿菌感染也成為外科手術(shù)和醫(yī)學(xué)美容手術(shù)常見的伴發(fā)感染,如器官移植、整容手術(shù)、美容注射吸脂手術(shù)及紋身等[5-6]。

    由RGM感染引起疾病的治療仍然十分困難,因其對多種一線抗結(jié)核藥物天然耐藥[7]。因此,準(zhǔn)確的藥物敏感性試驗(簡稱“藥敏試驗”)對RGM感染致病的臨床治療至關(guān)重要。在中國,疑似結(jié)核病患者中NTM感染的占比約為6.3%,最常見的RGM感染菌種分別是膿腫分枝桿菌(20.3%)、龜分枝桿菌(10.5%)和偶發(fā)分枝桿菌(6.4%)[8]。為此,筆者擬對上述3種我國最常見的RGM臨床分離株和RGM標(biāo)準(zhǔn)株采用Sensititre RAPMYCO藥敏板測定其對13種抗生素的敏感性,以了解其抗生素耐藥特征譜,從而為RGM感染的個體化治療提供重要依據(jù)。

    材料和方法

    1.菌株選擇:收集首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京胸科醫(yī)院2015年1月至2019年12月從臨床樣本中分離出的98株RGM,包括25株偶發(fā)分枝桿菌、70株膿腫分枝桿菌和3株龜分枝桿菌。這些臨床分離株的患者來源于中國的北方,包括13個省份及北京和天津兩個直轄市。選取在對硝基苯甲酸(500 μg/ml)生長試驗陽性的菌株,進(jìn)行hsp65、rpoB和16S rRNA、16-23S rRNA基因的測序,將所有臨床分離株鑒定至菌種水平。龜分枝桿菌(ATCC14472)、偶發(fā)分枝桿菌(ATCC6481)和膿腫分枝桿菌(ATCC19977)標(biāo)準(zhǔn)株購自美國標(biāo)準(zhǔn)菌株庫(American Type Culture Collection,ATCC)。

    2.試劑儀器:藥敏試驗使用Sensititre RAPMYCO 藥敏板(美國賽默飛公司)進(jìn)行檢測,其可在不需要儀器設(shè)備的情況下定量評估臨床分離株對13種抗生素的藥物敏感性[7]。該板是含有凍干抗生素的微孔板,用于檢測RGM菌株的最低抑菌濃度(minimal inhibitory concentration,MIC)[9]。該板含有以下濃度的13種抗生素:阿米卡星,1~64 μg/ml;妥布霉素,1~16 μg/ml;阿莫西林-克拉維酸,2/1 μg/ml~64/32 μg/ml;頭孢西丁,4~128 μg/ml;亞胺培南,2~64 μg/ml;環(huán)丙沙星,0.12~4 μg/ml;莫西沙星,0.25~8 μg/ml;克拉霉素,0.03~16 μg/ml;利奈唑胺,1~32 μg/ml;米諾環(huán)素,1~8 μg/ml;多西霉素,2~64 μg/ml;替加環(huán)素,0.015~4 μg/ml;甲氧芐啶-磺胺甲噁唑,0.25/4.75 μg/ml~8/152 μg/ml。

    3.MIC測定:在無菌生理鹽水中制備菌懸液,將其比濁至0.5 麥?zhǔn)蠞舛取?0 μl的菌懸液加入10 ml的Mueller Hinton(MH)肉湯培養(yǎng)基,最終接種液細(xì)菌載量為1×105~5×105CFU/ml。顛倒混勻后向每孔加入100 μl菌懸液。將100 μl菌懸液轉(zhuǎn)移到含有13種抗生素的平板的各個孔中。用黏性密封紙密封接種板,并在28~30 ℃培養(yǎng)箱中孵育72 h。如果在對照孔中有菌生長,表現(xiàn)為渾濁或孔底部有沉積物,表示菌量已足夠,記錄各含藥孔的細(xì)菌生長情況,第一個抑制細(xì)菌生長的藥物濃度,即為MIC值。否則,繼續(xù)培養(yǎng)48 h再判讀結(jié)果。

    4.統(tǒng)計學(xué)處理:對實驗菌株的耐藥情況進(jìn)行描述性分析。

    結(jié) 果

    1.標(biāo)準(zhǔn)菌株的耐藥情況:龜分枝桿菌(ATCC14472)、偶發(fā)分枝桿菌(ATCC6481)和膿腫分枝桿菌(ATCC19977)標(biāo)準(zhǔn)株在不同批次實驗中MIC值顯示出高度的可重復(fù)性,見表1。

    表1 13種抗生素對3種快生長分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株的最小抑菌濃度(μg/ml)

    2.龜分枝桿菌臨床分離株的耐藥情況:除有1株龜分枝桿菌臨床分離株的MIC>64 μg/ml表現(xiàn)為對阿米卡星耐藥外,阿米卡星對其余2株龜分枝桿菌的抑菌活性均較好。對于納入的3株龜分枝桿菌臨床分離株,替加環(huán)素對其MIC分別為0.12、1、2 μg/ml。但莫西沙星、環(huán)丙沙星和利奈唑胺對龜分枝桿菌臨床分離株幾乎沒有抑菌活性。

    3.偶發(fā)分枝桿菌臨床分離株的耐藥情況:阿米卡星對偶發(fā)分枝桿菌的抑菌活性最佳,敏感率為100.0%(25/25)。替加環(huán)素也對其表現(xiàn)出優(yōu)越的抗菌活性,敏感率可達(dá)100.0%(25/25)。對于氟喹諾酮類藥物,莫西沙星和環(huán)丙沙星均表現(xiàn)出對偶發(fā)分枝桿菌臨床分離株高度的體外抑菌活性。但只有4.0%(1/25)納入的偶發(fā)分枝桿菌臨床分離株對克拉霉素敏感(表2)。

    表2 偶發(fā)分枝桿菌臨床分離株的藥物敏感性試驗結(jié)果

    4.膿腫分枝桿菌臨床分離株的耐藥情況:阿米卡星對膿腫分枝桿菌的抑菌活性最佳,敏感率為90.0%(63/70);替加環(huán)素也對其表現(xiàn)出優(yōu)越的抑菌活性,敏感率可達(dá)到72.9%(51/70)。此外,大多數(shù)膿腫分枝桿菌對克拉霉素敏感或中介敏感。但莫西沙星和環(huán)丙沙星對膿腫分枝桿菌臨床分離株幾乎沒有抑菌活性。幾乎所有納入的膿腫分枝桿菌臨床分離株均對利奈唑胺耐藥(表3)。

    表3 膿腫分枝桿菌臨床分離株的藥物敏感性試驗結(jié)果

    5.不同藥品對3種RGM耐藥情況比較:阿米卡星對3種RGM均具有很好的體外抑菌效果,對偶發(fā)分枝桿菌和膿腫分枝桿菌的敏感率分別為100.0%(25/25)和90.0%(63/70);3株龜分枝桿菌臨床分離株中,有2株對阿米卡星敏感。替加環(huán)素對RGM的體外抑菌效果更好,對偶發(fā)分枝桿菌和膿腫分枝桿菌的敏感率分別為100.0%(25/25)和72.9%(51/70)。莫西沙星和環(huán)丙沙星對偶發(fā)分枝桿菌臨床分離株表現(xiàn)出較強的抑菌活性,敏感率分別為100.0%(25/25)和92.0%(23/25),而對膿腫分枝桿菌臨床分離株幾乎沒有體外抑菌活性,耐藥率均為95.7%(67/70)。幾乎所有檢測的RGM臨床分離株均對頭孢西丁、多西環(huán)素、利奈唑胺、亞胺培南和甲氧嘧啶-磺胺甲噁唑耐藥。

    討 論

    美國胸科協(xié)會對于RGM(龜分枝桿菌、膿腫分枝桿菌和偶發(fā)分枝桿菌)的推薦治療方案是依據(jù)體外藥敏試驗的結(jié)果選擇藥物。對于偶發(fā)分枝桿菌引起的肺病,推薦使用至少2種以上體外敏感的藥物進(jìn)行治療,直至痰菌陰轉(zhuǎn)12個月;對于膿腫分枝桿菌肺病,推薦使用含克拉霉素的多藥物治療方案[4]。實驗室標(biāo)準(zhǔn)化研究所推薦對RGM(包括膿腫分枝桿菌、偶發(fā)分枝桿菌、龜分枝桿菌和Fuerth分枝桿菌)應(yīng)進(jìn)行以下藥品的藥敏試驗,包括阿米卡星、頭孢西丁、克拉環(huán)素、阿奇霉素、亞胺培南、莫西沙星、左氧氟沙星、環(huán)丙沙星、多西環(huán)素、美羅培南等[10]。本研究所用的RAPMYCO MIC 藥敏板涵蓋了實驗室標(biāo)準(zhǔn)化研究所推薦對RGM藥敏試驗的全部抗生素,其藥敏試驗結(jié)果可為RGM感染的治療提供重要依據(jù)。

    研究顯示,阿米卡星對膿腫分枝桿菌、龜分枝桿菌和偶發(fā)分枝桿菌的抑菌活性強,而妥布霉素僅對龜分枝桿菌有效,這與其他研究結(jié)果一致[7,11]。與多西霉素/米諾環(huán)素相比,替加環(huán)素在先前的研究及本研究中均對RGM表現(xiàn)出較低的MIC,目前被認(rèn)為是一種有前景的藥品[11]。筆者研究數(shù)據(jù)顯示,幾乎所有納入的臨床分離株均對頭孢西丁、多西環(huán)素和甲氧嘧啶-磺胺甲噁唑具有抗性,這與Cavusoglu等[9]研究一致。對于亞胺培南,所有納入的RGM分離株均對其耐藥,這也與先前的研究一致,即偶發(fā)分枝桿菌對亞胺培南的敏感率每年都以9.5%的速度下降[12]。本研究中,納入的膿腫分枝桿菌對利奈唑胺的敏感率僅為2.9%,與Hatakeyama等[13]的研究結(jié)果不一致,其報告了膿腫分枝桿菌對利奈唑胺的敏感率為76.9%(10/13)。陳品儒等[14]發(fā)現(xiàn)廣東地區(qū)分離的膿腫分枝桿菌耐藥率呈現(xiàn)逐年增加的趨勢,2010年的敏感率為87.1%(27/31),而2011年則降為68%(17/25)。隨著利奈唑胺在我國臨床上的廣泛應(yīng)用,勢必導(dǎo)致耐藥菌株的數(shù)量不斷增加。

    本研究采用商品化的RAPMYCO MIC 藥敏板檢測RGM的藥物敏感性,該方法已經(jīng)獲得國家食品藥品監(jiān)督管理局批準(zhǔn)可用于臨床診斷。與傳統(tǒng)的羅氏藥敏試驗相比,RAPMYCO MIC藥敏板無需手工制備不同藥物濃度的培養(yǎng)基,操作簡單;與MGIT 960液體藥敏試驗相比,RAPMYCO MIC藥敏板法成本低、檢測藥物種類更多且可以報告MIC,可以更好地指導(dǎo)臨床用藥。因此,RAPMYCO MIC藥敏板是一種快速、簡單且經(jīng)濟(jì)的藥敏試驗檢測方法。

    綜上所述,阿米卡星、替加環(huán)素、環(huán)丙沙星、莫西沙星和克拉霉素對RGM表現(xiàn)出良好的抑菌活性,此結(jié)果可為RGM感染的治療提供參考。目前,RGM感染治療可供選擇的藥物仍非常有限,需要對RGM感染治療方案的優(yōu)化提供更多的數(shù)據(jù)。RAPMYCO MIC藥敏板操作簡單,可以方便、快速地檢測出RGM對13種抗生素的敏感性,適合在臨床上常規(guī)開展使用。

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