基于結(jié)核病宿主免疫反應(yīng)的實驗室檢測技術(shù)及其臨床應(yīng)用

逄宇 高興輝 湯一葦 高孟秋

結(jié)核病是全球重大公共衛(wèi)生問題[1]。世界衛(wèi)生組織估算全球每年新發(fā)結(jié)核病患者超過1000萬例，死亡患者超過140萬例，有效遏制結(jié)核病需要新型的防控技術(shù)[1-2]。人群暴露于結(jié)核分枝桿菌(Mycobacteriumtuberculosis, MTB)環(huán)境中后發(fā)生結(jié)核感染，但無臨床癥狀，成為潛伏感染者，部分潛伏感染者在后期發(fā)展成活動性結(jié)核病患者，在人群感染結(jié)核分枝桿菌的過程中，存在兩個主要狀態(tài)：(1)是否能夠清除入侵的結(jié)核分枝桿菌；(2)感染結(jié)核分枝桿菌的潛伏感染者是否會發(fā)病[3-4]。在這兩個過程中，宿主的免疫系統(tǒng)都發(fā)揮至關(guān)重要的作用。其中入侵宿主的結(jié)核分枝桿菌激發(fā)感染性遲發(fā)型超敏反應(yīng)，即由效應(yīng)性T細胞與相應(yīng)抗原作用后，引起的以單個核細胞浸潤和組織細胞損傷為主要特征的炎癥反應(yīng)[3]。一方面，遲發(fā)型超敏反應(yīng)能夠保護患者在接受到抗原刺激后迅速應(yīng)答以實現(xiàn)清除病原的目的；另一方面，肺結(jié)核患者對結(jié)核分枝桿菌產(chǎn)生T細胞免疫可導(dǎo)致自身組織損傷，形成干酪樣壞死和肺空洞，精準調(diào)控免疫應(yīng)答的保護和損傷作用的動態(tài)平衡是提高患者治療效果的重要方面[5]。

當(dāng)前結(jié)核病實驗室診斷仍然是以病原學(xué)為主，通過檢測到結(jié)核分枝桿菌或其核酸，為臨床診斷結(jié)核病提供重要的實驗室證據(jù)[2]。雖然病原學(xué)檢測被視為結(jié)核病實驗室診斷的可靠方法，但是超過半數(shù)患者無法找到確定的實驗室證據(jù)，提示亟待開發(fā)新型的診斷技術(shù)滿足日益增長的臨床需求[6]。培養(yǎng)是結(jié)核病實驗室診斷的金標(biāo)準，其成本低廉也是其顯著優(yōu)勢，但是培養(yǎng)方法自身的缺點也成為制約其在基層實驗室推廣使用的主要限制因素[6-7]。結(jié)核分枝桿菌是高致病性病原微生物，開展結(jié)核分枝桿菌的實驗需要符合特殊生物安全標(biāo)準，這也成為制約分枝桿菌培養(yǎng)在基層推廣的重要因素；最后，培養(yǎng)操作相對繁瑣，對實驗室操作人員的熟練程度要求較高[8]。近些年多種分子生物技術(shù)在結(jié)核病及耐藥結(jié)核病早期診斷方面發(fā)揮重要作用[2,9]。但是與傳統(tǒng)的培養(yǎng)相比，其高敏感度造成的特異度稍差可能造成臨床診斷困難；此外，由于DNA的高穩(wěn)定性，基于DNA的檢測方法難以區(qū)分結(jié)核分枝桿菌的死活，限制了分子生物學(xué)診斷技術(shù)在結(jié)核病患者療效評價中的應(yīng)用[2]。對于部分早期診斷的肺結(jié)核患者，缺乏臨床癥狀且無法排出高質(zhì)量的痰，也造成了分子生物學(xué)診斷技術(shù)在痰菌陰性肺結(jié)核診斷中的困境[6]。免疫學(xué)診斷技術(shù)目前是輔助結(jié)核病實驗室診斷的重要方面[10]。結(jié)核菌素皮膚試驗(tuberculin skin test, TST)和結(jié)核特異性γ-干擾素釋放試驗(interferon-gamma release assay，IGRA)是目前應(yīng)用最廣泛的結(jié)核病免疫學(xué)診斷技術(shù)，在《WS 288—2017 肺結(jié)核診斷》[11]中作為活動性結(jié)核病的輔助診斷技術(shù)。但由于僅對結(jié)核抗原刺激的遲發(fā)型超敏反應(yīng)進行檢測，無法區(qū)分活動性結(jié)核病和潛伏感染者，這導(dǎo)致兩種方法在結(jié)核病診斷方面的特異度較低。近年來，聚焦于提高結(jié)核病實驗室診斷，特別是痰菌陰性肺結(jié)核診斷，充分發(fā)掘宿主抗結(jié)核的特異性應(yīng)答反應(yīng)，尋找新型的免疫學(xué)診斷標(biāo)志物或標(biāo)志物組合用于結(jié)核病診斷成為未來重要方向。本文系統(tǒng)梳理了結(jié)核病宿主反應(yīng)實驗室檢測技術(shù)的進展及其臨床應(yīng)用。

一、結(jié)核病宿主反應(yīng)實驗室檢測

(一)TST

TST是1907年奧地利科學(xué)家Von Pirquet提出的，其基本原理是通過皮內(nèi)注射結(jié)核菌素，并根據(jù)注射部位的皮膚狀況診斷結(jié)核分枝桿菌感染所致Ⅳ型超敏反應(yīng)的皮內(nèi)試驗[12]。在過去TST一直用于識別結(jié)核分枝桿菌潛伏感染的風(fēng)險人群，但TST的主要問題是高水平的假陽性結(jié)果，是由于TST無法區(qū)分結(jié)核分枝桿菌感染和接觸非結(jié)核分枝桿菌或接種卡介苗引起的陽性反應(yīng)，這兩種假陽性反應(yīng)通常歸因于由卡介苗接種或環(huán)境分枝桿菌的同源抗原觸發(fā)的免疫反應(yīng)[13]。TST特點是操作簡單，無需特殊設(shè)備，是臨床上常用的輔助診斷結(jié)核病方法，其敏感度約為68%～95%，特異度約為96%～99%[14]。其敏感度受注射結(jié)核菌素的效力和劑量、感染后間隔時間、脫敏、故意干擾、產(chǎn)后免疫抑制和觀察者變異的影響。特異度受鳥分枝桿菌、副結(jié)核分枝桿菌和環(huán)境分枝桿菌的致敏作用以及皮膚結(jié)核的影響[14]。TST可用于結(jié)核病流行情況的調(diào)查和監(jiān)測，通過該試驗可獲得一個地區(qū)結(jié)核感染和結(jié)核分枝桿菌的傳播情況；可為接種卡介苗提供依據(jù)并監(jiān)測卡介苗的免疫效果與質(zhì)量；可輔助結(jié)核病診斷和鑒別診斷，對于臨床疑似結(jié)核病患者，若陽性反應(yīng)可支持結(jié)核病的診斷，若陰性反應(yīng)則說明結(jié)核病可能性較小，但陰性反應(yīng)不能排除其他情況導(dǎo)致，如免疫缺陷、營養(yǎng)不良、炎癥或全身播散性結(jié)核病、肺炎、腫瘤、病毒感染等[15]。重組結(jié)核桿菌融合蛋白(EC)是一種新型的皮膚試驗產(chǎn)品，在結(jié)核病患者中EC具有良好的敏感度(90.64%)，與TST具有較高的一致性；在未感染結(jié)核分枝桿菌人員中EC的兩次檢測陰性一致率較高(88.20%)；在非結(jié)核性疾病患者中EC的陰性符合率較高(73.10%)，與T-SPOT.TB的一致性較好；同時不受卡介苗接種的影響[16-19]。

(二)IGRA

IGRA的基本原理是機體感染結(jié)核分枝桿菌以后，存于血液中的特異性T淋巴細胞會在再次接觸結(jié)核分枝桿菌特異性抗原(如早期分泌抗原靶6和培養(yǎng)濾液蛋白10等)時，T細胞活化并分泌相應(yīng)的細胞因子γ干擾素，通過對效應(yīng)T細胞和γ干擾素的檢測，判斷機體被結(jié)核分枝桿菌感染的風(fēng)險[20]。IGRA包括干擾素體外釋放酶聯(lián)免疫法和體外酶聯(lián)免疫斑點試驗，前者檢測γ干擾素產(chǎn)生水平，后者檢測產(chǎn)生γ干擾素細胞的數(shù)量，這兩種檢測方法不受卡介苗接種的影響，可以區(qū)分結(jié)核分枝桿菌感染與非結(jié)核分枝桿菌感染，診斷結(jié)核分枝桿菌潛伏感染的敏感度為70%～80%，特異度為88%～97%[21]。

1． 干擾素體外釋放酶聯(lián)免疫法：干擾素體外釋放酶聯(lián)免疫法產(chǎn)品目前主要有QuantiFERON-TB (QFT)、QuantiFERON-TB gold (QFT-G)、QuantiFERON-TB gold in-tube(QFT-GIT)、Quanti-FERON-TB gold plus(QFT-G Plus)等檢測產(chǎn)品。QFT是2001年美國食品藥品監(jiān)督管理局(FDA)批準的第一代用于診斷結(jié)核分枝桿菌潛伏感染的IGRA試劑盒，它是利用來自結(jié)核分枝桿菌的PPD刺激全血細胞，檢測活化T細胞分泌產(chǎn)生γ-干擾素。QFT-G是第二代的IGRA試劑盒，刺激全血細胞的PPD換成了結(jié)核分枝桿菌特異性抗原——結(jié)核分枝桿菌早期分泌抗原靶6和培養(yǎng)濾液蛋白10，這些抗原不能被卡介苗和非結(jié)核分枝桿菌編碼，對結(jié)核分枝桿菌的特異性更高。QFT-GIT是第三代IGRA試劑盒，它利用結(jié)核分枝桿菌的早期分泌抗原靶6、培養(yǎng)濾液蛋白-10、特異性抗原TB7.7，去刺激患者免疫T淋巴細胞產(chǎn)生γ-干擾素，對γ-干擾素進行定量測定[22]。QFT-GIT對兒童和成人活動性肺結(jié)核的診斷敏感度與特異度分別為83.9%和88.5%、73.7%和70.4%，QFT-GIT診斷結(jié)核分枝桿菌潛伏感染的敏感度為70%，特異度在未接種卡介苗者為99%，接受卡介苗治療的患者為96%[23]。QFT-G Plus是最新一代IGRA試劑盒，QFT-Plus的新穎之處在于，除了CD4+T細胞外，它還誘導(dǎo)CD8+T細胞產(chǎn)生應(yīng)答，從而比QFT-GIT從T細胞亞群獲得更廣泛的應(yīng)答。它的目的是提高結(jié)核分枝桿菌潛伏感染的檢測，特別是在最近接觸者、免疫功能低下的宿主和幼兒人群中[24]。在治愈肺結(jié)核患者中，QFT-G Plus陽性率為82.0%，高于QFT-GIT(73.0%)。在隱匿性結(jié)核病感染中 QFT-GIT與QFT-G Plus檢測結(jié)果一致性較高。與QFT-GIT相比，QFT-G Plus與結(jié)核病疑似患者的替代指標(biāo)有更強的相關(guān)性。在老年人中，QFT-G Plus檢測結(jié)果比QFT-GIT有更高的敏感度。QFT-G Plus總的敏感度、特異度、陽性似然比、陰性似然比和診斷優(yōu)勢比分別為94%、96%、24.4、0.05和414，ROC曲線下面積為0.99[25]。QFT-GIT和QFT-G Plus在活動性結(jié)核病患者中的敏感度差異在所有研究中都不顯著。在高危人群中，QFT-G Plus和QFT-GIT之間的一致性為89.9%～96.0%，低風(fēng)險人群中QFT-Plus的特異度略低于QFT-GIT[10]。QFT-G Plus對活動性結(jié)核病的聯(lián)合敏感度為94.0%，而對健康人的聯(lián)合特異度為96.0%。結(jié)核分枝桿菌潛伏感染的聯(lián)合敏感度和特異度分別為91.0%和95.0%[26]。

2.干擾素體外酶聯(lián)免疫斑點試驗：酶聯(lián)免疫斑點試驗是用于測定分泌特異性抗體或細胞因子的單個細胞對特異性抗原的應(yīng)答能力及產(chǎn)生應(yīng)答的細胞數(shù)量。常用的酶聯(lián)免疫斑點試驗是T-SPOT.TB試劑盒。在診斷結(jié)核分枝桿菌潛伏感染人群的研究中，QFT-G的敏感度為64.2%，特異度為99.6%，T-SPOT.TB的敏感度為50.0%，特異度為90.6%，TST的敏感度為70.9%，特異度為68.3%，T-SPOT.TB的特異度較高，敏感度較差[27]。 在兒童結(jié)核病的診斷中，T-SPOT.TB敏感度為84.0%，特異度為99.1%，陽性預(yù)測值為93.1%，陰性預(yù)測值為97.8%。T-SPOT.TB診斷肺結(jié)核敏感度顯著高于肺外結(jié)核，同時T-SPOT.TB的敏感度隨著年齡的增長而增加[28]。在診斷血液透析患者的結(jié)核分枝桿菌潛伏感染方面，TST的敏感度為31%，特異度為63%； QFT-G試驗的聯(lián)合敏感度為53%，特異度為69%；T-SPOT.TB的敏感度為50%，特異度為67%[29]。IGRA和TST在兒童、免疫缺陷人群和結(jié)核病高發(fā)國家新移民人群的17項研究中，發(fā)現(xiàn)在兩項兒童研究中，QFT-GIT和TST(≥5 mm)之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義，但其他兩項研究顯示QFT-GIT在識別結(jié)核分枝桿菌潛伏感染方面優(yōu)于TST(≥10 mm)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義；在免疫功能低下者中，IGRA(T-SPOT.TB)在鑒別結(jié)核分枝桿菌潛伏感染患者方面，與TST(≥10 mm)差異無統(tǒng)計學(xué)意義；在結(jié)核病高發(fā)國家新移民人群進行的兩項研究結(jié)果不一致，具有高度異質(zhì)性(表1和表2)[30]。

表1 IGRA與TST在兒童、免疫缺陷人群和結(jié)核病高發(fā)國家新移民人群中活動性結(jié)核病發(fā)病率研究的偏倚風(fēng)險(參考文獻[30])

表2 兒童、免疫缺陷人群和結(jié)核病高發(fā)國家新移民人群中通過結(jié)核分枝桿菌潛伏感染檢測(IGRA與TST)后進展為結(jié)核病(參考文獻[30])

續(xù)表2

(三)IFN-γ/IL-2雙因子試驗

Essone等[31]評價INF-γ/IL-2雙因子試驗在肺結(jié)核的診斷與治療反應(yīng)相關(guān)研究結(jié)果提示，同時檢測結(jié)核分枝桿菌特異性γ-IFN和IL-2水平可能增加活動性結(jié)核病的診斷敏感度。有研究發(fā)現(xiàn)活動性結(jié)核病患者的IFN-γ+IL-2-T 細胞中位頻率和比例顯著高于非活動性結(jié)核病患者，且IFN-γ+IL-2-T 細胞診斷活動性結(jié)核病的受試者工作特征(ROC)曲線下面積為0.788，聯(lián)合IFN-γ+IL-2-T 細胞的頻率和比例診斷活動性結(jié)核病的敏感度從79.7%提高到95.3%，特異度從69.8%提高到83.2%[32-33]。IFN-γ/IL-2雙因子試驗結(jié)果有待進一步的研究驗證。

(四)宿主轉(zhuǎn)錄水平檢測

對血漿中結(jié)核病相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子分析可以對結(jié)核病診斷、鑒別診斷及其治療效果檢測起到一定作用。目前對結(jié)核病的血液轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究發(fā)現(xiàn)干擾素誘導(dǎo)的基因信號在成功治療后表達減少，這有助于改善結(jié)核病的診斷和治療監(jiān)測，這對根除結(jié)核病至關(guān)重要。同時分析各種不同的血液轉(zhuǎn)錄特征，被提議用于結(jié)核病的診斷和無癥狀高危人群的鑒定，并提出了新的方法來開發(fā)這種生物標(biāo)記物用于臨床[34]。Berry等[35]通過轉(zhuǎn)錄芯片技術(shù)對活動性結(jié)核病患者和結(jié)核分枝桿菌潛伏感染者的全血中393種轉(zhuǎn)錄因子水平進行檢測，發(fā)現(xiàn)其與疾病的放射結(jié)果相關(guān)，并在治療后恢復(fù)到健康對照組的水平。同時發(fā)現(xiàn)86種轉(zhuǎn)錄因子水平在活動性結(jié)核病與其他炎癥或感染性患者之間有顯著差異。通過模塊化和通路分析顯示，結(jié)核病的特征是由中性粒細胞驅(qū)動的干擾素誘導(dǎo)的基因譜決定的，包括IFN-γ和Ⅰ型IFN-α信號通路。此研究揭示了Ⅰ型IFN-α信號通路在結(jié)核病發(fā)病機制中的作用，促進結(jié)核病疫苗和治療的發(fā)展，還提供了廣泛的轉(zhuǎn)錄生物標(biāo)志物，有可能作為診斷和預(yù)測結(jié)核病流行的工具[35-36]。結(jié)核病患者和結(jié)核分枝桿菌潛伏感染者的全血微陣列基因研究發(fā)現(xiàn)， FCGRIB、CD64、 LTF、GBP5和顆粒酶A的差異表達最顯著，5個標(biāo)記物聯(lián)合診斷的敏感度為94%，特異度為97%，有利于活動性結(jié)核病和結(jié)核分枝桿菌潛伏感染的鑒別診斷[37]。同時確定了活動性結(jié)核病特有的差異表達基因，及其與結(jié)核病易感性和耐藥性相關(guān)的基因譜。此研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)的基因表達譜有利于更好地理解從潛伏感染到活動性疾病的進展，并為結(jié)核病保護提供方法[37]。在HIV與結(jié)核混合感染患者血液轉(zhuǎn)錄組表達譜中，Kaforou等[38]建立了27個轉(zhuǎn)錄因子集，用于區(qū)分活動性結(jié)核病和結(jié)核分枝桿菌潛伏感染，其敏感度為95%，特異度為90%；44個轉(zhuǎn)錄因子集，用于區(qū)分結(jié)核與其他疾病，其敏感度為93%，特異度為88%。血液轉(zhuǎn)錄因子集能把結(jié)核病從艾滋病病毒感染和未感染人群的其他疾病中區(qū)分出來，未來有可能作為一種適合于HIV流行國家的結(jié)核病檢測方法。結(jié)核病患者中15個宿主基因表達可準確區(qū)分結(jié)核病患者與TST陽性和TST陰性患者，因此有望作為生物標(biāo)志物將埃塞俄比亞的活動性結(jié)核病與結(jié)核分枝桿菌潛伏感染進行分類。當(dāng)ROC曲線臨界值≥0.80時，F(xiàn)CGR1A是區(qū)分結(jié)核分枝桿菌潛伏感染和結(jié)核病的唯一標(biāo)志物，與HIV感染狀況無關(guān)。隨著結(jié)核分枝桿菌的RNA檢測技術(shù)不斷發(fā)展，結(jié)核病診斷準確性和實用性得到不斷拓展[39-40]。

在基于宿主反應(yīng)的結(jié)核病診斷基因meta分析研究[41]發(fā)現(xiàn) 11個培養(yǎng)證實診斷活動性結(jié)核病患者研究的加權(quán)平均ROC曲線下面積>0.80，2個研究的加權(quán)平均ROC曲線下面積為0.60。除2個研究外，其他研究均具有高陰性預(yù)測值(2%患病率時>98%)。除了3個使用培養(yǎng)證實為活動性結(jié)核病研究外，臨床診斷為活動性結(jié)核病的所有研究的加權(quán)平均ROC曲線下面積和特異度降低最小。當(dāng)包括臨床診斷為活動性結(jié)核病的數(shù)據(jù)集時，只有4個研究具有均勻的診斷優(yōu)勢比和較低的假陽性率；其他研究要么具有異質(zhì)的診斷優(yōu)勢比或較高的假陽性率，要么兩者兼有。同時16個基因研究中有7個預(yù)測了痰轉(zhuǎn)換前6個月結(jié)核分枝桿菌潛伏感染到活動性結(jié)核病進展，其陽性預(yù)測值>6%(患病率為2%時)?？傊谒拗鞣磻?yīng)的診斷方法可以準確地識別活動性結(jié)核病患者，并在痰轉(zhuǎn)換前預(yù)測結(jié)核分枝桿菌潛伏感染進展為活動性結(jié)核病的高危個體。診斷組合中增加檢測基因的數(shù)量并不一定提高診斷的準確性。到目前為止，Sweeney團隊篩選的標(biāo)志物組合具有最佳的診斷效能[41]?；谒拗鞣磻?yīng)的結(jié)核病診斷對實現(xiàn)世界衛(wèi)生組織2035年終止結(jié)核病的目標(biāo)方面提供了有力的證據(jù)，并且有利于臨床應(yīng)用 (表3和表4)[41]。結(jié)核分枝桿菌特異性細胞免疫反應(yīng)檢測試劑盒(IP-10.TBTM)是新一代結(jié)核病診斷產(chǎn)品，利用實時熒光PCR 技術(shù)體外檢測全血樣本中經(jīng)結(jié)核特異性抗原刺激前后IP-10 m RNA水平，并據(jù)此判斷人體是否有針對結(jié)核特異性的細胞免疫反應(yīng)[42-43]，檢測性能有待進一步評估和驗證。

表3 應(yīng)用雙變量薈萃分析比較用于診斷活動性結(jié)核病的16個基因特征 (參考文獻[41])

表4 青少年隊列研究中診斷前180天從結(jié)核分枝桿菌潛伏感染進展到活動性結(jié)核病的ROC曲線下面積、陽性預(yù)測值和陰性預(yù)測值 (參考文獻[41])

(五)結(jié)核病宿主反應(yīng)試劑盒

TB Host response試劑盒是通過計算結(jié)核分數(shù)(TB-scores)進行檢測，TB-scores是由Sweeney團隊通過篩選了2572例結(jié)核病患者全血中結(jié)核感染相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子水平發(fā)現(xiàn)的，其定義為TB-scores=(GBP5+DUSP3)/2-KLF2，可用于結(jié)核分枝桿菌潛伏感染和活動性結(jié)核病的鑒別診斷以及治療效果的快速準確監(jiān)測[44]。在結(jié)核病患病率為4%的情況下，TB-scores診斷活動性結(jié)核病方面的敏感度為90%、特異度為70%和陰性預(yù)測值為99.3%，如果結(jié)果為陰性，基本排除是活動性結(jié)核病[45]。目前Xpert MTB Host response試劑盒采用利用這個技術(shù)進行TB-scores計算，該試劑盒采用0.1 ml末梢或采集靜脈血，隨到隨測，可以在30 min完成檢測。該試劑盒在HIV混合結(jié)核感染人群的鑒別診斷方面，其敏感度約為90%，與微生物綜合參考標(biāo)準相比，其特異度為55.8%；與Xpert MTB/RIF相比，其特異度為85.9%。在獨立診斷方面，在該試劑盒的特異度接近95%時，其敏感度為65.7%，而C-反應(yīng)蛋白(C-reactive protein，CRP))的敏感度僅為13.6%[46]。肺結(jié)核患者的TB-scores顯著低于對照組人群，Xpert MTB Host response在區(qū)分肺結(jié)核患者和對照組時，其ROC曲線下面積為0.84；在敏感度為90%時，Xpert MTB Host response的特異度(53.0%)顯著高于CRP(28.1%)。在Xpert MTB/RIF半定量為中或高負荷的肺結(jié)核患者中，Xpert MTB Host response的敏感度較高(96.8%)，而CRP敏感度為90.3%[47]。

Xpert MTB Host response試劑盒的出現(xiàn)，為無痰樣本的疑似結(jié)核病患者在快速篩查、鑒別診斷以及治療監(jiān)測方面提供新的便利的檢測方法，可改善結(jié)核病目前的檢測困境[46]，期待更多地對不同人群及其對肺外結(jié)核患者的不同臨床應(yīng)用的研究成果問世。

二、結(jié)核病宿主反應(yīng)臨床應(yīng)用

雖然標(biāo)本中直接查到結(jié)核分枝桿菌病原學(xué)依據(jù)是診斷結(jié)核病的金標(biāo)準，但是臨床實踐中不是所有結(jié)核病患者都可以獲得來自病灶的標(biāo)本供病原學(xué)檢測，比如肺內(nèi)病變遠離支氣管、比較局限且有完整包膜，病灶與支氣管、氣管不通，痰標(biāo)本中不可能有來源于病灶的結(jié)核分枝桿菌；有些肺外結(jié)核病灶部位特殊，不適于穿刺活檢獲得來自于病灶的標(biāo)本，比如顱內(nèi)結(jié)核瘤。對處于潛伏感染及感染階段的結(jié)核病，菌量少，未形成病灶或病灶較小，低于現(xiàn)有檢查手段的分辨率的下限，臨床檢查未發(fā)現(xiàn)病灶，亦無可供病原學(xué)檢測的標(biāo)本。利用檢測宿主感染結(jié)核分枝桿菌后產(chǎn)生的免疫反應(yīng)，間接證明體內(nèi)結(jié)核分枝桿菌的存在，是臨床診斷結(jié)核病的重要依據(jù)。

(一)結(jié)核病篩查

結(jié)核病經(jīng)呼吸道傳播，排菌的肺結(jié)核患者是傳染源。未經(jīng)有效治療的患者痰標(biāo)本中獲得病原學(xué)診斷依據(jù)就意味著患者作為傳染源已經(jīng)對密切接觸人群造成很大的傳播風(fēng)險。利用宿主對結(jié)核分枝桿菌的免疫反應(yīng)，主動篩查結(jié)核分枝桿菌潛伏感染人群、有/或無結(jié)核中毒癥狀的結(jié)核病疑似患者，做到早期診斷，早期干預(yù)治療，杜絕發(fā)展成為排菌患者(傳染源)無疑是控制結(jié)核病傳播的重要手段。

結(jié)核病篩查分為主動篩查及被動篩查，主動篩查即對無癥狀的高風(fēng)險人群進行定期結(jié)核病相關(guān)檢查，被動篩查為患者出現(xiàn)結(jié)核疑似癥狀(咳嗽、咳痰2周以上或咯血)或發(fā)現(xiàn)可疑結(jié)核病灶，進一步進行結(jié)核病相關(guān)檢查。宿主對結(jié)核分枝桿菌的免疫反應(yīng)相關(guān)檢查方法(TST或IGRA)由于標(biāo)本采集簡單、可行(皮試或靜脈采血)、避免放射檢查方法對特殊人群(15歲以下兒童)造成傷害，成為結(jié)核病篩查的首選方法。根據(jù)《中國結(jié)核病預(yù)防控制工作技術(shù)規(guī)范(2020年版)》要求[48]，在中國疫情背景下需要主動篩查的人群包括：(1)艾滋病病毒感染人群；(2)學(xué)校人群；(3)流動人口；(4)病原學(xué)陽性肺結(jié)核患者密切接觸者，尤其是5歲以下兒童；(5)老年人；(6)糖尿病患者； (7)羈押人群；(8)其他人群：需使用腫瘤壞死因子治療、長期應(yīng)用透析治療、準備做器官移植或骨髓移植者、矽肺患者以及長期應(yīng)用糖皮質(zhì)激素或其他免疫抑制劑的患者。需要特別注意的是對于存在免疫抑制的患者，宿主對結(jié)核分枝桿菌的免疫反應(yīng)亦可能受到抑制而出現(xiàn)假陰性的情況，臨床需要結(jié)合患者流行病學(xué)史、癥狀、其他檢查情況等綜合判斷。

(二)區(qū)分活動性結(jié)核病與結(jié)核分枝桿菌潛伏感染

結(jié)核分枝桿菌潛伏感染及活動性結(jié)核病是結(jié)核病發(fā)生、發(fā)展的不同階段，宿主對結(jié)核分枝桿菌的免疫反應(yīng)處于不同的狀態(tài)。Petruccioli等[49]研究者納入57例受試者，其中27例活動性結(jié)核病患者、 30例結(jié)核分枝桿菌潛伏感染者，通過流式細胞儀及細胞染色，對QFT-Plus管中結(jié)核分枝桿菌抗原產(chǎn)生反應(yīng)的特異性CD4+T細胞進行檢測，結(jié)果顯示在活動性結(jié)核病和結(jié)核分枝桿菌潛伏感染患者中檢測到特異性的CD4+T細胞反應(yīng)，而特異性的CD8+T細胞應(yīng)答主要與活動性結(jié)核病相關(guān)。在潛伏感染和活動性肺結(jié)核中CD4+T和CD8+T細胞對結(jié)核分枝桿菌特異性抗原刺激后應(yīng)答的差異，可能成為區(qū)分潛伏感染和活動性結(jié)核病的標(biāo)志，但上述結(jié)論尚缺乏大規(guī)模人群的臨床驗證。目前已經(jīng)上市的產(chǎn)品尚未獲得有效區(qū)分結(jié)核分枝桿菌潛伏感染和活動性結(jié)核病的適應(yīng)證。

(三)療效監(jiān)測

經(jīng)過有效治療后的結(jié)核病患者，一方面體內(nèi)結(jié)核分枝桿菌的負荷量發(fā)生了明顯的變化，另一方面隨著菌量下降，患者結(jié)核中毒癥狀、營養(yǎng)狀態(tài)發(fā)生了很大變化，機體的免疫狀態(tài)也發(fā)生了變化。雖然痰菌陰轉(zhuǎn)率是肺結(jié)核治療轉(zhuǎn)歸的金標(biāo)準，但是不適用于不排菌狀態(tài)的臨床診斷肺結(jié)核患者；雖然影像可以形象地顯示病灶轉(zhuǎn)歸，但是需要有經(jīng)驗的醫(yī)生判斷，臨床急需要一種簡單易行的檢測方法觀察療效。Lee等[50]招募了336名(例)參與者(118名無感染接觸者，105名結(jié)核分枝桿菌潛伏感染者，113例活動性肺結(jié)核)，以QFT-Plus檢測的CD8應(yīng)答在未感染接觸者、結(jié)核分枝桿菌潛伏感染接觸者和活動性結(jié)核病之間不同且呈遞增的趨勢；CD8應(yīng)答在培養(yǎng)確診的活動性結(jié)核病患者中高于組織確診的活動性結(jié)核病患者。作者結(jié)論為通過動態(tài)監(jiān)測CD8特異性淋巴細胞的反應(yīng)，有望作為一個結(jié)核病活動程度的潛在生物標(biāo)志物。目前宿主免疫反應(yīng)標(biāo)志物在療效監(jiān)測的應(yīng)用尚缺乏大規(guī)模隊列研究的支持。

(四) 特殊人群的輔助診斷

免疫缺陷患者、器官移植患者、HIV感染者由于機體免疫系統(tǒng)受到抑制，成為結(jié)核病易感高危人群，一旦感染結(jié)核分枝桿菌易發(fā)展成為重癥結(jié)核病，在HIV感染者中，并發(fā)結(jié)核病成為主要致死原因。利用宿主免疫反應(yīng)早期診斷結(jié)核病、早期給予有效治療是改善免疫抑制人群合并結(jié)核感染預(yù)后的重要手段。宿主免疫反應(yīng)是利用機體特異性淋巴細胞對結(jié)核分枝桿菌特異性蛋白的識別來實現(xiàn)的，雖然機體存在的免疫抑制情況影響了體內(nèi)免疫反應(yīng)(TST)結(jié)果，但對于采用體外免疫反應(yīng)的IGRA試驗，由于采用淋巴細胞體外分離培養(yǎng)技術(shù)，避免了體內(nèi)免疫抑制狀態(tài)對檢測結(jié)果的影響。而基于ELISPOT 技術(shù)由于在檢測過程中對單個核細胞數(shù)量進行了標(biāo)準化，消除了淋巴細胞減少對檢測結(jié)果的影響，更適用于CD4+T細胞減少人群。2011年Cattamanchi等[51]的meta分析結(jié)果為在HIV感染人群中宿主免疫反應(yīng)診斷結(jié)核感染的敏感度，T-SPOT.TB為 72%(95%CI： 62%～81%)， QFT-GIT 為61%(95%CI： 41%～75%)，兩種體外免疫檢測方法均優(yōu)于TST。Jiang等[52]觀察到在中國BCG普遍接種的背景下，在HIV感染人群中當(dāng)CD4+T細胞<500/μl時，T-SPOT.TB和TST診斷活動性結(jié)核病的敏感度分別為64.5%和22.6%，診斷結(jié)核分枝桿菌潛伏感染的敏感度為 62.2%和29.7%；Petruccioli等[53]研究者在HIV感染并發(fā)結(jié)核病及單純結(jié)核病患者中觀察到以QFT-Plus檢測方法診斷結(jié)核感染的敏感度分別為81.8%和86.8%。在免疫抑制人群中，宿主免疫反應(yīng)為早期診斷結(jié)核感染的重要手段，其中體外宿主免疫反應(yīng)檢測方法優(yōu)于體內(nèi)免疫反應(yīng)檢測方法；在判讀宿主免疫反應(yīng)檢測結(jié)果時需要結(jié)合臨床癥狀、檢測方法和患者的免疫背景。

三、總結(jié)與展望

TST一直用于識別結(jié)核分枝桿菌潛伏感染的風(fēng)險人群，但TST的敏感度和特異度較低，受其他因素干擾，存在較多的假陽性結(jié)果。目前IGRA試驗主要應(yīng)用于診斷結(jié)核分枝桿菌潛伏感染和區(qū)分結(jié)核分枝桿菌感染與其他結(jié)核分枝桿菌感染，其敏感度和特異度比TST有較大提高，但是在區(qū)分活動性結(jié)核病和潛伏感染者方面診斷價值有限。結(jié)核病患者的確診需要依賴傳統(tǒng)病原學(xué)檢測技術(shù)，但其對菌陰結(jié)核病應(yīng)用的局限性明顯，基于新方法或者新型標(biāo)志物的診斷策略將成為菌陰結(jié)核病實驗室診斷的主要突破方向。近年來，人們對于結(jié)核與人體免疫系統(tǒng)互作機制認識的不斷深入，篩選出多個結(jié)核感染特異性的宿主免疫標(biāo)志物，基于這些標(biāo)志物的聯(lián)合應(yīng)用可以準確鑒別診斷活動性結(jié)核病。但與傳統(tǒng)病原學(xué)檢測方法存在差異，增加宿主基因轉(zhuǎn)錄因子的數(shù)目并不與診斷準確性成正比，如何在符合成本-效益的前提下優(yōu)選適宜的宿主標(biāo)志物組合是未來開發(fā)平臺技術(shù)的核心；其次，基于宿主的診斷技術(shù)需要細胞純化及核酸檢測等步驟，限制了其在基層的使用，開發(fā)自動化的分子檢測平臺將是研究的首要任務(wù)；再次，目前診斷主要針對活動性結(jié)核病患者開展，利用宿主免疫應(yīng)答水平及時預(yù)測結(jié)核分枝桿菌潛伏感染向活動性結(jié)核病進展的危險程度是實現(xiàn)對潛伏感染者精準干預(yù)的基礎(chǔ)；第四，應(yīng)用基于宿主的免疫診斷標(biāo)志物依賴于對結(jié)核宿主互作的機制解析，但部分宿主因子對抗結(jié)核的作用機制尚不明晰，成為未來潛在的研究方向?？傊?，基于宿主反應(yīng)的結(jié)核病診斷技術(shù)有望在臨床上達到進一步的應(yīng)用，并為實現(xiàn)世界衛(wèi)生組織在2035年提出的全球消滅結(jié)核病的宏偉目標(biāo)發(fā)揮重要作用。