鴨坦布蘇病毒病RT-PCR檢測方法的建立

元正菊，王巧萍、2，張信艷、3，嚴(yán)紅亞，李珂，趙蓉，常志順，王傳禹，信愛國*

(1.云南省畜牧獸醫(yī)科學(xué)院養(yǎng)禽與禽病研究所，云南 昆明 650224；2.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，云南 昆明 650201； 3.水富市畜牧獸醫(yī)技術(shù)推廣站，云南 水富 657800)

鴨坦布蘇病是由鴨坦布蘇病毒(Duck tembusu virus, DTMUV)感染蛋鴨和種鴨的一種新發(fā)傳染病。該病可感染不同品種的鴨，患病鴨采食量、產(chǎn)蛋量急劇下降，剖檢可見出血性卵巢炎。該病自2010年在中國發(fā)生以來，傳播迅速，是危害養(yǎng)鴨業(yè)較嚴(yán)重的傳染病之一[1]。2019年在云南省宜良縣某種鴨場發(fā)現(xiàn)疑似病例，患病鴨表現(xiàn)站立不穩(wěn)、癱瘓等神經(jīng)癥狀；剖檢可見卵巢充血、出血，卵泡變性、破裂，脾臟腫大，后經(jīng)云南省畜牧獸醫(yī)科學(xué)院養(yǎng)禽與禽病研究所確診為鴨坦布蘇病毒感染所致[2]。目前，該病在云南省主要水禽養(yǎng)殖區(qū)域傳播的風(fēng)險(xiǎn)極高，建立快速、準(zhǔn)確的病原檢測技術(shù)，實(shí)施DTMUV病原監(jiān)測，對(duì)防控該病具有重要意義。

DTMUV基因組為單股正鏈RNA病毒，大小約為10 990 nt，包含一個(gè)開放讀碼框(ORF)，編碼3種結(jié)構(gòu)蛋白(核衣殼蛋白C、膜蛋白PrM/M和包膜蛋白E)和7種非結(jié)構(gòu)蛋白(NS1、NS2A、NS2B、NS3、NS4A、NS4B、NS5)[3]。目前，常規(guī) RT-PCR 方法檢測DTMUV的報(bào)道中，主要參照黃病毒科黃病毒屬的NS5基因[4]或E蛋白基因[5]片段序列設(shè)計(jì)引物，或者針對(duì)DTMUV的E蛋白基因[6-8]片段設(shè)計(jì)引物建立檢測方法。病毒E蛋白是病毒的重要毒力蛋白，也是重要的免疫原性蛋白，能誘導(dǎo)產(chǎn)生中和抗體[9]，NS5 為黃病毒中最保守的非結(jié)構(gòu)蛋白，具有RNA依賴的 RNA 聚合酶活性。

在云南水禽主要養(yǎng)殖區(qū)，臨床診斷結(jié)合病例剖檢發(fā)現(xiàn) DTMUV 疑似病例，但臨床上需與其他疫病鑒別診斷。為了解云南地區(qū) DTMUV 感染流行情況，參閱已有的DTMUV快速檢測方法以及分子流行病學(xué)研究文獻(xiàn)，針對(duì)DTMUV建立RT-PCR檢測方法，并應(yīng)用于云南鴨臨床樣品的診斷檢測研究。

1 材料與方法

1.1 病毒株

鴨坦布蘇病毒YN2019株BHK-21細(xì)胞適應(yīng)毒由本研究所分離保存。新城疫病毒( Newcastle disease virus，NDV) 、減蛋綜合征病毒( Chicken egg down syndrome virus，EDSV) 、I型和III型鴨肝炎病毒 ( Duck hepatitis virus，DHV) 、傳染性法氏囊病毒( Infectious bursal disease virus，IBDV) 、禽腺病毒(Fowl adenovirus，F(xiàn)AdV)均由本研究所提供，H5/H7/H9亞型禽流感病毒( Avian influenza virus，AIV)滅活抗原購買于華南農(nóng)大生物藥品有限公司。

1.2 引物

根據(jù)已發(fā)表的DTMUV NS5蛋白基因序列，采用Vector NTI 8.0序列分析軟件做對(duì)比分析，利用 Primer 5.0 軟件自主設(shè)計(jì)了1 對(duì)針對(duì)NS5基因的檢測引物；同時(shí)，參考文獻(xiàn)[10]合成1對(duì)針對(duì)DTMUV E蛋白的檢測引物作為平行檢測引物，建立同時(shí)針對(duì)E基因和NS5基因的檢測體系。引物序列見表1。引物由碩擎生物科技有限公司合成。稀釋成工作濃度( 10 pmol/L)-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

表1 DTMUV引物信息表

1.3 病毒核酸提取

采用寶生物工程(大連)有限公司生產(chǎn)的病毒RNAiso Plus試劑提取DTMUV及其他病毒RNA；按照TaKaRa MiniBEST Viral RNA/DNA Extraction Kit說明書分別提取EDSV和FAdV的DNA，-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 RT-PCR方法的建立

采用寶生物工程(大連)有限公司生產(chǎn)的PrimeScriptTMOne Step RT-PCR Kit 建立一步RT-PCR方法檢測DTMUV。RT-PCR反應(yīng)總體系50μL，包括PrimeScript OneStep Enzyme Mix 2.0 μL，2× OneStep Buffer(Dye plus) 25.0μL,上下游引物各1.0μL，Total RNA 2.0μL，RNase-free ddH2O 19.0μL。反應(yīng)程序?yàn)椋?0℃逆轉(zhuǎn)錄30min，94℃預(yù)變性2min；94℃變性30s，56℃退火30s，72℃延伸30s，共進(jìn)行 35個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸15min，4℃冷卻。PCR結(jié)束后取5μL擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1.5% 瓊脂糖凝膠100V電泳30min,然后用凝膠成像系統(tǒng)觀察結(jié)果。

1.5 特異性實(shí)驗(yàn)

用確定的最佳條件分別對(duì)陽性對(duì)照及其他相關(guān)的幾種病毒進(jìn)行RT-PCR檢測，評(píng)價(jià)擴(kuò)增DTMUV的特異性。同時(shí)膠回收陽性樣品718bp的擴(kuò)增產(chǎn)物條帶送測序，結(jié)果提交NCBI網(wǎng)站，用Blast n 程序在線比對(duì)分析，驗(yàn)證其特異性。

1.6 敏感性實(shí)驗(yàn)

將提取的DTMUV-YN2019株細(xì)胞毒RNA測定濃度后，10倍梯度連續(xù)稀釋，按上述RT-PCR方法進(jìn)行擴(kuò)增，測定模板最低檢出量，判定該方法的敏感性。

1.7 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)

用建立的RT-PCR檢測方法對(duì)YN2019株細(xì)胞毒和1份DTMUV陽性樣品重復(fù)檢測3次，以驗(yàn)證本方法的重復(fù)性和穩(wěn)定性。

1.8 臨床樣品的檢測

將云南不同地區(qū)養(yǎng)鴨場收集的20份產(chǎn)蛋下降臨床疑似樣品，每份取約5.0g剪碎后加入4倍體積的PBS(pH7.2)研磨，反復(fù)凍融3次后，離心取上清提取總RNA，進(jìn)行DTMUV的RT-PCR方法檢測，并對(duì)部分樣品的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測序驗(yàn)證。

2 結(jié)果與分析

2.1 RT-PCR擴(kuò)增條件及產(chǎn)物

以DTMUV-YN2019株細(xì)胞毒提取的病毒RNA為模板，進(jìn)行一步法 RT-PCR擴(kuò)增，經(jīng)優(yōu)化的退火溫度為56℃，引物濃度為10pmol/μL，擴(kuò)增35個(gè)循環(huán)。針對(duì)NS5設(shè)計(jì)的引物能成功擴(kuò)增出718bp大小的預(yù)期目的片段，與針對(duì)E基因擴(kuò)增出483bp片段檢測結(jié)果一致(圖1)。

A. NS5基因片段擴(kuò)增結(jié)果。M.DL2000 Marker; 1.陰性對(duì)照;2-4. DTMUV細(xì)胞毒擴(kuò)增結(jié)果; 5.空白對(duì)照。B.E基因片段擴(kuò)增結(jié)果。M.DL2000 Marker; 1-3.DTMUV細(xì)胞毒擴(kuò)增結(jié)果。

2.2 特異性實(shí)驗(yàn)分析

本研究建立的RT-PCR 對(duì)DTMUV可擴(kuò)增出718bp的目的條帶，而對(duì)NDV、AIV(H5、H7、H9抗原)、EDSV、DHV、IBDV、FAdV則無擴(kuò)增條帶，陽性樣品718bp的擴(kuò)增產(chǎn)物條帶經(jīng)膠回收、測序，結(jié)果用NCBI網(wǎng)站的Blast n 程序在線比對(duì)分析，表明該核酸序列源于DTMUV基因組，說明該方法具有極高的特異性。

2.3 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)分析

經(jīng)過3次重復(fù)檢測，試驗(yàn)結(jié)果完全一致，說明本研究建立的方法穩(wěn)定性較好。

2.4 敏感性實(shí)驗(yàn)分析

將提取的YN2019細(xì)胞毒 RNA(濃度為32.4ng/μL) 連續(xù)10倍稀釋后進(jìn)行RT-PCR檢測，結(jié)果見圖2。檢出的最低稀釋度為1×10-3，則其敏感度為3.24pg/μL。

M.DL2000 Marker ; 1.1×100;

2.5 臨床樣品檢測結(jié)果

將云南不同地區(qū)養(yǎng)鴨場收集的20份產(chǎn)蛋下降臨床疑似樣品提取RNA后進(jìn)行RT-PCR方法檢測，結(jié)果測定為陽性的有10份，其陽性率為50%，10個(gè)擴(kuò)增產(chǎn)物的測序結(jié)果與NS5基因序列(登錄號(hào)為KJ958533)的同源性為100%。

3 討論

DTMUV是最近10年在我國開始傳播的一種新發(fā)傳染病，主要危害鴨和鵝，給養(yǎng)殖戶帶來極大損失，所以該病的檢測和預(yù)防極其重要。該病多發(fā)生于產(chǎn)蛋鴨群，表現(xiàn)為鴨群突然出現(xiàn)采食下降，隨后產(chǎn)蛋量急劇下降，剖檢病鴨可見明顯的卵泡出血和變性。在臨床實(shí)踐中，首先排除由于環(huán)境、飼料、藥物以及飼養(yǎng)管理因素和其他可引起鴨產(chǎn)蛋量急劇下降的傳染性疾病，如禽流感和新城疫，出現(xiàn)疑似鴨坦布蘇病毒感染癥狀的時(shí)候，快速診斷是及早發(fā)現(xiàn)并阻斷該病毒暴發(fā)的重要手段。

本研究針對(duì)DTMUV建立的一步法RT-PCR檢測技術(shù)能特異性地?cái)U(kuò)增出718bp的序列，對(duì)BHK-21細(xì)胞毒和田間樣品均能檢出DTMUV，且僅能檢出DTMUV，對(duì)其他鴨病(I型和III型鴨肝炎病毒、鴨新城疫病毒、H5/H7/H9亞型禽流感病毒抗原、減蛋綜合征病毒、禽腺病毒)則無法檢出，說明本方法特異性良好；同一樣品多次檢測的結(jié)果都是一致的，表明重復(fù)性和穩(wěn)定性良好；能檢出最低病毒含量為3.24pg/μL，表明該方法敏感性良好；在4 h之內(nèi)可完成全部檢測過程；應(yīng)用本研究建立的RT-PCR方法對(duì)20 份臨床可疑樣本進(jìn)行檢測，檢出的陽性為10 份，其陽性率為50%，表明該方法可應(yīng)用于臨床檢測。2019年，DTMUV僅在云南省部分地區(qū)零星散在發(fā)生，但是本實(shí)驗(yàn)中檢出陽性率為50%，表明該病在云南省有擴(kuò)大傳播范圍的趨勢。本研究建立的一步法RT-PCR方法具有靈敏、快速、穩(wěn)定、特異性強(qiáng)的優(yōu)點(diǎn)，對(duì)DTMUV的臨床診斷和防控具有參考價(jià)值，可為后續(xù)的流行病學(xué)調(diào)查提供技術(shù)手段。云南地區(qū)的水禽養(yǎng)殖戶應(yīng)對(duì)該病引起重視，及時(shí)采取防控措施，避免因感染鴨坦布蘇病毒而造成經(jīng)濟(jì)損失。