淡水魚華支睪吸蟲囊蚴LAMP檢測方法的建立

朱海，汪奇志，孫成松，尹曉梅，汪峰峰，金郁，張世清

安徽省血吸蟲病防治研究所，安徽 合肥 230601

近年來，隨著經(jīng)濟社會的發(fā)展以及人民群眾飲食方式的變化，食源性寄生蟲病已成為不容忽視的公共衛(wèi)生問題[1-2]，尤其作為重要食源性寄生蟲病之一的華支睪吸蟲病正嚴重危害著人民群眾的身體健康[3]。2015年起，淡水魚養(yǎng)殖、銷售和餐飲環(huán)節(jié)監(jiān)測被列入國家食品安全風險監(jiān)測工作，其主要內(nèi)容為監(jiān)測淡水魚華支睪吸蟲囊蚴的感染情況。目前，華支睪吸蟲囊蚴的檢測主要依靠胃蛋白酶消化-解剖鏡鏡檢法(以下簡稱消化鏡檢法)和PCR法，但基于囊蚴形態(tài)學特征鑒別的消化鏡檢法需要檢驗人員具有一定的檢測能力和工作經(jīng)驗，存在漏檢、誤判等問題。PCR法因其敏感性高、特異性強能彌補消化鏡檢法的不足[4-5]，但受實驗室環(huán)境及儀器設備等方面的限制，難以廣泛應用于現(xiàn)場。作為一種新興的分子生物學技術，近年來環(huán)介導等溫擴增技術(LAMP)在科學研究和現(xiàn)場防治工作中越來越多地應用于各種病原體的檢測[6-8]，在食品安全風險監(jiān)測的一些領域中也已逐步得到應用[9-10]。本研究以華支睪吸蟲ITS2基因序列為靶序列合成引物，基于LAMP技術建立了便捷、靈敏的淡水魚華支睪吸蟲囊蚴檢測方法。

1 材料與方法

1.1樣本來源 結合淡水魚養(yǎng)殖、銷售和餐飲環(huán)節(jié)華支睪吸蟲監(jiān)測項目，通過消化鏡檢法收集華支睪吸蟲囊蚴樣本及其他吸蟲囊蚴樣本。華支睪吸蟲成蟲由中山大學提供，日本血吸蟲成蟲、帶絳蟲成蟲及蛔蟲蟲卵樣本由安徽省血吸蟲病防治研究所提供。

1.2主要試劑和儀器 TIANamp Genomic DNA Kit試劑盒，2×Taq PCR Master Mix(Cat#PT102-02)購自上海萊楓生物科技有限公司，100 bp DNA marker購自上海賽百盛基因技術有限公司，胃蛋白酶購自國藥集團化學試劑有限公司。其他儀器:DNA/蛋白質分析儀(Quawell)、基因擴增儀(C1000 Touch Thermal Cycler，Bio-Rad)、水平電泳儀(Mupid-2 plus，Advance)、凝膠成像系統(tǒng)(Universal Mood，Bio-Rad)、超微量分光光度計(P360，Implen)。

1.3實驗方法

1.3.1基因組DNA的制備 使用TIANamp Genomic DNA Kit試劑盒提取華支睪吸蟲嚢蚴及華支睪吸蟲成蟲、日本血吸蟲成蟲、帶絳蟲成蟲、蛔蟲蟲卵樣本DNA，并用超微量分光光度計對DNA樣本的濃度進行測定備用。

1.3.2引物設計及篩選 根據(jù)華支睪吸蟲核糖體第二內(nèi)轉錄間隔區(qū)(ITS2)基因序列設計三組LAMP法的引物體系，見表1。

1.3.3反應體系及質控體系的建立 LAMP反應體系為25 μL。分別加入適量的2×反應緩沖液(RM)、FIP、BIP、Loop-F※6、Loop-B※6、F3、B3、Bst DNA聚合酶、LoopampR熒光目測檢測試劑、去離子水(DW)及待測DNA模板。反應條件：溫度為63～65 ℃，時間為30～60 min。結果判斷：陽參出現(xiàn)顯色反應后(反應管由黃色變?yōu)榫G色)，80 ℃/10 min終止反應，觀察其他標本是否有顯色反應。

LAMP質控體系為25 μL。各組分用量:2×反應緩沖液(RM)12.5 μL，質控引物溶液DNA(PM DNA)2.5 μL，Bst DNA聚合酶1 μL，LoopampR熒光目測檢測試劑1 μL，去離子水(DW)6 μL，質控陰參或陽參DNA 2 μL。反應條件及結果判斷和LAMP樣本反應體系一致。當質控體系陰參或陽參反應結果正常時，反應體系結果才有效。

1.3.4三組不同引物體系的LAMP法特異度及靈敏度驗證 以華支睪吸蟲成蟲DNA樣本和雙蒸水為LAMP反應體系的陽參及陰參，以華支睪吸蟲囊蚴、日本血吸蟲成蟲、帶絳蟲成蟲及蛔蟲蟲卵DNA樣本及其他吸蟲囊蚴DNA樣本作為參考，分別使用Cs-1、Cs-2、Cs-3三組引物體系進行LAMP特異度驗證，并對比三組引物體系。

將華支睪吸蟲成蟲DNA樣本(DNA濃度為3.33 ng/μL)連續(xù)10倍稀釋，稀釋后的濃度范圍為3.33～3.33×10-7ng/μL，以雙蒸水為陰性對照，對三組引物體系進行LAMP法靈敏度驗證。

1.3.5PCR擴增檢測 PCR引物序列參照《魚華支睪吸蟲囊蚴鑒定方法》(SN/T 2975-2011)，上游引物為5′-CGAGGGTCGGCTTATAAAC-3′；下游引物為5′-GGAAAGTTAAGCACCGACC-3′。PCR擴增反應體系為50 μL：DNA模板5 μL，上、下游引物各1 μL(20 μmol/L)，10×PCR緩沖液5 μL，MgCl25 μL(25 mmol/L)，dNTPs 1 μL(25 mmol/L)，Taq酶1 μL(5 U/μL)，加滅菌后的超純水補足。反應條件：94 ℃ 3 min，94 ℃ 40 s，62℃ 30 s，72 ℃ 30 s，共40個循環(huán)；72 ℃ 10 min，4 ℃保存。電泳分析：取6 μL擴增產(chǎn)物和2 μL樣本緩沖液在2%瓊脂糖平板上進行電泳，利用凝膠成像系統(tǒng)觀察擴增產(chǎn)物并成像，產(chǎn)物長度為315 bp[6-8]。

1.4數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析 計算LAMP檢測華支睪吸蟲囊蚴的敏感性和特異性。敏感性和特異性的計算公式為：敏感性(%)=[真陽性數(shù)/(真陽性數(shù)+假陰性數(shù))]×100%，特異性(%)=[真陰性數(shù)/(真陰性數(shù)+假陽性數(shù))×100%]。采用Primer 5.0分析軟件對敏感性和特異性進行χ2檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1三組引物體系LAMP法特異度及靈敏度比較

2.1.1三組引物體系LAMP法特異度比較 通過消化鏡檢法收集6份華支睪吸蟲囊蚴及7份其他吸蟲囊蚴，連同華支睪吸蟲成蟲、日本血吸蟲成蟲、帶絳蟲成蟲及蛔蟲蟲卵，使用三組引物體系進行LAMP法檢測，結果顯示：Cs-1引物體系中陰、陽性體系參考，華支睪吸蟲成蟲DNA和雙蒸水樣本都顯色正常，6份華支睪吸蟲囊蚴樣本中4份呈陽性顯色反應(包括1個弱陽性)，血吸蟲成蟲等其余樣本為陰性不顯色反應；Cs-2引物體系中陰、陽性體系參考，華支睪吸蟲成蟲DNA和雙蒸水樣本都顯色正常，6份華支睪吸蟲囊蚴樣本全部呈陽性顯色反應(包括2個弱陽性)，血吸蟲成蟲等其余樣本為陰性不顯色反應；Cs-3引物體系中陰、陽性體系參考及華支睪吸蟲成蟲DNA樣本和雙蒸水樣本都顯色正常，6份華支睪吸蟲囊蚴樣本全部呈陽性顯色反應(包括1個弱陽性)，血吸蟲成蟲等其余樣本為陰性不顯色反應。見圖1。

2.1.2三組引物體系LAMP法靈敏度比較 Cs-1引物體系的最低檢出濃度為3.33×10-2ng/μL，Cs-2和Cs-3引物體系的最低檢出濃度為3.33×10-4ng/μL。見圖2。

2.1.3確定引物體系 通過對三組引物體系LAMP法特異度及靈敏度比較，最終確定Cs-3引物體系為本法的引物體系。

2.2LAMP法的檢測效果評價 將通過消化鏡檢法確認的16份華支睪吸蟲囊蚴樣本及23份其他吸蟲囊蚴樣本，分別用PCR法和LAMP法平行檢測。檢測結果對比發(fā)現(xiàn)，LAMP法和PCR法的敏感性和特異性各均為100%，差異無統(tǒng)計學意義，見圖3。

3 討 論

人主要通過生吃或半生吃淡水魚(蝦)而感染華支睪吸蟲，麥穗魚、棒花魚等是我國最主要的華支睪吸蟲第二中間宿主[11]。有研究表明，淡水魚華支睪吸蟲的感染情況受到當?shù)厮盗饔蚍植继攸c、自然氣候條件、環(huán)境衛(wèi)生狀況、生活飲食習慣等多方面因素的影響[12]。安徽地區(qū)水系充足，氣候濕潤，居民集南北生活飲食習慣，具備華支睪吸蟲病流行的條件。為此，2015年起安徽省被列為魚源性寄生蟲病監(jiān)測地區(qū)之一。確定第二中間宿主—淡水魚(蝦)是否感染華支睪吸蟲是防治華支睪吸蟲病的重要環(huán)節(jié)。雖然目前PCR及其衍生技術在華支睪吸蟲(囊蚴)檢測中已經(jīng)得到廣泛使用，但PCR法需要在特定的實驗室完成，對儀器有一定要求，并且從中間宿主體內(nèi)提取滿足PCR檢測要求的一定濃度及純度的DNA仍然比較困難[13-14]。

注：-為陰參；+為陽參；1～8均為華支睪吸蟲成蟲DNA樣本，樣本濃度分別為3.33、3.33×10-1 、3.33×10-2 、3.33×10-3 、3.33×10-4 、3.33×10-5 、3.33×10-6 、3.33×10-7 ng/μL。

注：A為PCR法,B為LAMP法,-為陰參；+為陽參；1、2、4、7、8為華支睪吸蟲囊蚴,3、5、6為其他吸蟲囊蚴。

本研究通過特異度及敏感度試驗比較，最終確定Cs-3引物體系作為LAMP法的反應體系。Cs-3引物體系與Cs-1及Cs-2引物體系相比多出一組LB的環(huán)引物，在鏈式反應開始后對反應產(chǎn)物的穩(wěn)定性起到了很好的作用，同時也進一步減少了反應體系中其他DNA碎片的干擾。LAMP法與PCR法檢測的敏感性和特異性均為100%，但LAMP法更適用于低濃度的DNA檢測，相對于PRC法對儀器有一定要求，LAMP法僅需要恒溫水浴箱，因此LAMP法更適合在監(jiān)測現(xiàn)場及基層工作時使用，配合LAMP法專用的便攜式擴增儀，可以進一步確保結果的準確性。

盡管目前也有FTA-PCR法和RAA法運用于淡水魚華支睪吸蟲囊蚴檢測的相關報道[15-16]，但與這類方法相比，LAMP法的運用更為成熟、廣泛，且已經(jīng)形成了規(guī)范化的質控體系[17-18]，便于反應體系的優(yōu)化以及排除誤差。但LAMP法依然存在不足，比如樣本必須經(jīng)過長時間消化后才能進行DNA的提取，且比消化鏡檢法耗時長。有文獻[19-20]報道使用LAMP法檢測人類糞便等樣本時，已經(jīng)能夠縮短用時，提高檢測效率，這也是筆者今后的研究方向。

綜上所述，本研究成功建立了一種基于ITS2基因序列的淡水魚中華支睪吸蟲囊蚴LAMP檢測方法，本法敏感性高，特異性強，操作便捷，在寄生蟲病監(jiān)測和現(xiàn)場工作中具有較高應用價值。