基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)及斑馬魚模型的瓜蔞薤白半夏湯干預(yù)慢性阻塞性肺疾病的作用機(jī)制研究

談曉瑩，李 丹，劉 培，馮偉萌，武文星，劉嘉慶，宿樹蘭，郭 盛，尚爾鑫，張黃琴，段金廒

? 藥理與臨床 ?

基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)及斑馬魚模型的瓜蔞薤白半夏湯干預(yù)慢性阻塞性肺疾病的作用機(jī)制研究

談曉瑩，李 丹，劉 培*，馮偉萌，武文星，劉嘉慶，宿樹蘭，郭 盛，尚爾鑫，張黃琴，段金廒*

南京中醫(yī)藥大學(xué) 江蘇省方劑高技術(shù)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇省方劑研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇省中藥資源產(chǎn)業(yè)化過程協(xié)同創(chuàng)新中心，中藥資源產(chǎn)業(yè)化與方劑創(chuàng)新藥物國家地方聯(lián)合工程研究中心，江蘇 南京 210023

基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法和斑馬魚模型探討瓜蔞薤白半夏湯干預(yù)慢性阻塞性肺疾?。╟hronic obstructive pulmoriary disease，COPD）的潛在作用機(jī)制。運(yùn)用中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫與分析平臺（TCMSP）、中醫(yī)藥百科全書數(shù)據(jù)庫（ETCM）、中醫(yī)藥綜合數(shù)據(jù)庫（TCMID）以及國內(nèi)外相關(guān)文獻(xiàn)檢索瓜蔞薤白半夏湯的主要活性成分，通過TCMSP和SwissTargetPrediction數(shù)據(jù)庫預(yù)測靶點(diǎn)；通過GeneCards數(shù)據(jù)庫、在線人類孟德爾遺傳數(shù)據(jù)庫（OMIM）和TCMSP數(shù)據(jù)庫獲取COPD相關(guān)靶點(diǎn)，并采用交集法篩選出與瓜蔞薤白半夏湯活性成分作用的共同靶點(diǎn)。運(yùn)用Cytoscape 3.7.1軟件構(gòu)建“中藥-活性成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)，通過String數(shù)據(jù)庫構(gòu)建蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用（protein-protein interaction，PPI）網(wǎng)絡(luò)；通過DAVID數(shù)據(jù)庫對共有基因進(jìn)行基因本體（gene ontology，GO）功能富集分析及京都基因與基因組百科全書（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）通路富集分析；借助斑馬魚炎癥模型對篩選的靶點(diǎn)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。瓜蔞薤白半夏湯共篩選出成分955個(gè)，潛在活性成分106個(gè)，核心活性成分如芹菜素、茴香酸、美迪紫檀素、金圣草黃素、香葉木素等74個(gè)，對應(yīng)靶點(diǎn)1134個(gè)；PPI網(wǎng)絡(luò)分析獲得瓜蔞薤白半夏湯干預(yù)COPD的關(guān)鍵作用靶點(diǎn)408個(gè)，包括碳酸酐酶9（carbonic anhydrase 9，CA9）、前列腺素內(nèi)過氧化物合酶1（prostaglandin-endoperoxide synthase 1，PTGS1）、胰島素（insulin，INS）、白細(xì)胞介素-6（interleukin-6，IL-6）、絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶1（serine/threonine protein kinase 1，AKT1）、腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）、絲裂原活化蛋白激酶1（mitogen-activated protein kinase 1，MAPK1）、MAPK3、血管內(nèi)皮生長因子A（vascular endothelial growth factor A，VEGFA）、表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）等；GO功能及KEGG通路富集分析得出與瓜蔞半夏薤白湯干預(yù)COPD作用相關(guān)的生物過程1096個(gè)，如炎癥反應(yīng)、細(xì)胞溶質(zhì)、酶結(jié)合等；相關(guān)信號通路125條，如癌癥通路、TNF信號通路、前列腺癌、缺氧誘導(dǎo)因子1信號通路、神經(jīng)活性配體-受體相互作用等。斑馬魚炎癥模型實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，瓜蔞薤白半夏湯顯著降低、B淋巴細(xì)胞2（B-cell lymphoma 2，）和mRNA表達(dá)水平（＜0.05），降低半胱氨酸蛋白酶8（Caspases 8，）mRNA表達(dá)水平。瓜蔞薤白半夏湯可能通過作用于EGFR、IL-6、BCL2、CASP8等靶點(diǎn)，調(diào)節(jié)多條信號通路，從而發(fā)揮對COPD的治療作用。

瓜蔞薤白半夏湯；慢性阻塞性肺疾病；網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)；斑馬魚模型；EGFR；IL-6；BCL2；CASP8

慢性阻塞性肺疾病（chronic obstructive pulmoriary disease，COPD）是一種以持續(xù)呼吸道癥狀和持續(xù)氣流受限為主要特征的臨床常見病，通常由香煙煙霧等有害顆粒和氣體暴露引起的氣道和（或）肺泡異常導(dǎo)致[1]。慢阻肺發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，主要與氣道和肺慢性炎癥、氧化應(yīng)激、蛋白酶/抗蛋白酶失衡以及細(xì)胞凋亡等有關(guān)[2]。中醫(yī)理論中尚無對COPD的明確記載，將其納入“咳”“喘”“肺脹”等范疇[3]，久病體虛，復(fù)感外邪時(shí)導(dǎo)致病情不斷反復(fù)發(fā)作或加重進(jìn)而導(dǎo)致肺脹發(fā)生。諸多中醫(yī)研究者認(rèn)為肺脾兼虛為導(dǎo)致COPD長期反復(fù)發(fā)作、病程延長的主要原因。COPD急性發(fā)作發(fā)生時(shí)，如患者未能及時(shí)接受有效治療，可引發(fā)心力衰竭、呼吸衰竭等，嚴(yán)重威脅患者生命安全?，F(xiàn)有研究表明，COPD的發(fā)生發(fā)展可激活核因子-κB（nuclear factor-κB，NF-κB）、Notch、Janus激酶/信號轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子（Janus kinase/signal transducer and activator of transcription，JAK/STAT）、轉(zhuǎn)化生長因子（transforming growth factor，TGF）-Smad蛋白、p38絲裂原活化蛋白激酶（p38 mitogen activated protein kinases，p38 MAPK）、Toll樣受體（Toll-like receptor，TLR）等多條炎癥相關(guān)信號通路。在COPD的發(fā)病機(jī)制中，多種促炎和抗炎細(xì)胞因子間相互作用，產(chǎn)生了系統(tǒng)性炎癥反應(yīng)，加速COPD的發(fā)生與發(fā)展[4]。瓜蔞薤白半夏湯出自東漢張仲景的《金匱要略·胸痹心痛短氣病脈證并治第九》：“胸痹不得臥，心痛徹背者，栝蔞薤白半夏湯主之”，全方由瓜蔞、薤白、半夏、白酒（非現(xiàn)代白酒）等藥味組成，功擅行氣解郁、通陽散結(jié)、祛痰寬胸，原方用于治療胸痹、心痛病屬痰瘀痹阻者。然心肺同居于上焦，本方現(xiàn)代亦可用于治療COPD、創(chuàng)傷性氣胸、老年咳喘、慢性支氣管肺炎、肺間質(zhì)纖維化等肺疾病屬上述病機(jī)者[5]。臨床研究表明[6-8]，瓜蔞薤白半夏湯可用于治療COPD急性發(fā)作期患者，能夠有效提高臨床療效，改善患者通氣狀態(tài)，從而更好地提高患者的生活質(zhì)量，但其作用機(jī)制尚未闡明。

本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，系統(tǒng)分析瓜蔞薤白半夏湯干預(yù)COPD的有效成分、潛在靶點(diǎn)、作用通路及生物過程等信息，探討瓜蔞薤白半夏湯干預(yù)COPD的潛在作用機(jī)制，同時(shí)根據(jù)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究結(jié)果對其核心靶點(diǎn)采用斑馬魚模型進(jìn)行實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，為瓜蔞薤白半夏湯治療COPD提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 瓜蔞薤白半夏湯中活性成分的收集

通過檢索國內(nèi)外文獻(xiàn)關(guān)于“瓜蔞”“薤白”“半夏”等活性成分的報(bào)道，并利用中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫與分析平臺（TCMSP，http://tcmspw.com/）[9]、中醫(yī)藥百科全書數(shù)據(jù)庫（ETCM，http://www. tcmip.cn/ETCM/）、中醫(yī)藥綜合數(shù)據(jù)庫（TCMID，http://www.megabionet.org/tcmid/）[10]等以“瓜蔞”“薤白”“半夏”等關(guān)鍵詞搜索，經(jīng)PubChem數(shù)據(jù)庫（http://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov）[11]驗(yàn)證和整理分類，收集瓜蔞薤白半夏湯中的活性成分。

1.2 潛在活性成分作用靶點(diǎn)的篩選

借助TCMSP和SwissTargetPrediction（http:// www.swisstargetprediction.ch/）[12]數(shù)據(jù)庫查詢潛在活性成分的靶點(diǎn)，并借助UniProt數(shù)據(jù)庫（http://www. uniprot.org/）[13]等對靶點(diǎn)蛋白名稱進(jìn)行規(guī)范化和校正，得到標(biāo)準(zhǔn)化基因靶點(diǎn)信息。

1.3 “中藥-活性成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

將篩選出的靶點(diǎn)、活性成分、藥物等信息輸入Cytoscape 3.7.1軟件（http://www.cytosacpe.org/），構(gòu)建“中藥-活性成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)，導(dǎo)出其相關(guān)的度值、中心度值等拓?fù)鋽?shù)據(jù)，并運(yùn)用“Network Analyzer”功能分析其拓?fù)鋵W(xué)屬性。

1.4 COPD相關(guān)靶點(diǎn)的獲取

以“chronic obstructive pulmonary disease”為關(guān)鍵詞，通過GeneCards數(shù)據(jù)庫（http://www.genecards. org/）[14]、OMIM（https://www.omim.org/）[15]和TCMSP數(shù)據(jù)庫，獲得與COPD相關(guān)的作用靶點(diǎn)。

1.5 蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用（protein-protein interaction，PPI）網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建與分析

利用BioVenn分析工具，將活性成分對應(yīng)的靶點(diǎn)與COPD相關(guān)的靶點(diǎn)進(jìn)行疊加，取交集，作為瓜蔞薤白半夏湯與COPD關(guān)系密切的靶點(diǎn)，導(dǎo)入String數(shù)據(jù)庫（http:string-db.org/）[16]，限定物種為“Homo Sapiens”，去除孤立靶點(diǎn)，以“置信度＝0.4”為條件篩選，獲取蛋白相互作用關(guān)系。分析結(jié)果保存為TSV格式文件，導(dǎo)入Cytosape 3.7.1軟件，結(jié)合節(jié)點(diǎn)度值大小，構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)。

1.6 靶點(diǎn)通路分析

將篩選得到的瓜蔞薤白半夏湯作用的靶點(diǎn)導(dǎo)入DAVID數(shù)據(jù)庫（https://david.ncifcrf.gov/home.jsp）[17]，通過輸入靶點(diǎn)并限定物種為人，將所有靶基因名稱校正為其官方名稱，經(jīng)上述數(shù)據(jù)庫檢索和轉(zhuǎn)化操作，設(shè)定閾值＜0.05，將瓜蔞薤白半夏湯的PPI核心基因進(jìn)行基因本體（gene ontology，GO）生物學(xué)過程富集分析及京都基因與基因組百科全書（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）通路富集分析，運(yùn)用R version 3.6.3軟件將其結(jié)果進(jìn)行可視化。

1.7 實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證

1.7.1 動物 AB系野生型健康斑馬魚，購自南京一樹梨花斑馬魚養(yǎng)殖中心。斑馬魚飼養(yǎng)于斑馬魚專用的養(yǎng)殖系統(tǒng)，在照明14 h、黑暗10 h、28 ℃的標(biāo)準(zhǔn)條件下進(jìn)行飼養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)經(jīng)南京中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物倫理委員會批準(zhǔn)（批準(zhǔn)號202105A016）。

1.7.2 藥材 瓜蔞購自河北安國藥材市場，經(jīng)安徽省農(nóng)業(yè)科學(xué)院園藝研究所董玲研究員鑒定為葫蘆科植物栝樓Maxim.的干燥成熟果實(shí)；薤白（批號180726）購自安徽廣和中藥股份有限公司，半夏（批號181107）購自安徽六安眾信商貿(mào)公司，經(jīng)南京中醫(yī)藥大學(xué)嚴(yán)輝博士鑒定分別為百合科植物小根蒜Bge.的干燥鱗莖、天南星科植物半夏(Thunb.) Breit.的干燥塊莖。

1.7.3 藥品與試劑 氫化可的松購自阿拉丁試劑（上海）有限公司；氯仿（批號20171214）購自上海凌峰化學(xué)試劑有限公司；乙醇（批號20170327）購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；異丙醇（批號32064）購自南京化學(xué)試劑有限公司；TRIZOL（批號MKCD9593）購自美國Sigma公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（批號P20329）購自北京全式金生物技術(shù)有限公司。

1.7.4 儀器 BSG-300型程控光照培養(yǎng)箱（上海博迅實(shí)業(yè)有限公司）；Axio Vert A1型熒光倒置顯微鏡（卡爾蔡司光學(xué)中國有限公司）；移液器（德國Eppendorf公司）；EPED-E2-30TF型實(shí)驗(yàn)室級超純水器（南京易普易達(dá)科技發(fā)展有限公司）；ML 204型分析天平（梅特勒-托利多儀器有限公司）。

1.7.5 瓜蔞薤白半夏湯的制備 據(jù)《金匱要略》原文記載，瓜蔞薤白半夏湯中栝樓實(shí)1枚、薤白3兩、半夏半斤、白酒1 L；根據(jù)《中國藥典》及文獻(xiàn)研究[18-19]確定其現(xiàn)代劑量為瓜蔞12 g、薤白9 g、清半夏9 g，適量水煎。稱取以上藥物，加適量水浸泡30 min后大火煮沸，轉(zhuǎn)小火煎煮30～40 min。將藥液濾過倒出，將剩下的藥渣加適量溫水，再煎煮20 min，濾出藥液，將2次煎煮藥液混合。經(jīng)超高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（UPLC-MS/MS）分析，瓜蔞薤白半夏湯含胞苷2.98 mg/g、尿苷2.52 mg/g、腺苷0.02 mg/g、木犀草素0.17 mg/g和葫蘆素B 0.03 mg/g。

1.7.6 分組、造模與給藥 將受精后3 d（days post fertilization，dpf）斑馬魚幼魚置于24孔微量培養(yǎng)板，20只/孔，于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)。設(shè)置對照組、模型組和瓜蔞薤白半夏湯（12.5、25.0、50.0、100.0、200.0 μg/mL）組，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。除對照組外，其余各組加入氫化可的松浸泡6 h后進(jìn)行切尾；各給藥組加入相應(yīng)藥物浸泡4 h后，每組取20個(gè)幼魚收集于1.5 mL離心管，3000 r/min離心10 min，將幼魚沉于管底，小心吸棄培養(yǎng)液，迅速轉(zhuǎn)移至?20 ℃冰箱凍存。

1.7.7 qRT-PCR法檢測白細(xì)胞介素-6（interleukin-6，）、半胱氨酸蛋白酶8（Caspase 8，）、B淋巴細(xì)胞瘤2（B-cell lymphoma 2，）和表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor，）mRNA表達(dá)情況 按照試劑盒說明書提取斑馬魚中總RNA并合成cDNA，進(jìn)行qRT-PCR分析。引物序列見表1。

表1 引物序列

2 結(jié)果

2.1 瓜蔞薤白半夏湯潛在活性成分的篩選與對應(yīng)靶點(diǎn)的收集

通過TCMSP、ETCM、TCMID等數(shù)據(jù)庫和文獻(xiàn)檢索到瓜蔞、薤白及半夏的成分共955個(gè)，其中442個(gè)來自于瓜蔞、236個(gè)來自于薤白、277個(gè)來自于半夏。瓜蔞薤白半夏湯主要活性成分有28種，包括次黃嘌呤、鳥嘌呤、鳥苷、腺苷、腺嘌呤5種核苷類成分，掌葉半夏戊、掌葉半夏丁、葫蘆巴堿、麻黃堿、去甲哈爾滿堿、哈爾滿堿、肉葉蕓香堿、巴豆堿Ａ、煙酰胺、3-羥基-2-甲基吡啶10種生物堿成分，美迪紫檀素、香葉木素和水黃皮素3種黃酮類成分，類纈氨酸、蒜氨酸、苯丙氨酸3種氨基酸及7種其他類化合物[20]，暫未見有對其進(jìn)行定量分析的報(bào)道。由于多藥材共同煎煮溶出成分并非單獨(dú)藥材的簡單加合，參考關(guān)于對瓜蔞薤白半夏湯成分研究的相關(guān)文獻(xiàn)，篩選獲得106個(gè)潛在活性成分[20-21]。利用TCMSP平臺和SwissTargetPrediction數(shù)據(jù)庫，對活性成分靶點(diǎn)進(jìn)行預(yù)測，74個(gè)核心活性成分（表2）共收集到1134個(gè)靶點(diǎn)。

表2 瓜蔞薤白半夏湯中的核心活性成分

續(xù)表2

2.2 “中藥-活性成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建與分析

“中藥-活性成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)如圖1所示，共包含486個(gè)節(jié)點(diǎn)（1種疾病節(jié)點(diǎn)、3種中藥節(jié)點(diǎn)、74種活性成分節(jié)點(diǎn)、408種靶點(diǎn)節(jié)點(diǎn)）和235 710條邊。并借助Cytoscape 3.7.1軟件中的“Network analyze”功能對網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行拓?fù)鋵傩苑治?，其中度值與中心度值是衡量1個(gè)節(jié)點(diǎn)在網(wǎng)絡(luò)中關(guān)鍵性的2個(gè)重要參數(shù)。選取度值與中心度值較大的節(jié)點(diǎn)，這些節(jié)點(diǎn)在網(wǎng)絡(luò)中起到了樞紐作用，可能是關(guān)鍵成分或靶點(diǎn)。以節(jié)點(diǎn)度值的平均數(shù)作為篩選標(biāo)準(zhǔn)，同時(shí)參考其中心度值，篩選出大于平均度值的化合物和靶點(diǎn)作為核心活性成分和核心靶點(diǎn)，共得到44個(gè)核心活性成分和143個(gè)核心靶點(diǎn)，其中排名前5位的活性成分為芹菜素（apigenin）、茴香酸（anisic acid）、美迪紫檀素（medicarpin）、金圣草黃素（chrysoeriol）、香葉木素（diosmetin），分別能與77、76、70、64、61個(gè)靶點(diǎn)發(fā)生作用；排名前5的靶點(diǎn)為碳酸酐酶9（carbonic anhydrase 9，CA9）、前列腺素內(nèi)過氧化物合酶1（prostaglandin-endoperoxide synthase 1，PTGS1）、二肽激肽酶4（dipeptidyl peptidase 4，DPP4）、EGFR、乙酰膽堿酯酶（acetyl cholinesterase，ACHE），分別能與44、36、31、30、30個(gè)活性成分相互作用（表3）。

圖1 “中藥-活性成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)

2.3 COPD靶點(diǎn)的收集與PPI網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

通過GeneCards、OMIM和TCMSP數(shù)據(jù)庫共收集到與COPD相關(guān)的靶點(diǎn)2071個(gè)，與瓜蔞薤白半夏湯相關(guān)的1134個(gè)靶點(diǎn)進(jìn)行交集分析后得到408個(gè)共有靶點(diǎn)，見圖2。將共有靶點(diǎn)信息輸入String數(shù)據(jù)庫，將輸出結(jié)果tsv文件導(dǎo)入Cytoscape 3.7.1軟件，構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)，去除2個(gè)獨(dú)立靶點(diǎn)（ABCC9、MAN1B），網(wǎng)絡(luò)中共包含406個(gè)節(jié)點(diǎn)。如圖3所示，靶點(diǎn)的平均節(jié)點(diǎn)度值為41.38，其中度值大于平均值的靶點(diǎn)有胰島素（insulin，INS）、絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶1（serine/threonine protein kinase 1，AKT1）、IL-6、白蛋白（albumin，ALB）、腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）、血管內(nèi)皮生長因子A（vascular endothelial growth factor A，VEGFA）、MAPK1、MAPK3、EGFR、原癌基因SRC、IL-8、CASP3、STAT3、PTGS2、熱休克蛋白90 α1（heat shock protein 90 α1，HSP90A1）、原癌基因HRAS、MAPK8、IL-1β、雌激素受體1（estrogen receptor 1，ESR1）、周期蛋白D1（Cyclin D1，CCND1）、FOS、TLR4、基質(zhì)金屬蛋白酶（matrix metallopeptidase 9，MMP9）、癌基因CTNNB1、癌基因EP300、雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）、MAPK14、沉默信息調(diào)節(jié)因子2相關(guān)酶1（silent information regulator 2-related enzymes 1，SIRT1）、磷脂酰肌醇-3- 激酶催化亞單位α（phosphatidylinositol-4,5- bisphosphate 3-kinase catalytic subunit α，PIK3CA）、IL-2等138個(gè)，這138個(gè)靶點(diǎn)可能是瓜蔞薤白半夏湯治療COPD的關(guān)鍵靶點(diǎn)，按照度值排序選取排名前30靶點(diǎn)進(jìn)行結(jié)果展示（圖3）。

表3 “中藥-活性成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)及其拓?fù)鋵W(xué)特征

圖2 瓜蔞薤白半夏湯與COPD靶點(diǎn)交集的韋恩圖

圖3 瓜蔞薤白半夏湯治療的COPD的PPI網(wǎng)絡(luò)(A) 及關(guān)鍵靶點(diǎn)(B)

2.4 GO功能及KEGG通路富集分析

2.4.1 GO功能富集分析 DAVID中GO功能富集分析得到GO條目1096個(gè)（＜0.05），其中生物過程（biological process，BP）條目816個(gè)、細(xì)胞組成（cellular component，CC）條目88個(gè)、分子功能（molecular function，MF）條目192個(gè)，分別占74.45%、8.03%、17.52%。按?lg值排序，分別選取前10條目，見圖4。BP中靶點(diǎn)主要涉及炎癥反應(yīng)、藥物反應(yīng)、細(xì)胞凋亡負(fù)調(diào)控、脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）反應(yīng)；CC中靶點(diǎn)主要涉及細(xì)胞溶質(zhì)、質(zhì)膜、細(xì)胞表面；MF中靶點(diǎn)主要涉及酶結(jié)合、藥物結(jié)合、三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP）結(jié)合、蛋白結(jié)合等。

2.4.2 KEGG通路富集分析 通過使用DAVID數(shù)據(jù)中KEGG通路富集分析得到125條（＜0.05）信號通路，按照?lg值排序，選取前20條目，繪氣泡圖，見圖5。主要涉及癌癥通路、TNF信號通路、前列腺癌、缺氧誘導(dǎo)因子-1（hypoxia inducible factor-1，HIF-1）信號通路、神經(jīng)活性配體-受體相互作用等通路，主要涉及INS、AKT1、IL-6、ALB、TNF、VEGFA、MAPK3、MAPK1、EGFR、SRC、CXCL8、CASP3、STAT3和PTGS2等靶點(diǎn)。

圖4 GO功能富集分析(前10)

圖5 KEGG通路富集分析(前20)

2.5 qRT-PCR法檢測斑馬魚模型IL-6、CASP8、BCL2和EGFR mRNA表達(dá)情況

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)結(jié)果表明，炎癥相關(guān)靶點(diǎn)及通路是瓜蔞薤白半夏湯治療COPD的關(guān)鍵，通過建立斑馬魚炎癥模型對篩選出的炎癥靶點(diǎn)EGFR、IL-6、BCL2、CASP8進(jìn)行實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。如圖6所示，與對照組比較，模型組、、和mRNA表達(dá)水平顯著升高（＜0.05、0.01）；與模型組比較，瓜蔞薤白半夏湯（200 μg/mL）組、和mRNA表達(dá)水平顯著降低（＜0.05），瓜蔞薤白半夏湯（100 μg/mL）組mRNA表達(dá)水平顯著降低（＜0.05）；瓜蔞薤白半夏湯各劑量組mRNA表達(dá)水平降低，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。與網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究結(jié)果一致，瓜蔞薤白半夏湯主要通過調(diào)節(jié)EGFR、IL-6、BCL2、CASP8等靶點(diǎn)干預(yù)COPD。

與對照組比較：#P＜0.05 ##P＜0.01；與模型組比較：*P＜0.05

3 討論

本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法共篩選出瓜蔞薤白半夏湯中成分955個(gè)，考慮到湯劑煎煮對中藥的影響選取潛在活性成分106個(gè)、核心活性成分74個(gè)，作用于1134個(gè)靶點(diǎn)，干預(yù)COPD的關(guān)鍵作用靶點(diǎn)408個(gè)，體現(xiàn)了中藥多成分、多靶點(diǎn)、整體性和關(guān)聯(lián)性的特點(diǎn)。根據(jù)“中藥-活性成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)的拓?fù)鋵傩苑治鼋Y(jié)果，進(jìn)一步得到其中排名前5位的活性成分分別為來自于瓜蔞的芹菜素、美迪紫檀素、金圣草黃素、香葉木素和來自于半夏的茴香酸。

黃酮類成分在瓜蔞薤白半夏湯干預(yù)COPD中起到了較為重要的作用。黃酮類化合物具有抗氧化、抗炎、抗腫瘤、抗病毒和調(diào)節(jié)免疫等藥理作用，其中抗炎和抗氧化活性使其成為預(yù)防和治療肺部炎癥疾病的潛在藥物[22]。芹菜素具有抗氧化、抗炎及保肝等作用。芹菜素碳苷可通過抑制TLR4/瞬時(shí)受體電位陽離子通道蛋白6（transient receptor potential cation channel 6，TRPC6）信號通路的激活來抑制急性炎癥和細(xì)胞凋亡，從而抑制LPS誘導(dǎo)的BALB/c小鼠急性肺損傷模型的肺部炎癥[23]。芹菜素可以降低CD4＋和CD8＋T細(xì)胞、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）和過氧化氫酶（catalase，CAT）活性來調(diào)節(jié)炎性反應(yīng)和氧化應(yīng)激水平，從而逆轉(zhuǎn)百草枯誘發(fā)的急性肺損傷[24]。金圣草黃素可顯著抑制LPS誘導(dǎo)的前列腺素E2（prostaglandin E2，PGE2）產(chǎn)生和環(huán)氧合酶2（cyclooxygenase 2，COX2）表達(dá)，進(jìn)一步抑制NF-κB和活化蛋白1（activator protein 1，AP1）等表達(dá)；金圣草黃素顯著抑制LPS誘導(dǎo)的小鼠單核巨噬細(xì)胞RAW264.7中TLR4和髓樣分化蛋白88等接頭分子活化[25]。研究表明，肺部炎癥損傷的大鼠中TLR4表達(dá)水平升高，為維持COPD炎癥反應(yīng)的主要TLRs[26]。香葉木素能夠降低肺濕/干質(zhì)量，以及支氣管肺泡灌洗液中TNF-α、IL-6、IL-1β等蛋白表達(dá)水平[27]；此外，香葉木素還能夠顯著抑制LPS誘導(dǎo)的髓過氧化物酶、丙二醛和活性氧水平的升高，并通過激活核因子相關(guān)因子2（nuclear factor E2-related factor 2，Nrf2）以及抑制結(jié)構(gòu)域蛋白3（NOD-like receptor family pyrin domain- containing protein 3，NLRP3）炎癥小體，保護(hù)LPS誘導(dǎo)的急性肺損傷。

PPI網(wǎng)絡(luò)分析和“中藥-活性成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)的拓?fù)鋵傩苑治鼋Y(jié)果表明，瓜蔞薤白半夏湯干預(yù)COPD的主要作用靶點(diǎn)為CA9、PTGS1、PTGS2、INS、AKT1、IL-6、TNF、CXCL8、EGFR、VEGFA、MAPK3、MAPK1、MAPK8等。CA9是非小細(xì)胞肺癌中的重要分子，參與一系列血管生成、細(xì)胞凋亡和細(xì)胞間黏附破壞的蛋白表達(dá)[28]。研究表明，氣道炎癥是COPD發(fā)生發(fā)展的重要機(jī)制，COX2是花生四烯酸代謝過程中的重要限速酶，香煙煙霧暴露能夠上調(diào)COX2表達(dá)，而其代謝產(chǎn)物可加劇患者的氣道炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致氣流阻塞程度增加。此外，細(xì)胞因子IL-6、IL-8、TNF-α、TNF-β在COPD患者中表達(dá)上升，均可誘導(dǎo)氣道炎癥的發(fā)生，造成氣道與肺組織持續(xù)性的損傷[29-30]。CASP3、CASP8屬于半胱氨酸蛋白酶家族，與細(xì)胞凋亡有關(guān)。CASP8介導(dǎo)死亡受體途徑，并激活CASP3，被激活的CASP3作用于BCL2家族成員，破壞宿主細(xì)胞內(nèi)的結(jié)構(gòu)蛋白及DNA穩(wěn)定，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[31-32]。煙霧引起的COPD通過激活細(xì)支氣管上皮細(xì)胞CASP3的免疫反應(yīng)，從而介導(dǎo)細(xì)胞凋亡[32-33]。VEGFA是血小板源性生長因子（platelet derived growth factor，PDGF）/VEGF生長因子家族的成員，可以誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞增殖、促進(jìn)細(xì)胞遷移、抑制凋亡，增加血管通透性和調(diào)節(jié)血栓形成。BCL2與凋亡調(diào)節(jié)和肺功能有關(guān)[34]，可通過維持線粒體膜電位介導(dǎo)細(xì)胞凋亡，從而促進(jìn)COPD的發(fā)展。肺氣腫型COPD患者的肺組織中VEGF和BCL2蛋白表達(dá)明顯降低，提示瓜蔞薤白半夏湯可通過上調(diào)VEGF和BCL2表達(dá)，VEGF進(jìn)一步作為內(nèi)皮細(xì)胞存活因子，保護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞。瓜蔞薤白半夏湯能夠顯著降低斑馬魚炎癥模型、mRNA表達(dá)水平，且呈劑量相關(guān)性。KEGG通路富集主要涉及癌癥通路、TNF信號通路、神經(jīng)活性配體-受體相互作用等通路，靶點(diǎn)富集數(shù)目最多的通路為癌癥通路，且均涉及IL-6。IL-6是一種促炎因子，可通過趨化炎性細(xì)胞聚集和促進(jìn)炎性細(xì)胞浸潤，加速肺纖維化早期的肺泡炎癥反應(yīng)，進(jìn)而介導(dǎo)特發(fā)性肺纖維化的發(fā)生，對肺部產(chǎn)生損傷[35]。瓜蔞薤白半夏湯對病毒感染及肺部損傷具有一定的干預(yù)作用，瓜蔞薤白半夏湯能夠顯著降低斑馬魚炎癥模型mRNA表達(dá)水平，且呈劑量相關(guān)性。此外，TNF信號通路在抗病毒、介導(dǎo)能量代謝、炎癥反應(yīng)、血管生成以及維持干細(xì)胞特性等方面發(fā)揮重要作用，HIF-1信號通路與免疫反應(yīng)、炎癥反應(yīng)的發(fā)生與發(fā)展密切相關(guān)[36]。

綜上所述，瓜蔞薤白半夏湯中芹菜素、茴香酸、美迪紫檀素、金圣草黃素、香葉木素等74個(gè)核心功效成分作用于CA9、PTGS1、INS、IL-6、AKT1、TNF、MAPK1、MAPK3、VEGFA、EGFR等408個(gè)靶點(diǎn)，通過炎癥反應(yīng)、細(xì)胞溶質(zhì)、酶結(jié)合等1096個(gè)生物過程，癌癥通路、TNF信號通路、前列腺癌、HIF-1信號通路、神經(jīng)活性配體-受體相互作用等125條信號通路，從而治療COPD。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Mechanism of Gualou Xiebai Banxia Decoction on chronic obstructive pulmonary disease based on network pharmacology and zebrafish model

TAN Xiao-ying, LI Dan, LIU Pei, FENG Wei-meng, WU Wen-xing, LIU Jia-qing, SU Shu-lan, GUO Sheng, SHANG Er-xin, ZHANG Huang-qin, DUAN Jin-ao

Jiangsu Key Laboratory for High Technology Research of TCM Formulae, Jiangsu Key Laboratory of TCM Formulae, Jiangsu Collaborative Innovation Center of Chinese Medicinal Resources Industrialization, National and Local Collaborative Engineering Center of Chinese Medicinal Resources Industrialization and Formulae Innovative Medicine, Nanjing University of Chinese Medicine, Nanjing 210023, China

To explore the potential mechanism of Gualou Xiebai Banxia Decoction (瓜蔞薤白半夏湯) on intervention of chronic obstructive pulmoriary disease (COPD) based on network pharmacology method and zebrafish model.The main active ingredients of Gualou Xiebai Banxia Decoction were searched using TCM System Pharmacology Database and Analysis Platform (TCMSP), TCM Encyclopedia (ETCM), TCM Comprehensive Database (TCMID), and related literature at home and abroad, targets were predicted through TCMSP and SwissTargetPrediction database; COPD-related targets were obtained through GeneCards database, online human Mendelian Inheritance Database (OMIM) and TCMSP database, the common target interacts with active ingredients of Gualou Xiebai Banxia Decoction were screened out by intersection method. “Traditional Chinese medicine-active ingredients-targets” network was construct by Cytoscape 3.7.1 software, protein-protein interaction (PPI) network was construct by String database, shared genes were performed gene ontology (GO) functional enrichment analysis and Kyoto encyclopedia of genes and genomes (KEGG) pathway enrichment analysis by DAVID database; The screened targets were verified by zebrafish inflammation model.A total of 955 ingredients were screened for Gualou Xiebai Banxia Decoction, 106 potential active ingredients, and 74 core active ingredients such as apigenin, anisic acid, medi pterostil, chrysophyllin, geraniol, etc., corresponding to 1134 targets; PPI network analysis obtained 408 key targets for Gualou Xiebai Banxia Decoction to interfere with COPD, including carbonic anhydrase 9 (CA9), prostaglandin-endoperoxide synthase 1 (PTGS1), insulin (INS), interleukin-6 (IL-6), serine/threonine protein kinase 1 (AKT1), tumor necrosis factor (TNF), mitogen-activated protein kinase 1 (MAPK1), MAPK3, vascular endothelial growth factor A (VEGFA), epidermal growth factor receptor (EGFR), etc.; GO function and KEGG pathway enrichment analysis showed that there were 1096 biological processes related to the intervention of Gualou Banxia Xiebai Decoction on COPD, such as inflammation, cytosol, enzyme binding, etc., and 125 related signal pathways such as cancer pathways, TNF signaling pathway, prostate cancer, hypoxia-inducible factor 1 signaling pathway, neuroactive ligand-receptor interaction, etc. The experimental results of zebrafish inflammation model showed that Gualou Xiebai Banxia Decoction significantly reduced, B-cell lymphoma-2 () andmRNA expressions (< 0.05), reduced Caspases 8 () mRNA expression.Gualou Xiebai Banxia Decoction may regulate multiple signal pathways by acting on targets such as EGFR, IL-6, BCL2, and CASP8, thereby exerting a therapeutic effect on COPD.

Gualou Xiebai Banxia Decoction; chronic obstructive pulmonary disease; network pharmacology; zebrafish model; EGFR; IL-6; BCL2; CASP8

R285.5

A

0253 - 2670(2021)17 - 5233 - 11

10.7501/j.issn.0253-2670.2021.17.015

2021-05-12

江蘇省自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（BK20201403）；江蘇省高校自然科學(xué)基金重大項(xiàng)目（19KJA320002）；江蘇省第十六批“六大人才高峰”計(jì)劃（JNHB-066）；江蘇省青藍(lán)工程項(xiàng)目；江蘇省高等學(xué)校大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目（202010315047Y）

談曉瑩（1997—），女，碩士研究生，主要從事中藥功效物質(zhì)基礎(chǔ)研究。E-mail: tantanjjy@163.com

劉 培，女，副教授，研究方向?yàn)橹兴庂Y源綜合利用研究。Tel: (025)85811917 E-mail: liupei@njucm.edu.cn

段金廒，男，沈陽藥科大學(xué)43期藥學(xué)系校友，現(xiàn)任南京中醫(yī)藥大學(xué)教授。代表性經(jīng)典方劑類方衍化關(guān)系與功效物質(zhì)研究成果獲國家教育部自然科學(xué)一等獎和中華中醫(yī)藥學(xué)會科學(xué)技術(shù)進(jìn)步一等獎。Tel: (025)85811917 E-mail: dja@njucm.edu.cn

[責(zé)任編輯 李亞楠]