重組綿羊肺表面活性物質(zhì)結(jié)合蛋白A的體外生物學(xué)活性檢測(cè)

李增強(qiáng)，趙寧，張彥兵，李珂兒，魏立翔，孫延鳴

(石河子大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，新疆 石河子 832003)

在哺乳動(dòng)物的肺泡表面覆蓋有一層肺表面活性物質(zhì)的蛋白(surfactant-associated protein，SP)，SP分為 SP-A、SP-B、SP-C 和 SP-D共4種，其中SP-A為親水的蛋白質(zhì)，其含量在SP中約占50%，是肺泡表面的主要免疫防御和免疫調(diào)節(jié)分子[1]，主要由肺泡Ⅱ型(AT-Ⅱ)細(xì)胞合成，也可以通過細(xì)支氣管非纖毛上皮細(xì)胞(clara 細(xì)胞)和黏膜下層細(xì)胞分泌。SP-A是Ca2+依賴性的膠原凝集素成員，分子結(jié)構(gòu)中均含有氨基N端區(qū)、膠原蛋白樣區(qū)、頸區(qū)和凝集素活性區(qū)(即糖識(shí)別區(qū)，CRD)4個(gè)結(jié)構(gòu)域，其中凝集素區(qū)可介導(dǎo)凝集素與多種不同病原體(細(xì)菌、病毒、真菌等)表面的糖類物質(zhì)結(jié)合，引起病原體的凝集。研究發(fā)現(xiàn)，結(jié)合病原體的SP-A能增強(qiáng)吞噬細(xì)胞活性，促進(jìn)吞噬作用；此外，SP-A可與巨噬細(xì)胞膜上受體結(jié)合，調(diào)理巨噬細(xì)胞對(duì)病原體的吞噬[2]。以往研究證實(shí)，人的SP-A不僅能顯著增強(qiáng)IgG抗體介導(dǎo)的中性粒細(xì)胞對(duì)病原體的吞噬[3]，還能以抗體非依賴的方式促進(jìn)中性粒細(xì)胞吞噬殺滅病原菌[4]。中性粒細(xì)胞受抗原刺激后能夠脫顆粒釋放一種具有降解毒力因子和殺菌功能的中性粒細(xì)胞彈性蛋白酶(neutrophil elastase，NE)，屬于絲氨酸蛋白酶家族成員[5]，NE能夠抑制肺炎支原體(Mycoplasmapneumoniae，Mp)的生長(zhǎng)[6]。研究證明，人的SP-A能夠抑制大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、肺炎鏈球菌等細(xì)菌的生長(zhǎng)，表現(xiàn)出明顯的抗菌活性[7-8]。此外，SP-A不僅在過敏反應(yīng)和炎癥的消退過程中發(fā)揮重要作用[9]，還具有重要的抗病毒感染[10]和免疫調(diào)節(jié)功能[11]。

盡管人們對(duì)人和小鼠的SP-A有比較深入的研究，但對(duì)其他動(dòng)物SP-A的研究報(bào)道較少。為此本實(shí)驗(yàn)室利用真核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)重組綿羊SP-A，并發(fā)現(xiàn)SP-A能夠顯著抑制綿羊肺炎支原體(Mycoplasmaovipneumoniae，Mo)的生長(zhǎng)[12]。為了更深入探討綿羊SP-A的功能，本研究對(duì)重組綿羊肺表面活性物質(zhì)結(jié)合蛋白A(rSP-A)的部分體外生物學(xué)活性進(jìn)行了檢測(cè)分析，為進(jìn)一步研究SP-A在綿羊體內(nèi)的生物學(xué)特性以及將其作為抗菌制劑的臨床應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要材料

綿羊由石河子大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院實(shí)驗(yàn)站提供；rSP-A按照王繼雪等[13]構(gòu)建的重組綿羊SP-A畢赤酵母GS115真核表達(dá)系統(tǒng)誘導(dǎo)表達(dá)rSP-A，用His標(biāo)簽的Ni-NTA樹脂純化表達(dá)產(chǎn)物，經(jīng)SDS-PAGE鑒定、濃縮后凍存于-80 ℃冰箱備用。酵母抽提物為GS115/pPIC9K空載體表達(dá)的產(chǎn)物。Mo 1412株為臨床獸醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室保存菌種，與Mo Y-98標(biāo)準(zhǔn)株的同源性為98%；羊巴氏桿菌(CVCC3045)和肺炎鏈球菌(ATCC10015)由預(yù)防獸醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室饋贈(zèng)。

1.2 主要試劑

牛腦心浸液(BHI)和支原體肉湯培養(yǎng)基購(gòu)自青島高科技工業(yè)園海博生物技術(shù)有限公司；HEPES購(gòu)自北京博奧拓達(dá)科技有限公司；對(duì)硝基苯胺購(gòu)自上海麥克林生化科技有限公司；RPMI 1640培養(yǎng)基購(gòu)自賽默飛世爾生物化學(xué)制品(北京)有限公司；馬血清、胎牛血清(FBS)和四肽底物(N-(methoxysuccinyl)-Ala-Ala-Pro-Val p-nitroanilide)均購(gòu)自Sigma公司；羊外周血中性粒細(xì)胞分離液試劑盒、羊外周血淋巴細(xì)胞分離液試劑盒和MTT細(xì)胞增殖及細(xì)胞毒性檢測(cè)試劑盒均購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司。

1.3 rSP-A對(duì)NE活性的調(diào)節(jié)作用測(cè)定

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

使用甲醇配制濃度為2 mmol/L的對(duì)硝基苯胺標(biāo)準(zhǔn)溶液，二倍倍比稀釋后(0.5～0.002 mmol/L)使用酶標(biāo)儀測(cè)定各孔OD405值，甲醇作為空白對(duì)照；以標(biāo)準(zhǔn)液濃度為橫坐標(biāo)、OD405值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，生成回歸方程。

1.3.2 NE活性的檢測(cè)

參照文獻(xiàn)[6]，向RPMI 1640培養(yǎng)基(含10%胎牛血清)中加入rSP-A，使其終濃度分別為0、10、20、40、80和160 μg/mL；頸靜脈采集綿羊抗凝血液，使用羊外周血中性粒細(xì)胞分離液試劑盒分離中性粒細(xì)胞，添加含rSP-A的細(xì)胞培養(yǎng)基制成細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞密度為1×106個(gè)/mL；Mo菌液(106CCU/mL)以12 000 r/min離心10 min后，收集菌體并按感染復(fù)數(shù)(MOI)為10∶1感染中性粒細(xì)胞。37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)2 h后收集上清(含NE)，與等體積0.1 mol/L HEPES緩沖液(含0.5 mmol/L NaCl，pH=7.5)混合后移入96孔板；每孔加入等量四肽底物(200 μL反應(yīng)體系)，37 ℃孵育5 min后用酶標(biāo)儀測(cè)定菌液的OD405值，每孔重復(fù)3次。根據(jù)回歸方程計(jì)算NE水解四肽底物生成的對(duì)硝基苯胺濃度。

1.4 rSP-A對(duì)淋巴細(xì)胞增殖的影響

參照文獻(xiàn)[14]，使用羊外周血淋巴細(xì)胞分離液試劑盒分離淋巴細(xì)胞，用臺(tái)盼藍(lán)染色法檢測(cè)淋巴細(xì)胞活率后，體外培養(yǎng)于添加有rSP-A的RPMI 1640培養(yǎng)基，rSP-A終濃度分別為0、5、10、20、40和80 μg/mL；此外，另一試驗(yàn)組還需添加植物血凝素(PHA)至終濃度為5 μg/mL，每組3個(gè)重復(fù)；37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)24、48和72 h，終止培養(yǎng)前4 h每孔加入10 μL MTT溶液，4 h后離心棄上清，每孔添加110 μL Formazan溶解液，低速振蕩10 min后使用酶標(biāo)儀測(cè)定各孔OD490值。MTT結(jié)果以刺激指數(shù)(SI)表示，即：PHA組OD490值/未刺激組OD490值。

1.5 rSP-A對(duì)Mo生長(zhǎng)代謝和增殖的影響

參照文獻(xiàn)[15]，向Mo培養(yǎng)基中添加5%體積的0.4%酚紅指示劑和CaCl2(終濃度為5 mmol/L)，同時(shí)添加rSP-A至終濃度分別為0(用等量酵母提取物替代)、10、20和40 μg/mL，按照培養(yǎng)基與Mo菌液(106CCU/mL)體積比為4∶1的比例接菌，每組3個(gè)重復(fù)；37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)0、1、3、5和7 d，使用酶標(biāo)儀檢測(cè)各組Mo菌液OD550值，并參考文獻(xiàn)[16]測(cè)定Mo的菌落數(shù)。

1.6 rSP-A抗菌活性分析

參照文獻(xiàn)[17]，配制含CaCl2(終濃度為5 mmol/L)和rSP-A的腦心浸液肉湯(BHI)培養(yǎng)基，rSP-A含量分別為0(用等量酵母提取物替代)、40、80、120、160和200 μg/mL；按1%的接種量將巴氏桿菌和肺炎鏈球菌接種于上述培養(yǎng)基中，37 ℃、200 r/min震蕩培養(yǎng)6、12和24 h，每組3個(gè)重復(fù)；各階段培養(yǎng)結(jié)束后，使用平板菌落計(jì)數(shù)法測(cè)定菌液的含菌量。

1.7 數(shù)據(jù)處理

使用SPSS 24.0軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行One-way ANOVA分析，試驗(yàn)數(shù)據(jù)以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示；P<0.05 表示差異顯著，P<0.01 表示差異極顯著。

2 結(jié)果

2.1 rSP-A對(duì)NE活性的調(diào)節(jié)作用

根據(jù)梯度稀釋的對(duì)硝基苯胺標(biāo)準(zhǔn)液濃度和OD405值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖1)，得到回歸方程y=7.132 8x+0.027 2，回歸系數(shù)R2=0.994 5。

圖1 標(biāo)準(zhǔn)品線性回歸曲線

各濃度rSP-A組的NE活性分析結(jié)果(圖2)顯示，20、40、80、160 μg/mL rSP-A組的NE活性均顯著或極顯著高于對(duì)照組(P<0.05或P<0.01)，隨著rSP-A濃度的升高，NE活性明顯增強(qiáng)，說明rSP-A可顯著增強(qiáng)Mo感染中性粒細(xì)胞釋放的NE活性。

注：*表示差異顯著(P<0.05)，**表示差異極顯著(P<0.01)。下同

2.2 rSP-A對(duì)淋巴細(xì)胞體外增殖的影響

MTT檢測(cè)結(jié)果(圖3)顯示，淋巴細(xì)胞體外培養(yǎng)24、48和72 h時(shí)，SI均隨培養(yǎng)液中的rSP-A濃度的增高而減小，且對(duì)照組的SI始終大于其他各組。培養(yǎng)24 h后，10 μg/mL組的SI顯著小于對(duì)照組(P<0.05)，20、40和80 μg/mL組的SI極顯著小于對(duì)照組(P<0.01)；培養(yǎng)48 h后,20、40 μg/mL組的SI顯著小于對(duì)照組(P<0.05)，80 μg/mL組的SI極顯著小于對(duì)照組(P<0.01)；培養(yǎng)72 h后，20、40、80 μg/mL組的SI顯著或極顯著小于對(duì)照組(P<0.05或P<0.01)，80 μg/mL組的SI極顯著小于20 μg/mL組(P<0.01)。結(jié)果表明rSP-A對(duì)淋巴細(xì)胞體外增殖活性具有明顯的抑制作用。

圖3 rSP-A對(duì)淋巴細(xì)胞體外增殖活性的影響

2.3 rSP-A對(duì)Mo生長(zhǎng)代謝和增殖的影響

rSP-A對(duì)Mo代謝的檢測(cè)結(jié)果見圖4，培養(yǎng)1 d后，20與40 μg/mL組Mo菌液OD550值顯著低于對(duì)照組(P<0.05)；培養(yǎng)3、5和7 d后，各試驗(yàn)組Mo菌液OD550值均極顯著低于對(duì)照組(P<0.01)，說明rSP-A對(duì)Mo的生長(zhǎng)代謝有明顯的抑制作用。

圖4 rSP-A對(duì)Mo代謝的影響

Mo平板菌落計(jì)數(shù)結(jié)果(圖5)顯示，Mo活菌數(shù)隨培養(yǎng)時(shí)長(zhǎng)的增加而增多。培養(yǎng)時(shí)間超過3 d時(shí)，各組菌液濃度出現(xiàn)了顯著性差異，rSP-A濃度越高，菌液濃度越低。培養(yǎng)3 d后，20與40 μg/mL組的Mo菌液濃度顯著低于對(duì)照組(P<0.05、P<0.01)；培養(yǎng)5 d或7 d后，各試驗(yàn)組的Mo菌液濃度均顯著或極顯著低于對(duì)照組(P<0.05、P<0.01)。結(jié)果表明，rSP-A可明顯抑制Mo的體外增殖。

圖5 Mo平板菌落計(jì)數(shù)結(jié)果

2.4 rSP-A的抗菌活性分析

肺炎鏈球菌和巴氏桿菌體外培養(yǎng)6、12和24 h后的菌液濃度檢測(cè)結(jié)果(圖6和圖7)顯示，2種菌液濃度變化均呈先增后降的趨勢(shì)。對(duì)比各組菌液濃度差異可知，隨著rSP-A添加量的增多，2種細(xì)菌的菌液濃度均顯著或極顯著降低(P<0.05、P<0.01)；由此可知，rSP-A對(duì)致病性肺炎鏈球菌和巴氏桿菌均有明顯抗菌活性。

圖6 rSP-A對(duì)肺炎鏈球菌的抗菌活性

圖7 rSP-A對(duì)巴氏桿菌的抗菌活性

3 討論

當(dāng)呼吸道受到病原菌侵襲并發(fā)生炎癥時(shí)，中性粒細(xì)胞便會(huì)發(fā)生聚集、活化及脫顆粒，釋放NE[18]。NE是一種絲氨酸蛋白酶，能夠破壞病原菌的結(jié)構(gòu)，并促進(jìn)吞噬細(xì)胞吞噬細(xì)菌，參與機(jī)體免疫防御。在NE活性檢測(cè)試驗(yàn)中，不同濃度rSP-A與Mo感染的中性細(xì)胞共同孵育了2 h，由于rSP-A對(duì)Mo增殖具有抑制作用，從理論上來講，各組Mo數(shù)量可能會(huì)有差異，從而影響NE的釋放量，最終會(huì)影響試驗(yàn)結(jié)果。但實(shí)際上，Mo在本試驗(yàn)中的作用主要是刺激中性粒細(xì)胞釋放NE，雖然rSP-A對(duì)Mo具有抑制作用，但Mo生長(zhǎng)極其緩慢且本試驗(yàn)作用時(shí)間僅有2 h，所以rSP-A對(duì)Mo的作用很小，可忽略不計(jì)，不會(huì)干擾試驗(yàn)結(jié)果。在本試驗(yàn)中，rSP-A能顯著增強(qiáng)Mo刺激中性粒細(xì)胞釋放的NE的活性，提示rSP-A可能通過促進(jìn)Mo介導(dǎo)的中性粒細(xì)胞的活化及NE的釋放，使得NE活性進(jìn)一步增強(qiáng)，有助于病原體的清除。然而，NE在動(dòng)物體內(nèi)也是一種具有破壞性的蛋白溶解酶，可破壞自身正常組織的完整性，與許多疾病的病理過程密切相關(guān)[19]。SP-A與NE同是機(jī)體的免疫蛋白分子，在體內(nèi)是否存在某種關(guān)系，是今后需要研究的課題。

MTT試驗(yàn)結(jié)果表明，rSP-A能明顯抑制淋巴細(xì)胞的增殖。Borron等[20]采用D-甘露糖親和層析法從牛支氣管肺泡灌洗液中分離純化出天然SP-A，并使用氚化胸腺嘧啶核苷滲入法測(cè)定了該蛋白對(duì)人外周血淋巴細(xì)胞體外增殖的影響，結(jié)果證實(shí)了牛SP-A對(duì)淋巴細(xì)胞增殖具有明顯抑制作用。本試驗(yàn)結(jié)果與之相似。

抗菌試驗(yàn)證明，rSP-A對(duì)肺炎鏈球菌、巴氏桿菌均有明顯的抑制作用，該結(jié)果與張永紅等[21]報(bào)道豬SP-A的抗菌活性結(jié)果相似。近幾年，人們對(duì)SP-A的抗菌機(jī)制進(jìn)行了研究，初步證實(shí)SP-A主要通過發(fā)揮調(diào)理素作用和對(duì)吞噬細(xì)胞吞噬/殺傷能力的增強(qiáng)作用，間接實(shí)現(xiàn)其抗菌作用[22]。此外，SP-A還具有直接抗菌作用，如SP-A可增強(qiáng)革蘭陰性菌細(xì)胞膜通透性，抑制細(xì)菌的增殖。

綿羊支原體肺炎在我國(guó)發(fā)病率較高，其病原Mo對(duì)大多數(shù)抗生素均不敏感，臨床治療效果不佳。Mo基因組小，其自身生物合成能力較弱，體外培養(yǎng)主要以培養(yǎng)液中的葡萄糖作為能量來源。Mo分解葡萄糖產(chǎn)生的酸會(huì)改變培養(yǎng)液的pH值，酚紅作為一種酸堿指示劑可根據(jù)溶液酸堿度發(fā)生顏色變化，使用酶標(biāo)儀測(cè)定OD550值可間接反映Mo分解代謝葡萄糖的情況。本研究利用這一原理測(cè)定了rSP-A對(duì)Mo代謝的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)rSP-A能夠顯著抑制Mo的生長(zhǎng)代謝；同時(shí)應(yīng)用平板菌落計(jì)數(shù)法檢測(cè)了不同時(shí)期各組Mo菌量，證實(shí)rSP-A能夠顯著抑制Mo的增殖。趙寧等[12]利用平板菌落計(jì)數(shù)法和熒光定量PCR技術(shù)也證實(shí)了rSP-A對(duì)Mo具有抑菌活性。那么，rSP-A是通過抑制Mo的代謝而發(fā)揮其抑菌作用，還是其對(duì)Mo的抑菌作用導(dǎo)致Mo代謝減弱，這也是今后要深入探討的問題。

呼吸系統(tǒng)疾病是阻礙養(yǎng)羊業(yè)健康發(fā)展的主要疾病之一，本試驗(yàn)選擇了羊的肺炎鏈球菌、巴氏桿菌和Mo為試驗(yàn)對(duì)象，這是因?yàn)樯鲜鲋虏【茄蚝粑到y(tǒng)疾病的常見病原，為將來SP-A被開發(fā)為一種抗菌制劑廣泛應(yīng)用于羊的呼吸系統(tǒng)疾病的防治奠定基礎(chǔ)。