改良腦灌注固定方法在組織透明技術(shù)中的效果評估

童海洋，張金，朱清俊，徐金勇,2*，張曉明,2*

(1. 中國科學(xué)院合肥物質(zhì)科學(xué)研究院，安徽 合肥 230031；2. 安徽醫(yī)科大學(xué)，安徽 合肥 230032)

組織透明技術(shù)可以顯著降低組織內(nèi)部光的散射和吸收，使組織樣本處于近乎透明的狀態(tài)[1]。然而，目前該技術(shù)還處于方法的開發(fā)和優(yōu)化階段[2]?，F(xiàn)有的主動透明技術(shù)如丙烯酰胺交聯(lián)替換脂質(zhì)透明硬化成像/免疫染色/原位雜交兼容組織水凝膠(Clear Lipid-Exchanged Acrylamide-Hybridized Rigid Imaging/Immunostaining/In situ Hybridization-Compatible Tissue-Hydrogel，CLARITY)等雖然透明效果好，但免疫熒光標(biāo)記速度慢，設(shè)備投入高，一般實驗室難以實現(xiàn)，且操作較為繁瑣，其廣泛運(yùn)用存在局限性[3]。有機(jī)溶劑型透明方法的透明效果較好，操作簡單，然而大部分有機(jī)溶劑具有毒性，不利于實驗人員的健康，且有機(jī)溶劑常導(dǎo)致熒光淬滅，組織形態(tài)結(jié)構(gòu)也會發(fā)生較大變化導(dǎo)致圖像失真，實際應(yīng)用較少。親水性的透明技術(shù)比有機(jī)溶劑型的熒光保存度高，操作便捷，對需要多種標(biāo)記以及帶轉(zhuǎn)基因熒光的試驗樣本非常適合，但缺點是透明速度較慢[4]。因此，開發(fā)和優(yōu)化新型透明技術(shù)已迫在眉睫。

灌注固定是腦組織透明步驟中非常重要的一個環(huán)節(jié)，腦組織能否充分灌注固定，內(nèi)部的血液能否較充分的沖洗干凈對后期透明至關(guān)重要。目前，經(jīng)典的灌注技術(shù)還是經(jīng)心臟灌注，該方法耗時較長且需要大量的灌注液，尤其針對體型較大的動物，心臟灌注法的局限性更大，灌注效果也不理想。本文介紹了經(jīng)雙側(cè)頸總動脈灌注的方法，并分析其在組織透明成像技術(shù)中的優(yōu)越性。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

SPF級SD大鼠12只，購于北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司；清潔級新西蘭兔6只，購買于武漢市萬千佳興生物科技有限公司。動物飼養(yǎng)于高場磁共振成像安徽省重點實驗室(實驗動物使用許可證號SYXK皖2018-005)，動物每日12 h黑暗12 h光照，環(huán)境溫度維持在20～24 ℃，相對濕度維持在40%～65%，并給予充足的飲水和飼料。動物實驗獲得中國科學(xué)院合肥物質(zhì)科學(xué)研究院倫理委員會批準(zhǔn)。

1.2 主要試劑

水合氯醛、OCT包埋劑、PBS、Trtion X-100、多聚甲醛、DAPI和抗熒光衰減封片劑均購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；Anti-CD31 Rabbit pAb及其二抗(山羊抗兔HRP TSA-FITC)購自武漢塞維爾生物公司。

1.3 三通裝置制作

取三通閥2個(揚(yáng)州洋生醫(yī)藥科技有限公司生產(chǎn))，1個用于2個18G的Y靜脈留置針連接三通閥的兩端(灌注新西蘭兔用)，另1個用于2個22G的Y型靜脈留置針連接三通閥的兩端(灌注大鼠用)。三通閥另一端用充滿生理鹽水的150 mL注射器連接，并測試是否漏水，保證連接緊密且無氣泡，然后關(guān)閉三通閥待用。

1.4 灌注固定程序

SD大鼠和新西蘭兔各分為2組，試驗組和對照組各半。試驗組通過雙側(cè)頸動脈灌注，對照組采用常規(guī)的心臟灌注。灌注前SD大鼠和新西蘭兔均用7%的水合氯醛腹腔注射深度麻醉。

經(jīng)心灌注技術(shù)固定：動物麻醉后在胸部和腹部交界處做一個5 cm左右皮膚切口，用剪刀在膈膜上做一個小切口，沿胸腔慢慢剪開膈肌，暴露胸腔，將胸部肌肉和胸骨反方向翻開，顯露心包，揭開心包膜。將裝滿生理鹽水的20 mL注射器的針頭經(jīng)心尖緩慢插入主動脈(眼觀主動脈處可見針頭)，用持針鉗夾住插入針頭的主動脈以防脫落，以及防止灌注液滲漏。當(dāng)生理鹽水注入主動脈時，用眼科剪在動物的右心耳上開盡可能大的切口，減輕心內(nèi)壓力。當(dāng)右心房流出的液體清亮?xí)r(此時肝臟內(nèi)血液被沖洗干凈，顏色變淡)，換4%多聚甲醛進(jìn)行固定，當(dāng)觀察到動物抽搐后僵直的狀態(tài)即證明灌注成功。

經(jīng)雙側(cè)頸動脈灌注法固定：動物仰臥位正中切開頸部皮膚，鈍性分離皮下組織，暴露氣管，分離氣管兩側(cè)肌肉暴露兩側(cè)頸動脈，并分離動脈伴行的神經(jīng)，然后將備好的三通裝置的靜脈留置針往遠(yuǎn)心端方向插入一側(cè)的頸動脈，確認(rèn)在血管內(nèi)時拔出留置針頭，并用外科縫線打結(jié)固定，另一側(cè)行相同的操作。確認(rèn)固定好留置針后，在保證不損傷頸動脈的前提下盡可能大的剪開兩側(cè)頸靜脈。當(dāng)頸靜脈流出的液體清亮?xí)r，換4%多聚甲醛進(jìn)行固定，在觀察到動物頭部抽動時即證明灌注成功。

1.5 開顱取腦

剪去頭部，在背側(cè)頸部與鼻之間做一縱向切口，露出頭骨。修剪剩下的頸部肌肉，用剪刀尖端插入枕骨大孔內(nèi)，小心地用剪刀(注意向上提剪防止損傷腦組織)沿枕骨大孔內(nèi)表面直至顱骨表面的遠(yuǎn)端剪開，用咬骨鉗清除小腦周圍以及大腦背側(cè)的骨組織，直至分離出整個腦組織；用手術(shù)刀切斷大腦腹側(cè)的嗅球和神經(jīng)連接；用眼科剪除去連接的硬腦膜，取出腦組織置于4%多聚甲醛溶液中過夜，多聚甲醛溶液的體積至少是腦組織體積的10倍。

1.6 組織透明

將腦組織置入適配的腦模具中，從視交叉開始用刀片向后制作3 mm厚度的腦冠狀切片。然后將樣品放入含有組織透明溶液的離心管中(具體配方專利保護(hù)中)，所有含有樣品的離心管均浸入恒溫水浴鍋(37 ℃)中放置3 d。

1.7 光學(xué)成像及透光率檢測

3 d后，腦切片基本透明，小心地取出腦片，用體視顯微鏡拍取清晰的組織照片。然后用紫外分光光度計測定透明溶液及透明組織的透光率：用空的比色皿檢測空氣的透光率，然后以空氣為空白參照，檢測透明溶液的透光率，再將待測樣本放入含有透明溶液的比色皿中，讓光穿過組織，以透明溶液透光率為標(biāo)準(zhǔn)檢測透明組織的透光率。

1.8 免疫熒光和HE染色

取部分腦組織做石蠟切片進(jìn)行HE 染色，對照組和試驗組分別選取相同位置的切片進(jìn)行紅細(xì)胞計數(shù)，并進(jìn)行對比分析。其余腦組織樣本放入30%蔗糖PBS溶液中，4 ℃冰箱過夜至沉底。取出腦組織，用OCT包埋劑包埋，然后用冰凍切片機(jī)以20 μm 的厚度進(jìn)行切片。采用常規(guī)的冰凍切片免疫熒光法處理樣本，標(biāo)記血管內(nèi)皮細(xì)胞，并用DAPI染核。

1.9 統(tǒng)計方法

采用SPSS20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，試驗重復(fù)3次，數(shù)據(jù)以“平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，采用t檢驗進(jìn)行分析處理。P<0.05表明差異顯著，P<0.01則表明差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 灌注固定的比較

腦組織分別經(jīng)2種不同灌注方法灌注固定后，在外觀上并無明顯差異，均呈乳白色，質(zhì)地變硬。SD大鼠的灌注固定結(jié)果顯示，經(jīng)雙側(cè)頸總動脈灌注需要生理鹽水50～60 mL，4%多聚甲醛40～50 mL，而傳統(tǒng)經(jīng)心灌注需要生理鹽水200～250 mL，4%多聚甲醛180～200 mL；新西蘭兔的灌注固定結(jié)果顯示，經(jīng)頸總動脈灌注需要生理鹽水180～220 mL，4%多聚甲醛150～180 mL，而傳統(tǒng)經(jīng)心灌注需要生理鹽水1.2～1.5 L，4%多聚甲醛800～1 000 mL。

對試驗得到的灌注液和固定液數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析顯示：SD大鼠和新西蘭兔經(jīng)頸總動脈灌注固定需要的生理鹽水均較傳統(tǒng)經(jīng)心灌注方法明顯減少，差異極顯著(P<0.01)，所需固定液(4%多聚甲醛)的量也較傳統(tǒng)經(jīng)心灌注明顯減少，差異極顯著(P<0.01)，如圖1和圖2。

注：2種灌注方法比較，**表示所需生理鹽水差異極顯著(P<0.01)，##表示所需4%多聚甲醛差異極顯著(P<0.01)。下同

圖2 新西蘭兔不同灌注固定方法灌注液使用量比較

2.2 光學(xué)成像及透光率比較

SD大鼠腦切片在組織透明溶液中孵育3 d后，外觀均呈透明狀。利用體視顯微鏡對腦切片進(jìn)行拍照也顯示同樣的結(jié)果。透過腦切片可見底部的網(wǎng)格線，可見試驗組(圖3A1)的腦組織透明度要優(yōu)于對照組(圖3A2)，對照組腦切片的腦室上方局部可見紅斑。新西蘭兔腦冠狀切片在孵育3 d后外觀也較透明，試驗組(圖3B1)整體透明度較高，與對照組(圖3B2)相比效果更好，對照組局部有紅色陰影，透光性較差。

利用紫外分光光度計對腦切片進(jìn)行透光率檢測，發(fā)現(xiàn)SD大鼠和新西蘭兔的腦切片透光率均隨著檢測波長的增加而增大，試驗組的透光率在同一波長下要大于對照組，且隨著波長的增加有增大的趨勢。將透光率繪制成曲線，發(fā)現(xiàn)試驗組透光率曲線始終位于對照組曲線的上方(圖3A3，圖3B3)，且隨著檢測波長的增加兩者之間透光率差距增大，進(jìn)一步對不同波長下的透光率進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，在850 nm和900 nm波長下，試驗組的透光率與對照組透光率相比差異均顯著(P<0.05)，在950 nm和1 000 nm波長下，試驗組的透光率與對照組透光率相比差異極顯著(P<0.01)。

2.3 免疫熒光和HE染色

免疫熒光結(jié)果顯示，細(xì)胞均能較好的著色，可見血管內(nèi)皮細(xì)胞圍合的血管，試驗組未觀察到明顯的綠色熒光(圖4A1，圖5A1)，對照組的切片血管內(nèi)可見明顯的綠色熒光，如箭頭所示(圖4B1，圖5B1)。組織切片HE染色顯示細(xì)胞形態(tài)正常，無明顯腫脹，胞漿、胞核無共染，染色清晰且著色均勻，血管和紅細(xì)胞形態(tài)易識別，試驗組未觀察到有紅細(xì)胞(圖4A2，圖5A2)，而對照組可見紅細(xì)胞，如箭頭所示(圖4B2，圖5B2)。

A1.試驗組鼠腦冠狀切片(0.7×)；A2.對照組鼠腦冠狀切片(0.7×)；A3.鼠腦透光率比較；B1.試驗組兔腦冠狀切片(0.8×)；B2.對照組兔腦冠狀切片(0.8×)；B3.兔腦透光率比較。其中：*表示差異顯著(P<0.05)，**表示差異極顯著(P<0.01)，下同

A1.試驗組CD31標(biāo)記血管內(nèi)皮(綠色)，DAPI染核(藍(lán)色)；A2.試驗組HE染色；B1.對照組CD31標(biāo)記血管內(nèi)皮(綠色)，DAPI染核(藍(lán)色)；B2.對照組HE染色

A1.試驗組CD31標(biāo)記血管內(nèi)皮(綠色)，DAPI染核(藍(lán)色)；A2.試驗組HE染色；B1.對照組CD31標(biāo)記血管內(nèi)皮(綠色)，DAPI染核(藍(lán)色)；B2.對照組HE染色

為了更準(zhǔn)確地判定切片內(nèi)紅細(xì)胞數(shù)量，利用顯微鏡對所有HE染色的切片進(jìn)行紅細(xì)胞計數(shù)，將每張切片的紅細(xì)胞個數(shù)進(jìn)行統(tǒng)計，進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，試驗組紅細(xì)胞數(shù)量與對照組相比均具有顯著差異(P<0.05，圖6)。

圖6 不同灌注方法下紅細(xì)胞數(shù)量比較

3 討論

21世紀(jì)被稱為“腦科學(xué)時代”，包括中國在內(nèi)的很多國家相繼提出“腦計劃”，大腦的結(jié)構(gòu)與功能也是科學(xué)家迫切希望掌握的重大問題之一，其對人類和動物疾病的診斷和治療具有重要意義。組織透明技術(shù)作為一項新興的技術(shù)，使科學(xué)家能夠從器官尺度對動物大腦進(jìn)行研究。經(jīng)過透明技術(shù)處理的腦組織能真正意義上達(dá)到視覺透明效果，并借助光學(xué)儀器從整體上研究其內(nèi)部復(fù)雜的結(jié)構(gòu)和功能。組織的不透明源于組織對光的吸收和光的散射。組織內(nèi)吸收可見光的主要分子是血紅蛋白和肌紅蛋白等，它們對光的吸收限制了光進(jìn)入更深層組織，會影響組織透光率。當(dāng)利用光學(xué)手段進(jìn)行組織三維成像時，組織的空間分辨率和對比度大大降低。有文獻(xiàn)報道可以使用雙氧水處理樣本使血紅蛋白漂白或者將樣本放于氨基乙醇的堿性溶液中洗脫除去血紅素[5]。骨骼肌中的肌紅蛋白也可以通過過氧化氫進(jìn)行脫色。然而，過氧化氫等化學(xué)試劑可能會破壞組織的細(xì)胞結(jié)構(gòu)，對熒光的保存也可能存在不利的影響[6-7]。此外，組織內(nèi)部的自發(fā)熒光也會影響光學(xué)成像的結(jié)果。自發(fā)熒光源于組織內(nèi)部的紅細(xì)胞和一些固有熒光分子，如還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)、膠原蛋白和酪氨酸等，也可能源于組織制備時產(chǎn)生的外源性熒光分子，比如組織在用醛類固定液固定后形成的席夫堿會增強(qiáng)自發(fā)熒光。寬波段的熒光會通過降低多個熒光通道的信噪比降低圖像的質(zhì)量，因此，要提高圖像質(zhì)量就必須減少組織自發(fā)熒光的干擾。目前有多種方法可以減少組織的自發(fā)熒光，據(jù)報道，Duong 等[8]發(fā)現(xiàn)在高強(qiáng)度照明下漂白組織可以減少組織的自發(fā)熒光；組織在經(jīng)硼氫化鈉處理后也可以消除席夫堿從而降低自發(fā)熒光[9]；另外，光譜分離法也可以去除寬波段的熒光信號[10]。而這些方法或多或少地會對組織造成破壞。

腦組織的灌注固定是動物組織病理試驗中比較常規(guī)的操作技術(shù)，也是腦組織透明技術(shù)中的關(guān)鍵步驟，灌注固定效果的優(yōu)劣直接影響后期標(biāo)本的保存與制作。腦組織中紅細(xì)胞灌流不充分不僅會影響光學(xué)成像深度，還會對免疫熒光染色產(chǎn)生較大干擾，最終影響組織光學(xué)成像效果[11]。將灌流固定液通過血管注入到動物體內(nèi)是公認(rèn)可行的操作。理論上，灌注液可以通過動物天然的血管通道較好地清除腦組織內(nèi)部的血液。灌注一般是在動物麻醉狀態(tài)下，經(jīng)心臟用生理鹽水或者PBS 對動物進(jìn)行灌流，然后用多聚甲醛、甲醛等不同類型的固定液進(jìn)行灌流固定，可有效避免抗原成分的丟失。由于血液循環(huán)系統(tǒng)的通路較多，根據(jù)其特點也衍生出不同的灌流方法，很多科技工作者都曾在灌注固定技術(shù)上進(jìn)行研究和改進(jìn)[12]。經(jīng)心臟灌注的方法簡單可行，易于掌握，目前被廣泛使用[13]。然而，由于頸動脈起始端呈銳角且直徑較小，會增大灌注阻力[14]。因此心臟灌注可能不太理想，尤其是動物體型較大時，弊端更為明顯。因此，開發(fā)好的灌注方法是至關(guān)重要的，本試驗嘗試改進(jìn)了腦組織的灌注方式。

本文介紹了經(jīng)雙側(cè)頸總動脈灌注的方法，與傳統(tǒng)心臟灌注方法相比，灌注路徑較短，能有效減少灌注液和固定液的用量，節(jié)省灌注時間，能快速有效地灌注固定腦組織。在器官尺度上，用雙側(cè)頸動脈灌注的方法較傳統(tǒng)的心臟灌注法得到的透明組織樣本效果更佳，可以明顯提高腦組織的透光率，對組織的透明具有一定的幫助。且在細(xì)胞水平上，該技術(shù)也能有效地減少腦組織內(nèi)部的紅細(xì)胞，可以減少紅細(xì)胞自發(fā)熒光對組織一次甚至多次免疫標(biāo)記熒光成像的干擾，為免疫熒光提供了更為干凈的背景。目前，組織透明技術(shù)有很多種，包括高折射率的有機(jī)溶劑法(如BABB 和DBE等)和水溶性透明法(如Scales和SeeDB 等)[15-18]。科研人員主要集中在開發(fā)新的透明技術(shù)，很少有人注意到組織灌注固定的充分性可能影響組織的透光率。對初學(xué)者而言，大鼠和兔子頸總動脈的解剖位置查找、分離和插管可能有一定的難度，但經(jīng)查閱資料、多次實踐練習(xí)，該技術(shù)也能很好掌握，這對于快速灌注固定以及更有效地組織透明試驗無疑是有益的。