乳腺癌中CBL表達及靶向CBL miRNA的篩選及意義*

劉敏， 羅昭遜， 黃健,3， 晏嬌艷， 陸景潤， 莫非,3， 張姝,3**

(1.貴州醫(yī)科大學(xué) 醫(yī)學(xué)檢驗學(xué)院， 貴州 貴陽 550004； 2.貴州醫(yī)科大學(xué) 兒科學(xué)院， 貴州 貴陽 550004； 3.貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院 臨床檢驗中心， 貴州 貴陽 550004； 4.貴陽市第一人民醫(yī)院 醫(yī)學(xué)檢驗科， 貴州 貴陽 550004)

乳腺癌是發(fā)生在乳腺上皮組織的最常見的惡性腫瘤，2020年已有230萬新發(fā)BC病例，占所有癌癥的11.7%[1]。隨著手術(shù)、放化療、內(nèi)分泌治療等治療策略的不斷完善及多模態(tài)成像設(shè)備的應(yīng)用，BC的治療療效得到了極大的改善[2-4]，但每年仍有約68萬人死于BC。BC的發(fā)生發(fā)展被認為是一個多因素、多階段、多基因改變協(xié)同調(diào)控的復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)[5]。因此，進一步深入研究BC的發(fā)生發(fā)展機制，尋找新干預(yù)靶點，對提高BC患者的生存質(zhì)量具有重要的研究意義。Casitas B系淋巴瘤原癌基因(casitas b-lineage lymphoma,CBL)，又稱c-CBL或CBL2，位于人類染色體11q23.3上，是一種泛素E3連接酶，負責(zé)在不同類型的細胞中針對不同類型的刺激進行信號轉(zhuǎn)導(dǎo)[6-8]。研究表明受體酪氨酸激酶(receptor tyrosine kinase，RTK)與膠質(zhì)母細胞瘤的惡性進展呈正相關(guān)[9-10]，CBL可導(dǎo)致RTK的泛素化，致使其降解[11-12]，抑制腫瘤的發(fā)生發(fā)展[13-14]。因此CBL可能在人類癌癥的發(fā)病機制中起抑癌作用。陸景潤等[15]的研究發(fā)現(xiàn)CBL在BC組織中表達下調(diào)，但對其作用機制未作深入了解。為進一步探究CBL在BC中的作用機制，本研究檢測了BC組織中CBL的表達水平，并進一步利用生物信息數(shù)據(jù)庫預(yù)測與其有相互作用的微核糖核酸(microRNA，miRNA)，旨在探討CBL在BC癌變進程中發(fā)揮的作用及其對應(yīng)的上游調(diào)控機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1樣本收集 收集2015年1月—2018年12月乳腺外科的30對BC組織及癌旁組織(距腫瘤邊緣2～5 cm)，均為女性，36～69歲、平均55.5歲，所有患者均經(jīng)病理學(xué)分析證實為BC，且為初次診斷。

1.1.2主要試劑 TRIzol試劑及引物合成(上海生工生物工程有限公司)，逆轉(zhuǎn)錄Kit及實時熒光定量PCR試劑[寶日醫(yī)生物技術(shù)(北京)有限公司]，RIPA裂解液、BCA試劑盒及蛋白Marker(北京索萊寶科技有限公司)，兔抗人CBL抗體(abcam公司)，兔抗人GAPDH一抗(沈陽萬類生物科技有限公司),羊抗兔二抗(Proteintech公司)。

1.1.3主要儀器 普通PCR儀(美國Thermo Scientific公司)，實時熒光定量PCR儀(Roche)，Western blot電泳儀、轉(zhuǎn)印系統(tǒng)、曝光儀[伯樂生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品(上海)有限公司]。

1.2 方法

1.2.1逆轉(zhuǎn)錄-實時熒光定量聚合酶鏈式反應(yīng)(quantitative and reverse transcription polymerase chain reaction, qRT-PCR)驗證CBL基因及hsa-let-7e-5p的表達 在BC組織和癌旁組織中檢測CBL和hsa-let-7e-5p的表達情況：TRIzol法提取BC組織及癌旁組織總RNA，總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA后用于qRT-PCR，所用的引物序列見表1。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequence

1.2.2Western blot驗證CBL蛋白的表達 在BC組織和癌旁組織中檢測CBL蛋白的表達情況：RIPA裂解BC組織及癌旁組織并提取總蛋白，BCA法測定蛋白濃度；使用SDS-PAGE凝膠進行電泳，200 mA恒定電流轉(zhuǎn)膜2 h，5%脫脂牛奶封閉2 h，使用相應(yīng)的一抗在4 ℃條件下孵育過夜，TBST洗膜3次后，將二抗于室溫下孵育1 h，孵育完成后TBST洗膜3次進行曝光。

1.2.3CBL基因的生存分析 Kaplan-Meier Plotter(http://kmplot.com/analysis/)[16]數(shù)據(jù)庫是一個與惡性腫瘤預(yù)后相關(guān)的在線分析數(shù)據(jù)庫，可以評估54 000多個基因在21種癌癥類型中對于患者預(yù)后的影響。以KaplanMeierPlotter數(shù)據(jù)庫為基礎(chǔ)，評價CBL基因在BC患者中的預(yù)后價值，并繪制了KaplanMeier生存曲線。

1.2.4TIMER數(shù)據(jù)庫分析CBL與多種免疫細胞的相關(guān)性 腫瘤免疫評估資源數(shù)據(jù)庫(tumor immune estimation resource, TIMER)可全面研究腫瘤與免疫相互作用的分子特征[17]。使用該數(shù)據(jù)庫對CBL與BC中6種免疫細胞的相關(guān)性進行分析，包含B細胞、CD8+T細胞、CD4+T細胞、巨噬細胞、中性粒細胞和樹突狀細胞。檢索條件如下：(1)Gene Symbol，CBL；(2)Cancer Types，BRCA。

1.2.5靶向CBLmiRNAs的預(yù)測 通過TarBase(http://carolina.imis.athena-innovation.gr/diana_tools/web/index.php?r=tarbasev8/index)和miRWalk(http://mirwalk.umm.uni-heidelberg.de/)[18]數(shù)據(jù)庫預(yù)測與CBL相關(guān)的miRNAs，將結(jié)果分別上傳到Venn在線工具(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/)中，將兩個數(shù)據(jù)庫的預(yù)測結(jié)果取交集后，獲得重疊的miRNAs。

1.2.6CBL與靶向CBLmiRNA結(jié)合位點的預(yù)測 將CBL3′非翻譯區(qū)(untranslated Regions, UTR)的序列與hsa-let-7e-5p的序列輸入RNAhybrid 2.2[19]軟件，依據(jù)該網(wǎng)站的運算規(guī)則，對結(jié)合位點進行預(yù)測，選取最小配對自由能對應(yīng)的位點作為CBL3′ UTR與hsa-let-7e-5p的結(jié)合位點。

1.2.7生物信息學(xué)工具分析miRNAs的表達情況 UCSC Xena網(wǎng)站[20](https://xenabrowser.net/datapages/)集合了包括TCGA、CCLE等在內(nèi)的200多個數(shù)據(jù)集，利用該網(wǎng)站從TCGA數(shù)據(jù)庫下載756例BC組織樣本和76例正常乳腺組織中預(yù)測的5種miRNAs的表達譜，并對其表達進行分析。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 CBL在BC組織中的表達

qRT-PCR檢測結(jié)果顯示，與癌旁組織比較，BC組織中CBL表達下調(diào)(P<0.05)。見圖1A。Western blot檢測結(jié)果顯示，與癌旁組織比較，BC組織中CBL蛋白表達下調(diào)(P<0.05)。見圖1B。與qRT-PCR結(jié)果趨勢一致。

注：A為qRT-PCR結(jié)果，B為Western blot結(jié)果；(1)與癌旁組比較，P<0.05。圖1 qRT-PCR及Western blot檢測CBL在BC組織中的表達Fig.1 Detection of CBL expression in BC by qRT-PCR and Western blot

2.2 BC患者腫瘤組織中CBL的表達與臨床資料的關(guān)系

CBL的表達水平與患者的轉(zhuǎn)移情況顯著相關(guān)(P<0.05)，而與BC患者的pTNM分期、分子分型及年齡無關(guān)。見表2。

表2 CBL的表達與BC患者臨床資料的關(guān)系[n(%)]Tab.2 Correlation between the expression of CBL and the clinical data of patients with BC[n(%)]

2.3 CBL高表達與BC患者的預(yù)后的相關(guān)性

CBL與BC患者的總生存期(overall survival,OS)有關(guān)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，高表達CBL的BC患者OS較短，預(yù)后較差。見圖2。

圖2 CBL與BC患者的預(yù)后相關(guān)性Fig.2 Correlation of CBL and the prognosis of BC patients

2.4 CBL的表達與BC的腫瘤純度和免疫浸潤水平相關(guān)性

CBL的表達與腫瘤的純度呈負相關(guān)性，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(r=-0.118，P<0.05)；與B細胞(r=0.183，P<0.05)、CD8+T細胞(r=0.392，P<0.05)、CD4+T細胞(r=0.329，P<0.05)、巨噬細胞(r=0.34，P<0.05)、中性粒細胞(r=0.404，P<0.05)和樹突狀細胞(r=0.333，P<0.05)呈正相關(guān)性。見圖3。

注：Purity為腫瘤純度，B Cell為B細胞，CD8+ T Cell為CD8+ T細胞，CD4+ T Cell為CD4+ T細胞，Macrophage為巨噬細胞，Neutrohil為中性粒細胞，Dendritic Cell為樹突狀細胞。圖3 BC中CBL的表達與腫瘤純度和免疫細胞浸潤水平的相關(guān)性Fig.3 Correlation of CBL expression in BC with tumor purity and immune cell infiltration level

2.5 靶向CBL miRNA的預(yù)測

為進一步探索CBL的作用機制，本研究利用TarBase和miRWalk數(shù)據(jù)庫預(yù)測與CBL相關(guān)的miRNAs，分別有20個和958個；利用Venn在線工具將兩者取交集共獲得5個miRNAs，分別為hsa-miR-7-5p、hsa-miR-28-5p、hsa-miR-378a-3p、hsa-miR-876-3p及hsa-let-7e-5p。見圖4。

注：深色為TarBase預(yù)測的作用于CBL miRNAs，淺色為miRWalk預(yù)測的作用于CBL miRNAs。圖4 韋恩圖獲取預(yù)測的miRNAs的交集Fig.4 Venn diagram to obtain the intersection of predicted miRNAs

2.6 hsa-let-7e-5p與CBL結(jié)合位點的預(yù)測

通過RNAhybrid 2.2軟件對CBL3′UTR的序列與hsa-let-7e-5p的結(jié)合位點進行預(yù)測，發(fā)現(xiàn)在CBL的3′ UTR的第5017個核苷酸處存在結(jié)合位點，表明hsa-let-7e-5p可能通過與CBL結(jié)合發(fā)揮生物學(xué)功能。見圖5。

圖5 預(yù)測的CBL 3′UTR與hsa-let-7e-5p的結(jié)合位點Fig.5 Predicted binding site of CBL 3′UTR and hsa-let-7e-5p

2.7 靶向CBL miRNAs在BC組織中的表達

為進一步驗證與靶向CBLmiRNAs，本研究從TCGA數(shù)據(jù)庫下載并分析5個miRNAs在BC組織中的表達，結(jié)果顯示hsa-miR-28-5p、hsa-miR-378a-3p和hsa-miR-876-3p在BC組織中低表達，而hsa-let-7e-5p和hsa-miR-7-5p在BC組織中高表達(P<0.05)。見圖6A。結(jié)合miRNA-mRNA的負調(diào)控機制以及文獻檢索[21]，本研究將hsa-let-7e-5p作為后續(xù)研究對象，利用qRT-PCR對30例BC組織及相應(yīng)的癌旁組織進行檢測，發(fā)現(xiàn)hsa-let-7e-5p在BC組織中高表達(P<0.05)。見圖6B。這一結(jié)果與生物信息學(xué)所得趨勢一致。

注：A為TCGA數(shù)據(jù)庫中5種miRNAs的表達，B為hsa-let-7e-5p在BC組織中的qRT-PCR驗證結(jié)果；(1)與正常組比較，P<0.05；(2)與癌旁組織比較，P<0.05。圖6 miRNAs在正常組織或癌旁組織及BC組織中的表達Fig.6 The expression of miRNAs in normal tissues or adjacent tissues and BC tissues

3 討論

BC是女性最為常見的惡性腫瘤之一，且發(fā)病率和病死率逐年增長[22]，成為威脅女性健康的“頭號殺手”。由于BC發(fā)病早期缺乏典型性和特異性臨床癥狀及體征，多數(shù)患者確診時已有淋巴結(jié)、骨及腦等遠處轉(zhuǎn)移的中晚期體征，嚴重威脅女性的身心健康，成為女性癌癥死亡的最大原因。因此，尋找干預(yù)BC發(fā)生發(fā)展的靶標已成為當代學(xué)者研究的熱點。CBL是一種蛋白質(zhì)編碼基因，可編碼含有RING (really interesting new gene)指結(jié)構(gòu)域的E3泛素-蛋白質(zhì)連接酶。編碼的CBL蛋白可介導(dǎo)泛素從E2泛素結(jié)合酶轉(zhuǎn)移至特定底物。此外還包含一個N末端磷酸酪氨酸激酶結(jié)合域，該結(jié)構(gòu)域可使其與眾多酪氨酸磷酸化的底物相互作用，并使得蛋白酶體降解。因此，CBL可充當許多信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的負調(diào)節(jié)劑。研究表明，CBL在胰腺導(dǎo)管腺癌[23]、非小細胞肺癌[11]及結(jié)直腸癌[12]的發(fā)生、發(fā)展、治療及預(yù)后中發(fā)揮重要作用。Jing等[24]在神經(jīng)膠質(zhì)瘤患者樣本中通過免疫組織化學(xué)、Western blot和qRT-PCR實驗，繪制KaplanMeier生存曲線，并進行Cox回歸分析表明膠質(zhì)瘤中c-Cbl高表達與腫瘤進展和不良預(yù)后有關(guān)。Yu等[12]發(fā)現(xiàn)miRNA-155可靶向作用于CBL調(diào)控結(jié)腸癌細胞的增殖、細胞周期、凋亡和遷移。以上研究說明CBL與癌癥的發(fā)生發(fā)展存在密切的關(guān)系。為進一步探究CBL在BC中的作用，本研究利用qRT-PCR和Western blot從mRNA和蛋白層面檢測了BC組織中CBL的表達，兩者結(jié)果均顯示BC組織中CBL表達下調(diào)。KaplanMeier分析顯示CBL低表達，患者預(yù)后好。對BC患者臨床病理資料與CBL相對表達量相關(guān)性分析顯示，CBL與轉(zhuǎn)移情況有關(guān)。本研究表明BC組織中可見大量免疫細胞浸潤，參與BC的發(fā)生發(fā)展[25]。不僅如此，CBL的表達與腫瘤的純度呈負相關(guān)性，與B細胞、CD8+T細胞、CD4+T細胞、巨噬細胞、中性粒細胞和樹突狀細胞呈正相關(guān)性，提示CBL與BC的免疫浸潤相關(guān)，可能通過與免疫細胞相互作用而影響B(tài)C的進展，但具體的作用機制仍需進一步探索。

miRNA是一類長度約20～22個寡核苷酸的短小單鏈非編碼RNA。miRNA可通過與其靶基因的mRNA的3′UTR結(jié)合，降解靶基因mRNA或抑制靶基因的翻譯，最終起到調(diào)控靶基因蛋白表達的作用，在癌癥中間接發(fā)揮抑癌因子或促癌因子的作用[26-27]。生物信息學(xué)分析與qRT-PCR結(jié)果均顯示hsa-let-7e-5p在BC組織中高表達，這與Oztemur[28]和Silva等[29]的報道一致。hsa-let-7e-5p在BC組織中高表達而CBL低表達，且hsa-let-7e-5p與CBL的3′UTR之間存在結(jié)合位點，以上結(jié)果提示hsa-let-7e-5p可負調(diào)控CBL。因此，本研究推測hsa-let-7e-5p通過負向調(diào)控CBL的表達，影響B(tài)C的發(fā)生發(fā)展。

綜上所述，CBL可作為BC的潛在生物標志物，其低表達與BC患者的預(yù)后相關(guān)。hsa-let-7e-5p可能通過負向調(diào)控CBL的表達來發(fā)揮生物學(xué)功能，但具體作用機制有待進一步探索和研究。