不同生長方式防風的HPLC特征圖譜和體外抗炎活性比較研究△

李依林，薛雪，王海麗，韓婷，劉夢楠，魏鋒，李向日*

1.北京中醫(yī)藥大學 中藥學院，北京 102488；

2.中藥品質(zhì)中心北京市重點實驗室，北京 102488；

3.中國食品藥品檢定研究院，北京 100050

防風為傘形科植物防風Saposhnikovia divaricata(Turcz.) Schischk.的干燥根，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，被列為上品，味辛、甘，性微溫，歸膀胱、肝脾經(jīng)，具有祛風解表、勝濕止痛、止痙的功效，主要用于治療感冒頭痛、風濕痹痛、風疹瘙癢、破傷風[1]。其主要含有揮發(fā)油類、香豆素類、色原酮類等成分，色原酮類成分是其發(fā)揮藥效的主要物質(zhì)基礎，具有解熱鎮(zhèn)痛、抗炎及抗血小板聚集等作用[2]。

目前市場上流通的防風根據(jù)其生長方式大致分為3類，即野生防風、多年生栽培防風和1年生栽培防風。野生防風是自然界中自然生長的防風，在我國主產(chǎn)于黑龍江、吉林、內(nèi)蒙古等地，在其他國家主要分布于蒙古國、俄羅斯等地。由于其在生長過程中沒有人為干預，一般為3 年以上生，產(chǎn)量較低。栽培防風主產(chǎn)于我國內(nèi)蒙古、黑龍江、吉林、遼寧、河北等地。由于黑龍江、內(nèi)蒙古等地區(qū)氣候寒冷，既有1 年生防風也有多年生防風，而河北安國等地防風栽培第二年出現(xiàn)抽薹，嚴重影響產(chǎn)量，因此所產(chǎn)均為1 年生防風。多年生栽培防風采用種子直播并選擇粗放的方式管理，生長過程中沒有人為干預，不施肥、不噴農(nóng)藥，多為2～6年生；1年生栽培防風僅生長1 年，且在種植過程中通過施肥、噴灑農(nóng)藥等進行人為干預。由于生長方式的不同，防風之間的質(zhì)量差異也較大。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，僅野生防風符合《中華人民共和國藥典》（以下簡稱《中國藥典》）2020 年版中對防風外觀性狀的規(guī)定，栽培品均不符合該規(guī)定，即《中國藥典》2020 年版中并未收載栽培防風飲片的性狀。然而，由于野生防風資源匱乏，現(xiàn)今在市場流通的主要是栽培品。作為1 味臨床常用中藥，防風質(zhì)量直接影響到其臨床療效，栽培防風能否納入《中國藥典》值得研究[2-3]。

本研究對54 批不同生長方式防風的高效液相色譜法（HPLC）圖譜進行研究，得到野生、多年生栽培品及1 年生栽培品的特征圖譜，并通過特征圖譜對其生長方式進行區(qū)分?？寡鬃饔檬欠里L的主要藥理作用之一，研究表明，防風可以通過抑制小鼠巨噬細胞RAW264.7 釋放一氧化氮（NO）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）等炎癥因子來發(fā)揮抗炎作用[4]。本研究采用脂多糖（LPS）誘導RAW264.7細胞分泌炎癥因子，對3 種生長方式防風體外抗炎作用效果進行比較，為防風質(zhì)量控制及標準的制定提供參考，推動防風更好地用于臨床疾病的治療。

1 材料

1.1 儀器

FW100 型高速萬能粉碎機（天津市泰斯特儀器有限公司）；BT 125D 型電子天平（北京賽多利斯科學儀器有限公司）；B-220 型電熱恒溫水浴鍋（上海亞榮生化儀器廠）；Waters 2695 型高效液相色譜儀；Agilent ZORBAX SB-C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；SARTORIUS AG 型分析天平（北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司）；SPECTRO star Nano 型全波長酶標儀（BMG Labtech 公司）；Form 311 型二氧化碳培養(yǎng)箱（Thermo Scientific公司）。

1.2 樣品

共收集防風樣品54 批（表1），產(chǎn)地分布于蒙古國、俄羅斯、中國黑龍江省、中國內(nèi)蒙古自治區(qū)等地，分別為野生品12 批、多年生（2～6 年）栽培品16 批、1 年生栽培品26 批，其中3～12 號樣品為防風飲片（批號分別為FF-YP-HM-15、FF-YP-HM-16、FF-YP-HM-17、FF-YP-HM-18、FF-YP-HM-19、FFYP-HM-20、FF-YP-HM-21、FF-YP-HM-22、FF-YPHM-23、FF-YP-HM-24），其余樣品采集時為防風藥材，前期已按照《中國藥典》2015年版（四部）炮制通則項下凈制和切制的方法炮制成飲片，3種防風飲片外觀性狀見圖1。樣品均為課題組人員親自采集，經(jīng)北京中醫(yī)藥大學李向日教授鑒定為傘形科植物防風Saposhnikovia divaricata(Turcz.) Schischk.的干燥根。

表1 防風樣品信息

圖1 不同生長方式及生長年限防風飲片的外觀性狀

1.3 細胞

小鼠單核巨噬細胞RAW264.7 購于北京協(xié)和細胞庫。

1.4 試劑

對照品升麻素苷（批號：0083-0025）、升麻素（批號：0084-0020）、5-O-甲基維斯阿米醇苷（批號：0081-0025）、亥茅酚苷（批號：0969-0025）均購自成都普思生物科技股份有限公司，純度均大于98.0%；防風對照藥材（批號：120947-201409）購自中國食品藥品檢定研究院；LPS（Sigma 公司）；噻唑藍（MTT，Amresco 公司）；腫瘤壞死因子-α（TNF-α）ELISA 檢測試劑盒（Cloud-Clone 公司）；NO 檢測試劑盒（BioDee 公司）；胎牛血清（Gemini公司）；DMEM高糖培養(yǎng)基（Corning-Cellgro公司）；青鏈霉素（Mediatech公司）；二甲基亞砜（DMSO，Sigma公司）；甲醇（色譜純，F(xiàn)isher公司）；娃哈哈純凈水。

2 方法

2.1 特征圖譜

2.1.1 色譜條件 采用Agilent ZORBAX SB-C18色譜柱（250 mm×4.6 mm,5 μm），檢測波長為254 nm，流速為1.0 mL·min-1，柱溫為35 ℃，進樣量為10 μL，流動相為甲醇（A）-水（B），梯度洗脫（0～5 min，15%～35%A；5～15 min，35%A；15～20 min，35%～45%A；20～29 min，45%A；29～35 min，45%～55%A；35～41 min，55%～65%A；41～55 min，65%～76%A；55～65 min，76%A，65～70 min，76%～83%A）。

2.1.2 供試品溶液制備 精密稱定防風樣品細粉約0.25 g，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇10 mL，稱定質(zhì)量，水浴回流2 h，放冷，再稱定質(zhì)量，用甲醇補足減少的質(zhì)量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，作為供試品溶液。

2.1.3 對照藥材溶液和對照品溶液制備 精密稱定防風對照藥材約0.25 g，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇10 mL，稱定質(zhì)量，水浴回流2 h，放冷，再稱定質(zhì)量，用甲醇補足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，作為對照藥材溶液。取對照品升麻素苷、5-O-甲基維斯阿米醇苷、升麻素、亥茅酚苷各適量，加甲醇分別配制成質(zhì)量濃度分別為0.320、0.120、0.280、0.033 mg·mL-1的溶液，作為對照品溶液。

2.1.4 精密度試驗 取同一份供試品溶液（13號），重復進樣6次，所測7個特征峰的相對保留時間及相對峰面積RSD均小于2%，符合要求，表明儀器精密度良好。

2.1.5 穩(wěn)定性試驗 取同一份供試品溶液（13號），分別在0、2、4、8、12、24 h 進樣測定，所測7 個特征峰的相對保留時間及相對峰面積RSD 均小于2%，表明樣品在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.1.6 重復性試驗 取同一批樣品細粉6份（44號），按2.1.2 項下方法制備供試品溶液，進樣測定，所測7 個特征峰的相對保留時間及相對峰面積RSD 均小于3%，表明方法重復性良好。

2.1.7 樣品測定 按2.1.1 項下方法分別精密吸取對照品溶液、對照藥材溶液與供試品溶液各10 μL，注入液相色譜儀，記錄54批防風的HPLC色譜圖。

2.2 不同生長方式防風抗炎作用的比較研究

2.2.1 水提物的制備 分別稱取野生防風飲片（3號）、多年生栽培防風飲片（24號）、1年生防風飲片（53號）各約5 g，分別置于圓底燒瓶中，加入水75 mL 回流2 h，濾過，取續(xù)濾液。濾渣再加入水75 mL 回流1 h，濾過，合并2次濾液，旋蒸干燥，得到水提物，提取率分別為21.40%、43.88%、44.66%。3 種水提物中升麻素苷、升麻素5-O-甲基維斯阿米醇苷以及亥茅酚苷4 種色原酮質(zhì)量分數(shù)之和分別為4.22%、1.47%、0.92%。3 種水提物各精密稱定約1 g，用DMSO溶解后，用DMEM 完全培養(yǎng)基稀釋（DMSO體積分數(shù)為0.3%，對細胞無毒性作用），得到含水提物250 μg·mL-1的DMEM培養(yǎng)基。

2.2.2 細胞培養(yǎng) RAW264.7 細胞加入含10%胎牛血清、1%雙抗的DMEM 高糖培養(yǎng)基，于含5%CO2、37 ℃培養(yǎng)箱中傳代培養(yǎng)，隔天傳代。

2.2.3 MTT 法檢測3 種防風水提物對RAW264.7 細胞存活率的影響 取對數(shù)生長期的RAW264.7細胞，調(diào)整細胞密度為1×105個/mL，接種于96 孔板，每孔100 μL，置于含5% CO2、37 ℃培養(yǎng)箱中孵育24 h。對照組吸取上清液后每孔加入DMEM 完全培養(yǎng)基100 μL；各藥物組的上清液分別換為含3 種不同水提物250 μg·mL-1的DMEM 完全培養(yǎng)基100 μL。每組均設3 個復孔，在培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)24 h 后吸取上清液，每孔加入MTT 溶液10 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，棄上清液，每孔加入DMSO 150 μL，置搖床上低速振蕩10 min，使結晶物充分溶解。在酶標儀上于490 nm檢測吸光度（A）。實驗重復3 次，按照公式（1）計算細胞存活率[5]。

2.2.4 3種防風水提物對LPS刺激的RAW264.7細胞NO、TNF-α釋放的影響 取對數(shù)生長期的RAW264.7細胞，調(diào)整細胞密度為1×106個/mL，接種于24 孔板，每孔500 μL，置于含5%CO2、37 ℃培養(yǎng)箱中孵育24 h。細胞貼壁后，棄上清液，用含3種不同水提物250 μg·mL-1的DMEM 完全培養(yǎng)基和含1 μg·mL-1LPS的DMEM 完全培養(yǎng)基處理，實驗分為對照組、模型組（LPS 組）、野生組、多年生栽培組、1 年生栽培組。各藥物組的給藥方式為先加入對應的含藥培養(yǎng)基500 μL，預處理1 h 后，吸去含藥培養(yǎng)基，加入含1 μg·mL-1LPS 的DMEM 完全培養(yǎng)基500 μL，孵育24 h；模型組加入含1 μg·mL-1LPS 的DMEM 完全培養(yǎng)基500 μL，孵育24 h；對照組直接加入DMEM完全培養(yǎng)基500 μL，孵育24 h。每組3 個復孔。孵育結束后，收集上清液，利用試劑盒檢測上清液中NO、TNF-α水平。

2.3 統(tǒng)計分析

數(shù)據(jù)采用SPSS 20.0統(tǒng)計軟件處理，使用箱式圖對各組內(nèi)升麻素相對峰面積進行分析，剔除離群值；特征峰相對峰面積及RAW264.7 細胞NO、TNF-α釋放的組間比較采用單因素方差分析或非參數(shù)檢驗。采用SIMCA 13.0 對3 種防風飲片特征圖譜中特征峰相對峰面積進行偏最小二乘法-判別分析（PLS-DA）。

3 結果

3.1 特征圖譜

3.1.1 3 種生長方式防風特征圖譜的建立 通過“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)”（2012 版）生成不同生長方式及年限防風飲片的對照特征圖譜（圖2）。54 批樣品特征圖譜存在1、3、4～7 共6 個共有峰。此外，2 號峰為升麻素，其在非野生品中含量很小，有些批次甚至含量為0，而升麻素為防風的主要藥效成分及入血成分，也是區(qū)分防風生長方式的重要指標[6]，與防風飲片的質(zhì)量密切相關，故將2號峰與其他6個共有峰共列為特征峰。

圖2 防風飲片HPLC特征圖譜

3.1.2 不同生長方式防風特征圖譜相對保留時間和相對峰面積 供試品色譜圖中與對照特征圖譜相對保留時間范圍內(nèi)一致的7 個特征峰，以5-O-甲基維斯阿米醇苷為參照峰，將其保留時間和峰面積均定義為1，計算54 批防風飲片特征峰的相對保留時間（表2）和相對峰面積（表3）。比較3 種不同生長方式防風7個特征峰相對峰面積，野生防風1、2、4、6號峰相對峰面積與多年生栽培防風和1年生栽培防風差異有統(tǒng)計學意義，多年生栽培防風1、5號峰的相對峰面積與1年生栽培防風差異有統(tǒng)計學意義，見表4。

表2 防風飲片7個特征峰相對保留時間

表3 防風飲片7個特征峰相對峰面積

3.2 不同生長方式防風特征圖譜區(qū)別

3.2.1 野生防風與栽培防風的區(qū)別 SPSS 統(tǒng)計結果顯示，編號為13、17、18 的3 個樣品為異常值（圖3）。通過SPSS非參數(shù)檢驗分析結果發(fā)現(xiàn)，2個異常值17、18 剔除前后野生防風飲片與多年生栽培、1年生栽培防風飲片中的2號峰（升麻素）的相對峰面積差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），結果未發(fā)生變化，故剔除2個異常值。剔除后野生防風飲片中2號峰相對峰面積極小值為0.15，多年生栽培、1年生栽培防風飲片中2號峰相對峰面積極大值為0.09。

圖3 升麻素相對峰面積箱形圖

3.2.2 多年生與1 年生栽培防風特征圖譜的區(qū)別對多年生栽培與1年生栽培防風特征圖譜的7個特征峰相對峰面積及不同相對峰面積的和進行PLS-DA，結果見圖4 和表4。由圖4 可知，42 批栽培防風中，除個別批次樣品外，1年生栽培防風與多年生栽培防風基本可以分別聚為1類，表明其特征圖譜相對峰面積具有差異。然而在所建立的PLS-DA模型中，累計解釋能力參數(shù)R2X和R2Y分別為0.637和0.479，預測能力參數(shù)Q2為0.312，提示所建立的模型穩(wěn)定性及預測能力較差，可能是由于2種栽培防風組內(nèi)差異較大所致。

表4 3種不同生長方式防風特征圖譜相對峰面積（±s）

表4 3種不同生長方式防風特征圖譜相對峰面積（±s）

注：與野生組比較，***P＜0.001；與多年生栽培組比較，##P＜0.01。

圖4 栽培防風飲片PLS-DA得分

3.3 體外抗炎作用比較

MTT 法檢測結果顯示，250 μg·mL-1時3 種提取物在24 h內(nèi)對RAW264.7細胞生長無明顯影響。3種防風對LPS 誘導RAW264.7 細胞NO 和TNF-α釋放的影響結果見圖5～6。與對照組比較，LPS 刺激顯著增加RAW264.7 細胞中NO、TNF-α的產(chǎn)生。與LPS 模型組比較，3 種防風的提取物均顯著抑制了細胞中NO、TNF-α的產(chǎn)生。野生防風提取物對NO和TNF-α產(chǎn)生的抑制作用最強。結果表明，防風提取物在體外均表現(xiàn)出抗炎作用，作用強度為野生組＞多年生栽培組＞1 年生栽培組，野生組與多年生組差異無統(tǒng)計學意義，而1 年生組作用與野生組和多年生栽培組差異均有統(tǒng)計學意義。

圖5 3種防風水提物對脂多糖誘導的RAW264.7細胞NO釋放量的影響（±s,n=3）

圖6 3種防風水提物對脂多糖誘導的RAW 264.7細胞TNF-α釋放量的影響（±s,n=3）

4 討論

4.1 不同生長方式防風特征圖譜的研究

本研究采用梯度洗脫法分離防風中的成分，分離效果良好；通過二極管陣列（DAD）檢測器全波長掃描得到在254 nm波長下吸收最高，故選擇254 nm作為檢測波長。流動相比較了甲醇-0.5%乙酸水系統(tǒng)與甲醇-水系統(tǒng)，發(fā)現(xiàn)甲醇-水梯度洗脫基線更加穩(wěn)定且分離效果更好[7]。對防風的提取時間進行了考察，發(fā)現(xiàn)提取2 h 為最佳提取條件。在對HPLC 圖譜的分析中發(fā)現(xiàn)，使用“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)”2012 版并不能對3 種不同生長方式的方法進行有效區(qū)分，因此，分別生成3 種不同生長方式防風的特征圖譜后進行分析。對3 種防風的特征圖譜進行比較發(fā)現(xiàn)，野生防風的多個特征峰相對峰面積與栽培防風差異有統(tǒng)計學意義，通過2 號峰即升麻素的相對峰面積就能夠?qū)σ吧里L與栽培防風進行區(qū)分。多年生栽培防風與1 年生栽培防風在相對峰面積上差異有統(tǒng)計學意義，在PLS-DA 中顯示出2 種防風的差異。但同時多年生防風樣品也表現(xiàn)出較大的組間差異，尤其是多年生栽培防風由于樣品數(shù)量較少且產(chǎn)地與生長年限差別較大，如17、28 號等樣品與其他樣品間差異過大，對于多年生栽培防風的聚類影響較大。對栽培防風的特征圖譜進行聚類分析發(fā)現(xiàn)產(chǎn)地對其的影響有待進一步研究。

本研究對采集的54 批不同生長方式防風進行了特征圖譜研究，得到了野生、多年生栽培、1 年生栽培3 種不同生長方式防風的特征圖譜，同時證實了升麻素含量是野生品與栽培品的主要區(qū)別指標，通過相對保留時間找到特征峰，再根據(jù)升麻素的相對峰面積可以準確區(qū)分野生品與栽培品。

4.2 不同生長方式防風體外抗炎作用的比較

NO 和TNF-α是體內(nèi)重要的炎癥因子，能夠促進炎癥反應[8]。對不同生長方式防風體外抗炎作用進行研究發(fā)現(xiàn)，3 種不同生長方式的防風在體外均可通過抑制LPS誘導的RAW 264.7細胞分泌NO 和TNF-α發(fā)揮抗炎作用，其中野生防風和多年生栽培防風均有顯著抑制2種炎癥因子的作用，且2種防風作用效果差異無統(tǒng)計學意義；而1年生栽培防風對2種炎癥因子的抑制效果不及前2 種防風，且與野生防風和多年生防風差異有統(tǒng)計學意義。即野生防風與多年生栽培防風抗炎作用效果相近且顯著優(yōu)于1 年生栽培防風。

本研究中多年生防風和1 年生防風在特征圖譜上的區(qū)分不夠明顯，但在體外抗炎實驗結果上區(qū)分明顯，進一步說明防風的抗炎作用不僅與上述色原酮類成分有關，還可能與揮發(fā)油等成分有關。本課題組前期研究結果顯示，多年生防風不僅外觀性狀接近野生防風，揮發(fā)油和色原酮等主要有效成分含量也與野生防風更加接近，而1 年生栽培防風在外觀性狀上與野生防風相去甚遠，且整體成分組成與傳統(tǒng)防風差異較大，與本實驗中不同生長方式防風體外抗炎實驗的結果一致。

防風作為一味臨床常用中藥，野生資源匱乏，現(xiàn)如今市場流通多為栽培品，質(zhì)量參差不齊，1 年生防風充斥市場。因此，建議將多年生栽培防風納入《中國藥典》標準，并結合科學可靠的等級標準使防風能夠更好地用于臨床疾病的治療。