Box-Behnken效應(yīng)面法優(yōu)化粗榧葉總黃酮提取工藝及其體外活性研究△

李思齊，余學(xué)英，何芳

十堰市太和醫(yī)院（湖北醫(yī)藥學(xué)院 附屬醫(yī)院）藥學(xué)部，湖北 十堰 442000

粗榧Cephalotaxus sinensis又名中國粗榧、粗榧杉，為三尖杉科三尖杉屬植物，是著名觀賞樹種，屬國家珍貴樹種[1]，分布于我國甘肅、云南、貴州、廣東、福建、湖北、安徽等地[2]。粗榧的葉、枝、根、種子均可入藥，其中，葉四季均可采用，種子11 月份采用。粗榧因具有較強(qiáng)的抗癌作用，而被稱為“抗癌奇木”[3]。研究發(fā)現(xiàn)，粗榧中主要含有生物堿類[4-5]、黃酮類[2,6]、內(nèi)酯類[7]、苯丙素類[8-9]、二萜類[10]等成分。粗榧的研究多集中在生物堿類成分，黃酮類成分的研究較少。目前，對粗榧葉總黃酮的提取多采用正交設(shè)計(jì)優(yōu)化其工藝[11]，但正交試驗(yàn)法得到的回歸模型精度與預(yù)測性較差，直觀性差[12]，而采用響應(yīng)面法優(yōu)化粗榧葉中總黃酮的超聲提取工藝尚未見報(bào)道。本研究擬采用Box-Behnken效應(yīng)面法對超聲法提取粗榧葉中黃酮的工藝進(jìn)行優(yōu)化，并探討其抗氧化活性，以期為粗榧的進(jìn)一步開發(fā)利用提供參考。

1 材料

1.1 儀器

GPD-1000C 型中藥材粉碎機(jī)（臺州國品樂機(jī)機(jī)械有限公司）；BP211D 型十萬分之一電子分析天平（德國賽多利斯公司）；UV-2550 型紫外-可見分光光度計(jì)（日本島津公司）；KQ-300DE 型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）。

1.2 試藥

粗榧葉購自祁州藥材堂，經(jīng)十堰市太和醫(yī)院陳吉炎教授鑒定為三尖杉科植物粗榧Cephalotaxus sinensis(Rehder et E.H.Wilson) H.L.Li 的干燥葉。對照品蘆?。ㄅ枺簑kq20030203，四川省維克奇生物科技有限公司）；1，1-二苯基-2-苦基肼（DPPH）自由基（批號：20200429，上海寶曼生物科技有限公司）；維生素C（VC，批號：20200105，上海寶曼生物科技有限公司）；2，2'-聯(lián)氮-雙-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸（ABTS，批號：20200624，上海寶曼生物科技有限公司）；乙醇（批號：20191106，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）。

2 方法與結(jié)果

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

采用60%乙醇，超聲溶解，制成質(zhì)量濃度為1.0 mg·mL-1的蘆丁對照品溶液。參考文獻(xiàn)[13]，采用NaNO2-Al(NO3)3-NaOH 法于510 nm 處測定其吸光度，以蘆丁質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X），吸光度值為縱坐標(biāo)（Y），制備標(biāo)準(zhǔn)曲線，回歸方程：Y=6.003 2X-0.003，r=0.999 7。

2.2 總黃酮得率的計(jì)算

稱取粗榧葉粉末1.0 g，置于具塞瓶中，加入一定量的適宜體積分?jǐn)?shù)的乙醇，超聲法提取黃酮，濾過，獲得的上清液即得到粗榧葉總黃酮的提取液。精密量取0.5 mL 濾液置于25 mL 量瓶中，按2.1 項(xiàng)下方法，采用NaNO2-Al（NO3）3-NaOH 顯色法，于510 nm處測定吸光度，并計(jì)算粗榧葉總黃酮的得率。

式中，C為根據(jù)2.1項(xiàng)下獲得回歸方程計(jì)算的提取液中總黃酮的質(zhì)量濃度（mg·mL-1），V為提取液定容后的最終體積（mL），n為稀釋倍數(shù)，m為粗榧葉樣品的質(zhì)量（g）。

2.3 超聲提取工藝優(yōu)化

2.3.1 單因素試驗(yàn)

2.3.1.1 乙醇體積分?jǐn)?shù)對粗榧葉總黃酮得率的影響 固定超聲時(shí)間40 min，液料比為30∶1，考察不同乙醇體積分?jǐn)?shù)（40%、50%、60%、70%、80%）對粗榧葉總黃酮得率的影響，結(jié)果見圖1。隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增加，粗榧葉總黃酮得率呈先升高后緩慢下降的趨勢，當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)為60%時(shí)，總黃酮得率最高。這可能是因?yàn)橐掖俭w積分?jǐn)?shù)為60%時(shí)，提取溶劑極性與粗榧葉中總黃酮相似，有利于總黃酮的溶出，乙醇體積分?jǐn)?shù)超過60%時(shí)，醇溶性雜質(zhì)溶出增加，影響黃酮的溶出。故選擇乙醇體積分?jǐn)?shù)60%作為后續(xù)總黃酮提取工藝優(yōu)化的參數(shù)。

圖1 乙醇體積分?jǐn)?shù)對粗榧葉總黃酮得率的影響（±s,n=3）

2.3.1.2 超聲時(shí)間對粗榧葉總黃酮得率的影響 固定乙醇體積分?jǐn)?shù)60%，液料比為30∶1，考察不同超聲時(shí)間（20、30、40、50、60 min）對粗榧葉總黃酮得率的影響，結(jié)果見圖2。隨著超聲時(shí)間的延長，粗榧葉總黃酮得率呈現(xiàn)先升高后緩慢下降的趨勢，當(dāng)超聲時(shí)間為40 min 時(shí)，總黃酮得率最高。這可能是因?yàn)槌晻r(shí)間短，黃酮沒有完全溶出。超聲時(shí)間為40 min 時(shí)，黃酮基本完全溶出，提取率最高。故選擇超聲時(shí)間40 min 作為后續(xù)總黃酮提取工藝優(yōu)化的參數(shù)。

圖2 超聲時(shí)間對粗榧葉總黃酮得率的影響（±s,n=3）

2.3.1.3 液料比對粗榧葉總黃酮得率的影響 固定乙醇體積分?jǐn)?shù)60%，超聲時(shí)間40 min，考察不同液料比為（10∶1、20∶1、30∶1、40∶1、50∶1）對粗榧葉總黃酮得率的影響，結(jié)果見圖3。液料比增加，粗榧葉總黃酮得率呈現(xiàn)先升高后下降的趨勢，當(dāng)液料比為30∶1 時(shí),總黃酮得率最高。這可能是因?yàn)橐毫媳容^高時(shí)，粗榧葉中黃酮與溶劑接觸不完全，隨著液料比的降低，黃酮溶出速度加快，當(dāng)液料比為30∶1 時(shí)，黃酮的溶出達(dá)到飽和，提取率達(dá)到最大；液料比超過30∶1 時(shí)，增加了雜質(zhì)的溶出，不利于總黃酮的提取。故液料比30∶1 作為后續(xù)總黃酮提取工藝優(yōu)化的參數(shù)。

圖3 液料比對粗榧葉總黃酮得率的影響（±s,n=3）

2.3.2 Box-Behnken 效應(yīng)面法優(yōu)化方案設(shè)計(jì) 依據(jù)單因素試驗(yàn)的結(jié)果，以粗榧葉總黃酮得率為響應(yīng)值，乙醇體積分?jǐn)?shù)（A）、超聲時(shí)間（B）、液料比（C）為自變量，利用Design-Expert 軟件進(jìn)行Box-Behnken設(shè)計(jì)，對粗榧葉總黃酮提取工藝進(jìn)行優(yōu)化。試驗(yàn)因素與水平見表1，結(jié)果見表2。

表1 Box-Behnken響應(yīng)面法優(yōu)化粗榧葉總黃酮提取的因素與水平

表2 Box-Behnken響應(yīng)面法優(yōu)化粗榧葉總黃酮提取的試驗(yàn)設(shè)計(jì)

2.3.3 回歸方程的建立及顯著性分析 根據(jù)Box-Behnken 效應(yīng)面法試驗(yàn)結(jié)果，利用Design-Expert 8.0.6 軟件對表2中的數(shù)據(jù)進(jìn)行多元二次回歸，得到二次多項(xiàng)回歸方程：Y=7.336+0.425A+0.343 75B+0.351 25C+0.202 5AB-0.167 5AC-0.235BC-0.868A2-0.590 5B2-0.135 5C2，該模型的決定系數(shù)R2=0.978 4，調(diào)整系數(shù)R2Adj=0.950 6，表明該方程具有較好的預(yù)測性；變異系數(shù)=2.55%，說明該模型的重現(xiàn)性較好，可用于分析和預(yù)測粗榧葉總黃酮的得率?；貧w模型方差分析見表3。

由表3可知，二次回歸模型的F=35.210 15，P＜0.01，表明回歸方程模型差異高度顯著，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；失擬項(xiàng)P=0.089 799＞0.05，表明該試驗(yàn)不存在失擬因素，所選的因素合理。根據(jù)P值大小可知，

表3 Box-Behnken響應(yīng)面法優(yōu)化粗榧葉總黃酮提取的回歸模型的方差分析

A、B、C、A2、B2對粗榧葉總黃酮得率影響差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），AB、BC 對粗榧葉總黃酮得率的影響稍弱（P＜0.05），AC、C2的影響差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。從P值大小可知，三因素對粗榧葉總黃酮提取結(jié)果的影響順序?yàn)锳＞B＞C。

2.3.4 響應(yīng)面分析 交互因素的響應(yīng)面圖見圖4，響應(yīng)面圖的最高點(diǎn)就是交互因素的最佳條件[14]。從圖4 可知，乙醇體積分?jǐn)?shù)與超聲時(shí)間、超聲時(shí)間與液料比的交互因素中的等高線坡度較陡峭，乙醇體積分?jǐn)?shù)與液料比交互因素的等高線坡度較平緩，說明乙醇體積分?jǐn)?shù)與超聲時(shí)間、超聲時(shí)間與液料比的交互作用對粗榧葉總黃酮的得率影響較大，乙醇體積分?jǐn)?shù)與液料比交互因素對粗榧葉總黃酮的得率影響不顯著，與回歸分析的結(jié)果一致，進(jìn)一步表明所建立的模型較準(zhǔn)確。

圖4 各因素的交互作用對粗榧葉總黃酮得率影響的響應(yīng)面圖

2.3.5 最佳提取工藝和預(yù)測結(jié)果驗(yàn)證 由擬合的響應(yīng)面形狀和已建立的回歸模型得到粗榧葉總黃酮的最佳提取工藝：乙醇體積分?jǐn)?shù)61.92%，超聲時(shí)間41.76 min，液料比37.11∶1，此條件下粗榧葉總黃酮的預(yù)測提取率為7.56%。為使試驗(yàn)便于操作，將最佳提取工藝修正為乙醇體積分?jǐn)?shù)62%，超聲時(shí)間42 min，液料比37∶1。按照修正后的最佳提取工藝驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，粗榧葉總黃酮得率為（7.51±0.13）%，接近預(yù)測值，表明用Box-Behnken響應(yīng)面法所建立的模型可靠，可用于粗榧葉總黃酮提取條件的優(yōu)化和結(jié)果預(yù)測。

2.4 抗氧化活性的測定

2.4.1 DPPH 自由基清除能力的測定 清除DPPH自由基的試驗(yàn)參照申夢娜等[15]的方法，并做如下修改：2 mL 現(xiàn)配的DPPH 溶液分別與2 mL 的不同質(zhì)量濃度的粗榧葉總黃酮提取液進(jìn)行混合，于室溫下避光保存30 min，在516 nm 波長下測定吸光度。以VC為陽性對照，按公式（2）計(jì)算DPPH自由基清除率。

式中，A0為DPPH溶液與無水乙醇混合液的吸光度；A1為不同濃度的粗榧葉總黃酮提取液與DPPH混合液的吸光度；A2為不同濃度的粗榧葉總黃酮提取液與無水乙醇混合液的吸光度；C為DPPH 自由基清除率。

2.4.2 ABTS 自由基清除率測定 參照何珊等[16]的方法，用無水乙醇配置ABTS 溶液，使其在734 nm波長處的吸光度為（0.70±0.02），將粗榧葉總黃酮提取液用無水乙醇稀釋成不同濃度的樣品溶液，以VC作為陽性對照。分別取2 mL 不同濃度的樣品溶液、2 mL 的VC溶液與2 mL ABTS 溶液混合，室溫避光反應(yīng)10 min，用紫外-可見分光光度儀于734 nm 波長處測定粗榧葉總黃酮的吸光度，按公式（3）計(jì)算。

式中，A0為ABTS溶液與無水乙醇混合液的吸光度；A1為不同質(zhì)量濃度的粗榧葉總黃酮提取液與ABTS 混合液的吸光度；A2為不同質(zhì)量濃度的粗榧葉總黃酮提取液與無水乙醇混合液的吸光度；I為ABTS清除率。

粗榧葉總黃酮提取液抗氧化活性結(jié)果見圖5。DPPH 自由基清除實(shí)驗(yàn)表明，粗榧葉總黃酮質(zhì)量濃度為40 μg·mL-1時(shí)，清除率達(dá)到平衡，粗榧葉總黃酮的半數(shù)抑制濃度（IC50，7.835 μg·mL-1）低于VC的IC50（13.574 μg·mL-1）。ABTS+自由基的清除實(shí)驗(yàn)表明，粗榧葉總黃酮質(zhì)量濃度為30 μg·mL-1時(shí)，清除率達(dá)到平衡，粗榧葉總黃酮的IC50（10.551 μg·mL-1）亦低于VC的IC50（16.919 μg·mL-1）。隨著粗榧葉總黃酮提取液質(zhì)量濃度的增加，清除能力都呈現(xiàn)增加的趨勢，并具有明顯的濃度依賴性，且清除效果優(yōu)于陽性對照藥VC。表明粗榧葉總黃酮提取液具有較好的抗氧化活性。

圖5 粗榧葉總黃酮提取液抗氧化活性

3 結(jié)論與討論

本研究以總黃酮得率為響應(yīng)值，選用Box-Behnken 效應(yīng)面法從乙醇體積分?jǐn)?shù)、超聲時(shí)間、液料比等方面對粗榧葉總黃酮的提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，并采用紫外-可見分光光度法對得到的黃酮進(jìn)行測定，最終得到最佳提取工藝為乙醇體積分?jǐn)?shù)62%，超聲時(shí)間42 min，液料比37∶1，粗榧葉總黃酮得率為（7.51±0.13）%，優(yōu)于劉曉嬌等[11]通過正交設(shè)計(jì)優(yōu)化后的工藝獲得的粗榧葉總黃酮（5.91%），且該方法直觀性和與預(yù)測性均優(yōu)于正交設(shè)計(jì)。

體外抗氧化活性試驗(yàn)表明，最佳提取條件下得到的粗榧葉總黃酮提取液對DPPH 自由基的清除率稍高于報(bào)道，且本研究新增了粗榧葉總黃酮提取液對ABTS 自由基清除率的測定。DPPH 自由基及ABTS 自由基的清除率試驗(yàn)結(jié)果均表明，粗榧葉總黃酮提取液具有較強(qiáng)的抗氧化活性，為天然抗氧化劑的開發(fā)提供了新思路，值得進(jìn)一步的研究開發(fā)。