鰱腐敗希瓦氏菌株的16S rRNA鑒定

劉群，王菁，劉桐山，霍文慧，馮守明

（天津市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，天津300402）

鰱（Hypophthalmichthys molitrix）為我國著名四大家魚之一，生長周期短，肉質(zhì)鮮美，具有較高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值，在我國被廣泛養(yǎng)殖。隨著高密度集約化養(yǎng)殖技術(shù)的進(jìn)一步提高，放養(yǎng)密度不斷增加，殘餌、糞便等亦隨之增多，加之水資源緊缺，水交換能力減弱，造成養(yǎng)殖水體富營養(yǎng)化，水質(zhì)污染程度加劇，導(dǎo)致鰱病害頻繁發(fā)生，死亡率逐年增高[1]。

目前已發(fā)現(xiàn)多種病害可對(duì)鰱產(chǎn)量和品質(zhì)造成威脅，如細(xì)菌性敗血癥、鰓霉病、車輪蟲病和指環(huán)蟲病等。其中，細(xì)菌性敗血癥為魚體感染革蘭氏陰性菌造成的，其發(fā)病時(shí)間長，是鰱集約化養(yǎng)殖過程中危害較大的一類疫病[2]。文獻(xiàn)［2-3］研究表明，該病主要由嗜水氣單胞菌（Aeromonas hydrophila）、溫和氣單胞菌（Aeromonas sobria）、魯氏耶爾森菌（Yersinia ruckeri）、產(chǎn)堿假單胞菌（Pseudomonas alcaligenes）、蘇伯利氣單胞菌（Aeromonas sobria）、弧菌（Vibriospp.）等多種細(xì)菌感染引起。

現(xiàn)應(yīng)用平板劃線法對(duì)患病鰱進(jìn)行細(xì)菌分離，對(duì)分離菌株進(jìn)行革蘭氏染色、16S rRNA序列鑒定及系統(tǒng)發(fā)育樹分析，獲得一株腐敗希瓦氏菌（Shewanella putrefaciens）。該研究結(jié)果可為鰱細(xì)菌性敗血癥潛在致病源的研究提供理論依據(jù)和參考。

1 研究方法

1.1 病魚來源

于2021年3月初，在天津市寶坻區(qū)某淡水養(yǎng)殖水庫取鰱病例樣品?；疾■枮?2月齡左右，體長為（40±5）cm，體質(zhì)量為（1.2±0.4）kg。養(yǎng)殖水庫水溫2～4℃，日死亡率約3%。

1.2 觀察病魚

疾病暴發(fā)時(shí)，現(xiàn)場(chǎng)觀察病魚，了解養(yǎng)殖水溫、魚齡、發(fā)病率、死亡率等情況。

1.3 寄生蟲檢查

用常規(guī)顯微鏡檢查病魚體內(nèi)外有無寄生蟲。對(duì)其鰓絲、體表黏液采取水浸片法，肝、脾、腎組織采用壓片法，血液用涂片法，制片后置于顯微鏡下觀察發(fā)病魚體表、鰓和其他內(nèi)臟組織有無寄生蟲。

1.4 細(xì)菌分離培養(yǎng)、革蘭氏染色及鏡檢

取癥狀典型的發(fā)病魚活體，置于解剖盤中，檢查其體表癥狀。使用75%酒精對(duì)病魚體表消毒，無菌環(huán)境下采集其肝、脾、腎組織，于LB瓊脂平板劃線接種，28℃培養(yǎng)24 h；挑取形態(tài)基本一致的單菌落，再進(jìn)行劃線培養(yǎng)，獲得純化的病原分離菌株。將分離得到的菌株接種到LB液體培養(yǎng)基中擴(kuò)大培養(yǎng)后，一部分加甘油于-80℃保存；另一部分進(jìn)行革蘭氏染色并置于顯微鏡下觀察細(xì)菌形態(tài)；還有一部分用于16S rRNA序列的PCR擴(kuò)增。

1.5 分離病原菌16S rRNA序列分析及系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建

（1）細(xì)菌基因組脫氧核糖核酸（DNA）提取及16S rRNA基因序列擴(kuò)增。采用水煮法提取菌株基因組DNA，以通用引物27F/1492R為正反向引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增16S rRNA序列。采用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)目的基因，并將PCR產(chǎn)物送往金唯智生物科技有限公司進(jìn)行測(cè)序。相關(guān)引物序列及檢測(cè)方法信息見表1。

（2）細(xì)菌16S rRNA基因序列及系統(tǒng)發(fā)育樹分析。將16S rRNA測(cè)序結(jié)果通過NCBI Blast檢索系統(tǒng)進(jìn)行序列同源性分析，同時(shí)在NCBI下載已公布的希瓦氏菌屬的16S rRNA基因序列進(jìn)行相似性比較，采用MEGA 7軟件鄰接法（neighbor joining,NJ）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.6 相關(guān)病毒分子生物學(xué)鑒定

（1）核酸提取。切取瀕死發(fā)病魚鰓、肝、脾、腎組織并研磨，于1.5 mL RNase-free離心管中，挑取少量研磨液，使用全自動(dòng)核酸提取純化移液工作站（M5073,Eppendorf）提取樣品核酸，采用超微量核酸測(cè)定儀（IMPLEN,German）測(cè)定其純度及濃度。

（2）病毒PCR檢測(cè)。參考鯉春病毒血癥病毒（SVCV）、錦鯉皰疹病毒（KHV）、鯉皰疹病毒II型（CyHV-II）相關(guān)檢測(cè)方法，進(jìn)行相對(duì)應(yīng)病毒分子生物學(xué)檢測(cè)，相關(guān)檢測(cè)所用引物序列及檢測(cè)方法見表1。

表1 PCR檢測(cè)所用引物序列

2 結(jié)果分析

2.1 患病鰱臨床癥狀及剖檢病理變化

發(fā)病魚普遍表現(xiàn)為靜止不動(dòng)，漂浮于水庫淺水區(qū)水面，部分體表尾端潰爛，活力明顯下降，其上下頜、鰓蓋、鰭基部及魚體兩側(cè)充血，腹部膨大，尾端腫大，肛門紅腫。剖檢可見腹腔內(nèi)有淡黃色積水，腎臟出血甚至嚴(yán)重潰爛，脾腫大。

2.2 病原菌分離及革蘭氏染色

通過平板劃線法共分離到6株病原菌，其中肝臟中2株，脾臟中1株，腎臟中2株，尾端皮膚1株，分別編號(hào)為BD1-1—BD1-6。分離到的6株病原菌在LB平板上的菌體形態(tài)較為相似，均為表面光滑、邊緣整齊的圓形不透明淡黃色菌落。革蘭氏染色鏡檢觀察發(fā)現(xiàn)，菌株BD1-1—BD1-6菌落形態(tài)一致，為短桿狀細(xì)菌，均為革蘭氏陰性桿菌。

2.3 寄生蟲檢測(cè)和分子生物學(xué)鑒定結(jié)果

經(jīng)制片和顯微鏡觀察，所檢患病鰱組織均未觀察到寄生蟲。采用相關(guān)檢測(cè)方法對(duì)2021年3月初采集的患病鰱組織樣品進(jìn)行SVCV、KHV、CyHV-II分子生物學(xué)檢測(cè)。結(jié)果表明，患病鰱組織樣品均未擴(kuò)增出SVCV、KHV、CyHV-II特異性片段（未列出），為SVCV、KHV、CyHV-II陰性。

2.4 病原菌16S rRNA序列比對(duì)及系統(tǒng)發(fā)育樹分析

鰱分離菌株16S rRNA PCR電泳見圖1。由圖1可見，以分離菌基因組為模板，采用PCR方法擴(kuò)增16S rRNA序列，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳顯示在1 500 bp左右有1條目的條帶，與預(yù)期大小一致。從GenBank中選取最相似菌株的16S rRNA序列，與分離病原菌的測(cè)序結(jié)果進(jìn)行序列比對(duì)，結(jié)果表明，鰱分離菌株BD1-1—BD1-6的16S rRNA序列與腐敗希瓦氏菌序列相似度高達(dá)99%以上，其中，菌株BD1-5與腐敗希瓦氏菌序列相似度99.72%。同時(shí)，選擇其中測(cè)序序列最長的分離病原菌株BD1-5作為代表株進(jìn)行后續(xù)系統(tǒng)發(fā)育樹分析。

圖1鰱分離菌株16S rRNA PCR電泳

鰱分離菌株BD1-5 16S rRNA系統(tǒng)發(fā)育樹見圖2。由圖2可見，在繪制的鰱分離病原菌系統(tǒng)發(fā)育樹中，菌株BD1-5與腐敗希瓦氏菌（GenBank NO.:KY817253/KC607530/KY817252）同源性最高，親緣關(guān)系最近，自然聚為一枝，最終判定BD1-5菌株為腐敗希瓦氏菌。

圖2鰱分離菌株BD1-5 16S rRNA系統(tǒng)發(fā)育樹

3 討論

近年來，在我國部分淡水魚類養(yǎng)殖地區(qū)，養(yǎng)殖魚類在越冬后的初春季節(jié)，頻繁出現(xiàn)大規(guī)模暴發(fā)性死亡的現(xiàn)象，給水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)造成了較大的經(jīng)濟(jì)損失。越冬后初春時(shí)節(jié)患病魚種類比較多，如草魚（Ctenopharyngodon idella）、斑點(diǎn)叉尾（Ietaluruspunetaus）、黃顙魚（Pelteobagrus fulvidraco）、異育銀鯽（Carassius auratus gibelio）等攝食性魚類，鰱鳙（Aristichthys nobilis）等濾食性魚類。從患病魚體分離獲得致病菌主要包括：水性點(diǎn)狀氣單胞菌（Pseudomonas punctata）、溫和氣單胞菌、嗜水氣單胞菌、腐敗希瓦氏菌、柱狀黃桿菌（Flavobacterium cloumnare）、愛德華氏菌（Edwardsiella ictaluri）等。

該研究應(yīng)用流行病學(xué)調(diào)查、寄生蟲學(xué)觀察、細(xì)菌分離鑒定、分子生物學(xué)檢測(cè)等多種方法對(duì)天津地區(qū)一淡水養(yǎng)殖水庫養(yǎng)殖的鰱死亡病例進(jìn)行診斷及分析，發(fā)現(xiàn)該菌株表型特征與腐敗希瓦氏菌相一致，16S rRNA序列比對(duì)分析顯示該菌株與腐敗希瓦氏菌相似性較高（99.72%），從系統(tǒng)發(fā)育樹中也可見其與腐敗希瓦氏菌菌群發(fā)生聚類，由此說明兩者之間確實(shí)存在較近的親緣關(guān)系。至于從患病鰱分離獲得的此菌株是否為此次事件的致病源，以及其如何防治等問題仍有待進(jìn)一步研究和探討，但據(jù)現(xiàn)有結(jié)果可以推斷，此株腐敗希瓦氏菌是導(dǎo)致養(yǎng)殖鰱發(fā)病死亡的潛在致病源。

腐敗希瓦氏菌于1985年由MacDonell和Colwell根據(jù)5S rRNA序列進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析，其歸屬于希瓦氏菌（Shewanellaspp.）[8]，因被作為冷藏海水魚的主要腐敗菌而被人們所熟知[9-12]，相比之下，作為病原菌卻鮮為人知。研究表明，腐敗希瓦氏菌是一種人畜共患病病原菌，可引起人類軟組織感染、心膜炎等[13-14]。其作為淡水養(yǎng)殖動(dòng)物的病原菌，卻較少見到有關(guān)腐敗希瓦氏菌感染淡水養(yǎng)殖動(dòng)物的報(bào)告。在國外，Kozi?ska等[15]發(fā)現(xiàn)鯉（Cyprinus carpio）和鱒（Oncorhynchus mykiss）的感染病例；國內(nèi)在養(yǎng)殖河蟹（Eriocheir sinensis）[16]、異育銀鯽[17]、大鯢（Andrias davidianus）[18]、草魚[19]、泥鰍（Misgurnus anguillicaudatus）[20]、烏蘇里擬鲿（Pseudobagrus ussuriensis）[21]等水生動(dòng)物中發(fā)現(xiàn)過該菌感染所致的疫病。

4 建議

病害防控應(yīng)建立在對(duì)病原進(jìn)行分離和鑒定的基礎(chǔ)上，只有快速、準(zhǔn)確地判斷病原的種類，才能采取有效的防控措施。針對(duì)水生動(dòng)物細(xì)菌性疫病的治療，水產(chǎn)養(yǎng)殖人員一直依賴消毒劑和抗生素，但近年來抗生素在水產(chǎn)品領(lǐng)域產(chǎn)生了諸多負(fù)面影響。因此，養(yǎng)殖過程中，應(yīng)盡量避免使用抗生素，選用微生態(tài)制劑改善水質(zhì)，調(diào)節(jié)魚體腸道內(nèi)微生物的生態(tài)平衡，提高魚體免疫力。在對(duì)水庫等大水面養(yǎng)殖魚類進(jìn)行細(xì)菌性敗血癥防治的過程中[2，22-24]，可參考如下措施。（1）加強(qiáng)水質(zhì)管理。通過加注新水調(diào)節(jié)水位，確保春季水溫穩(wěn)定，避免水溫劇烈變化引起魚苗產(chǎn)生應(yīng)激反應(yīng)。（2）科學(xué)投喂優(yōu)質(zhì)飼料。春季水溫上升時(shí)，根據(jù)養(yǎng)殖魚的數(shù)量、規(guī)格和攝食能力，逐步增加投喂量，同時(shí)使用微生態(tài)制劑來提高魚體自身的免疫力，確保水質(zhì)穩(wěn)定。（3）規(guī)范轉(zhuǎn)塘和魚種投放操作。盡量避免捕撈和轉(zhuǎn)運(yùn)過程中對(duì)魚體造成機(jī)械損傷，放苗前使用食鹽或聚維酮碘等對(duì)魚苗進(jìn)行消毒，控制魚苗密度，加強(qiáng)管理，防止魚苗產(chǎn)生應(yīng)激反應(yīng)。（4）控制養(yǎng)殖密度，避免因密度過大引起缺氧。關(guān)注天氣變化，勤查水質(zhì)狀況，魚體活動(dòng)及攝食情況，防止疫病暴發(fā)。（5）加強(qiáng)病害防控。入春以后魚體易受真菌、細(xì)菌等感染，應(yīng)定期潑灑生石灰消毒，使用微生物制劑改良水質(zhì)。（6）強(qiáng)化無害化處理。對(duì)病死魚須及時(shí)使用生石灰做無害化處理，防止病原進(jìn)一步傳播；對(duì)養(yǎng)殖水庫和有關(guān)工具須做徹底消毒和暴曬，嚴(yán)禁隨意排放發(fā)魚病水庫的水體，杜絕病原擴(kuò)散。