三氯生對蚤狀溞急性毒性效應(yīng)影響

廉潔，吳宇翔，阮鳳嬌，徐國成，陸正和*，蔣琦辰

（1.江蘇海洋大學(xué)海洋科學(xué)與水產(chǎn)學(xué)院，江蘇 連云港222005；2.江蘇省淡水水產(chǎn)研究所，江蘇 南京210017）

三氯生（triclosan），又名三氯新，為羥二乙醚的三氯化衍生物，具有抗菌和消毒作用，廣泛作為個人護(hù)理品（牙膏、肥皂、洗液等）和醫(yī)用物品（醫(yī)用防腐劑、殺菌劑等）的添加劑。近年來，相關(guān)研究表明，三氯生具有環(huán)境內(nèi)分泌特性，對動物的生殖具有干擾作用，且在一定條件下可轉(zhuǎn)化為致癌和致畸物質(zhì)，其對人類和動物的健康危害已成為研究熱點(diǎn)[1]。

水域生態(tài)系統(tǒng)為三氯生的主要污染區(qū)域之一，有關(guān)三氯生對水生動物的毒性影響主要集中在原生動物、浮游動物和魚類等方面。蚤狀溞是作為生態(tài)毒理學(xué)常用的浮游動物，有關(guān)三氯生對蚤狀溞的毒性影響尚未見報(bào)道[2-4]?，F(xiàn)以水體中常見的蚤狀溞為受試動物，研究了三氯生對蚤狀溞的急性致死效應(yīng)及抗氧化酶等指標(biāo)影響，獲取蚤狀溞對三氯生敏感性指標(biāo)，為利用蚤狀溞評價三氯生的毒性作用提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動物

試驗(yàn)所用的蚤狀溞（Daphnia pulex）采自江蘇海洋大學(xué)校園池塘，獲得大量幼體后，進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)。培養(yǎng)使用EPA培養(yǎng)液[5]，餌料使用小球藻（Chlorellasp.），密度為1.0×109cells/L，培養(yǎng)過程中每天換水1次，培養(yǎng)密度為500 mL的培養(yǎng)液中放入30～40個1日齡幼溞，培養(yǎng)溫度為（20±1）℃，光暗比為12 h∶12 h，光強(qiáng)度為18μEm-2。取單個蚤狀溞（F0）進(jìn)行單克隆，將其所繁殖的第一批及第二批幼體挑出棄掉，當(dāng)?shù)谌左w出生時，棄掉母體（F0），以第三批的蚤狀溞為試驗(yàn)?zāi)阁w（F1），將F1所繁殖的第一批和第二批幼體都棄掉，從第三批開始，按試驗(yàn)要求，在光照培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。

1.2 試驗(yàn)試劑

試驗(yàn)藥物三氯生（純度99.90%）購于日本巴斯夫公司，用丙酮作為助溶劑，配成20.0 mg/L的母液，后稀釋為試驗(yàn)測試液。超氧化歧化酶（SOD）活力、過氧化氫酶（CAT）活力、谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶（GST）活力和丙二醛（MDA）含量測定試劑盒、牛血清蛋白等試劑購于南京建成生物工程研究所。

1.3 急性毒性試驗(yàn)

在預(yù)試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，獲得三氯生對蚤狀溞致死最低和最高質(zhì)量濃度，設(shè)置三氯生質(zhì)量濃度為100，200，400，800和1 200μg/L 5個試驗(yàn)組，同時設(shè)置空白對照組。分別向盛有40 mL測試液的50 mL燒杯內(nèi)加入不小于1日齡的幼溞10只，溫度為（20±1）℃，以上過程于黑暗條件下進(jìn)行。測試期間不喂餌料、不換水，48 h后在解剖鏡下觀察幼溞存活情況，以幼溞的心跳停止作為死亡標(biāo)準(zhǔn)。各測試液設(shè)4個平行組，統(tǒng)計(jì)各測試組中溞的死亡數(shù)量，通過幾率單位法計(jì)算48 h的三氯生對蚤狀溞的半致死質(zhì)量濃度（LC50）。

1.4 急性毒性試驗(yàn)與酶活和MDA含量測定

在獲取48 h半致死質(zhì)量濃度LC50的基礎(chǔ)上，設(shè)置三氯生質(zhì)量濃度為5，10，20，40、80和160μg/L的6個試驗(yàn)組并設(shè)置空白對照組，選取同一批次且大小一致的1日齡幼溞40只，分別放入盛有上述60 mL測試液的80 mL燒杯中，試驗(yàn)過程中不投餌，溶解氧質(zhì)量濃度為5.0 mg/L，以上各質(zhì)量濃度設(shè)4個平行組。

在三氯生處理24和48 h后，于冰上取樣，吸干水分，加入生理鹽水勻漿，4℃冷凍離心10 min后，取上清液測定SOD、CAT、GST活力和MDA含量，測定的方法參照試劑盒說明書，總蛋白含量測定采用考馬斯藍(lán)方法，以牛血清白蛋白作為標(biāo)準(zhǔn)品[6]。

1.5 數(shù)據(jù)分析

試驗(yàn)結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（Mean±SD）表示，運(yùn)用Sigmaplot 11.0軟件進(jìn)行分析和作圖。采用單因素方差分析（One-WayANOVA）和Dunnett法對處理組與對照組進(jìn)行差異顯著性分析。

2 結(jié)果

2.1 三氯生對蚤狀溞的48 h急性毒性結(jié)果

結(jié)果顯示，隨著三氯生質(zhì)量濃度的增加，蚤狀溞的死亡率呈上升趨勢。在質(zhì)量濃度為100，200，400，800和1 200μg/L時，蚤狀溞的死亡率分別為7.5%，20.0%，55.0%，92.5%和100.0%，蚤狀溞的死亡率與三氯生質(zhì)量濃度有明顯的質(zhì)量濃度效應(yīng)關(guān)系。通過對數(shù)據(jù)進(jìn)行Sigmoid 3 parameter擬合得方程y=97.5/[1+e（370.3-x）/115.22]，其中y為死亡率，%，x為三氯生質(zhì)量濃度，μg/L，得出三氯生對蚤狀溞48 h的半致死質(zhì)量濃度為370.3μg/L，95%的置信區(qū)間為354.2～386.3μg/L（圖1）。

圖1三氯生對蚤狀溞48 h急性毒性

2.2 三氯生對蚤狀溞SOD、CAT、GST活性及MDA含量的影響

三氯生對蚤狀溞SOD、CAT、GST活性及MDA含量的影響，見圖2（a）（b）（c）（d）。SOD活性測定結(jié)果顯示，三氯生對蚤狀溞體內(nèi)SOD活性具有顯著影響（P＜0.05），蚤狀溞暴露三氯生24 h后，隨著質(zhì)量濃度增加，SOD活性呈先增加后降低的趨勢。與對照組相比，三氯生質(zhì)量濃度為10，20和40μg/L時，SOD活性顯著上升（P＜0.05），質(zhì)量濃度為5和80μg/L時，SOD活性與對照組無顯著差異（P＞0.05），質(zhì)量濃度為160μg/L時，則出現(xiàn)顯著下降（P＜0.05）；暴露48 h后，SOD活性變化趨勢與暴露24 h后的情況類似，但與對照組相比，三氯生質(zhì)量濃度為5和10μg/L時SOD活性顯著上升（P＜0.05），質(zhì)量濃度為20μg/L時SOD活性無顯著差異（P＞0.05），質(zhì)量濃度為40，80和160μg/L時則出現(xiàn)顯著下降（P＜0.05）。

CAT活性測定結(jié)果顯示，三氯生對蚤狀溞CAT活性也具有顯著影響（P<0.05）。蚤狀溞暴露在三氯生24 h后，質(zhì)量濃度為10，20和40μg/L時，CAT活性與對照組相比顯著上升（P<0.05），但質(zhì)量濃度為80和160μg/L時，CAT活性顯著下降（P<0.05），質(zhì)量濃度為5μg/L時，CAT活性與對照組相比無顯著差異（P>0.05）；暴露48 h后，整體上，CAT活性較24 h變化較大。與對照組相比，三氯生質(zhì)量濃度為5μg/L時，CAT活性無顯著差異（P＞0.05），其他質(zhì)量濃度下CAT活性的變化趨勢則與暴露24 h時相似。

圖2三氯生濃度對蚤狀溞SOD、CAT、GST活性和MDA含量的影響

GST活性測定結(jié)果顯示，三氯生對蚤狀溞GST活性具有顯著影響（P<0.05）。蚤狀溞暴露于三氯生24 h后，質(zhì)量濃度為5μg/L時，GST活性表現(xiàn)為顯著上升，質(zhì)量濃度為10和20μg/L時GST活性雖有下降，但與對照組無顯著差異（P＞0.05），質(zhì)量濃度在40，80和160μg/L時GST活性顯著下降（P<0.05）；暴露48 h后，除質(zhì)量濃度為5μg/L時，GST活性與對照組相比顯著上升外（P<0.05），其他質(zhì)量濃度組均與對照組相比出現(xiàn)顯著下降（P<0.05）。

MDA含量測定結(jié)果顯示，暴露于三氯生24 h后，MDA含量隨三氯生質(zhì)量濃度的升高呈上升趨勢，其中40，80和160μg/L的試驗(yàn)組MDA含量較空白組出現(xiàn)了顯著上升（P<0.05）；暴露于三氯生48 h后，MDA含量的變化趨勢同暴露24 h時相似，其中20，40，80和160μg/L試驗(yàn)組MDA含量較空白組出現(xiàn)了顯著上升（P<0.05）。

3 討論

3.1 三氯生對蚤狀溞的急性毒性影響

三氯生的使用對人類健康造成潛在風(fēng)險(xiǎn)，這一直是人們關(guān)注的問題，探討三氯生對水生生物的毒性影響可為三氯生的風(fēng)險(xiǎn)評估提供依據(jù)，而急性毒性研究是評價有毒物質(zhì)風(fēng)險(xiǎn)的基礎(chǔ)。已有研究表明三氯生對泥鰍24和48 h的急性毒性LC50值分別為6.60和6.16 mg/L[7]；對東北林蛙48 h的急性毒性LC50值為1.102 mg/L[8]；對大型溞48 h的急性毒性LC50值為390μg/L；對草履蟲48 h的急性毒性LC50值為476μg/L[3]。研究顯示，三氯生對蚤狀溞48 h的急性毒性LC50值為370.3μg/L，結(jié)果表明利用蚤狀溞評價三氯生的急性敏感性較以上動物具有明顯優(yōu)勢。

3.2 三氯生對蚤狀溞主要抗氧化指標(biāo)的影響

SOD可清除生物細(xì)胞內(nèi)活性氧自由基（Reative Oxygen Species,ROS），在維持細(xì)胞ROS的質(zhì)量濃度平衡中具有重要作用，SOD酶可使機(jī)體細(xì)胞免受氧化損傷，是機(jī)體細(xì)胞中抗氧化的關(guān)鍵酶。但當(dāng)外界有毒物質(zhì)質(zhì)量濃度過高，導(dǎo)致生物體內(nèi)ROS上升而又超出SOD酶清除能力時，細(xì)胞會受到損傷。因此SOD酶活性改變能及時反映外界有毒物質(zhì)對溞氧化脅迫的程度[9]。研究中，隨三氯生質(zhì)量濃度的升高，蚤狀溞體內(nèi)的SOD活性在低質(zhì)量濃度試驗(yàn)組表現(xiàn)出上升，在高質(zhì)量濃度組則出現(xiàn)下降，暴露24 h后，三氯生質(zhì)量濃度為5μg/L時，SOD活性無顯著差異，這可能是由于短時間內(nèi)低毒產(chǎn)生的毒性較少，機(jī)體能及時清除ROS，細(xì)胞可維持SOD活性的正常，但隨著質(zhì)量濃度升高或時間延長，三氯生對蚤狀溞毒性加大，整體表現(xiàn)出低促進(jìn)高抑制的現(xiàn)象。張楠等[9]研究重金屬鋅對大型溞24 h毒性作用和王茜等[10]研究工業(yè)廢水對多刺裸腹溞毒性時，SOD和CAT活性變化趨勢均較為相似。在該研究中，三氯生對蚤狀溞體內(nèi)CAT活性變化趨勢的影響與SOD也較為相似。另外，研究顯示，暴露48 h后，三氯生低質(zhì)量濃度試驗(yàn)組（5μg/L），SOD活性較空白組顯著升高，但CAT活性升高不顯著。

GST是生物體內(nèi)重要的解毒酶，催化谷胱甘肽（GSH）巰基與一些親電物質(zhì)如脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物及外源性有毒物質(zhì)結(jié)合，以保護(hù)DNA，同時避免蛋白質(zhì)受損。當(dāng)生物受到輕度毒物污染時，體內(nèi)的GST會誘導(dǎo)上升，對抗脅迫反應(yīng)，但污染增加時其誘導(dǎo)作用將被破壞，因此GST常作為環(huán)境污染的標(biāo)記物[11]。研究中，暴露24 h時，除三氯生質(zhì)量濃度為5.0μg/L時可顯著誘導(dǎo)蚤狀溞GST活性上升，其他試驗(yàn)組GST活性則出現(xiàn)下降，且在40，80和160μg/L試驗(yàn)組出現(xiàn)顯著下降；暴露48 h時，各試驗(yàn)組GST活性均顯著下降，這可能是暴露時間延長或有毒物質(zhì)量濃度增加，導(dǎo)致過量毒物進(jìn)入機(jī)體，GST與毒性物質(zhì)大量結(jié)合，引起解毒功能下降，在研究鎘類對蚤狀溞影響時[12]，GST活性也出現(xiàn)類似結(jié)果，因此GST作為污染物的標(biāo)記物具有可行性。

MDA為脂質(zhì)過氧化的最終產(chǎn)物，其含量反映脂質(zhì)過氧化水平，顯示細(xì)胞受損傷程度。研究中，暴露24 h時，MDA含量在三氯生質(zhì)量濃度為40μg/L時開始出現(xiàn)顯著上升；暴露48 h時，當(dāng)三氯生質(zhì)量濃度為20μg/L時，MDA含量即出現(xiàn)上升，這表明三氯生對蚤狀溞MDA含量與其質(zhì)量濃度和暴露時間有關(guān)，這一結(jié)果與納米二氧化鈦和銅對大型溞MDA含量的影響相似[13]。

綜上，該研究表明三氯生對蚤狀溞具有一定的毒性，蚤狀溞可通過體內(nèi)的生化指標(biāo)對抗脅迫反應(yīng)，如抗氧化系統(tǒng)中SOD、GST和CAT的活性及MDA含量變化，且GST對三氯生敏感度較其他指標(biāo)高。利用蚤狀溞評價三氯生毒性效應(yīng)具有一定優(yōu)勢，其中抗氧化指標(biāo)具有快速、敏感性強(qiáng)等特點(diǎn)，該結(jié)論對評價三氯生的毒性效應(yīng)具有一定參考價值。