ALK免疫組化切片重復利用進行FISH檢測的可行性

楊清麟，劉子臣，劉 輝，吳林果，胡艷萍

目前肺癌是全球發(fā)病率和病死率增長較快的惡性腫瘤之一，其中非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer, NSCLC)占80%以上，約5%的NSCLC出現(xiàn)間變性淋巴瘤激酶(anaplastic lymphoma kinase, ALK)重排[1]。近年來克唑替尼等ALK基因靶向藥物臨床發(fā)展迅速，對晚期NSCLC患者療效顯著。晚期肺癌患者通常無法進行手術，臨床活檢組織標本、細胞學標本的珍貴性不言而喻。免疫組化是病理科常用的檢測方法，經(jīng)濟實用，方便快捷，適合ALK基因重排檢測的初篩；熒光原位雜交(fluorescence in situ hybridization, FISH)檢測作為國際公認標準，對ALK基因重排的確診具有重要意義。本實驗通過對肺癌切片經(jīng)免疫組化染色后再行FISH檢測，與直接對切片進行FISH檢測的結果進行比較，探索針對ALK基因重排指標免疫組化染色后切片重復利用進行FISH檢測的可行性。

1 材料與方法

1.1 材料選取肺癌患者的氣管鏡活檢標本、細胞學標本各20例，每例標本切片分為對照組和實驗組。對照組直接對切片行FISH檢測，實驗組先行免疫組化染色，再對同一張切片進行FISH檢測。

1.2 方法(1)免疫組化染色：ALK抗體購自北京中杉金橋公司，顯色系統(tǒng)為PV-6000D，采用EnVision兩步法染色，切片經(jīng)二甲苯脫蠟、梯度乙醇脫水，EDTA(pH 9.0)中高溫高壓修復2.5 min，過氧化氫溶液中處理10 min，一抗37 ℃孵育1 h，二抗37 ℃孵育20 min，DAB顯色5 min，蘇木精復染后，梯度乙醇脫水，二甲苯透明封片。(2)FISH檢測：ALK探針為雅培公司生產(chǎn)，前處理試劑均購自金箓生物公司，切片經(jīng)二甲苯脫蠟，無水乙醇漂洗后晾干，預處理液80 ℃ 12 min，胃酶37 ℃消化25 min，梯度乙醇脫水后晾干，滴加探針75 ℃變性5 min，37 ℃雜交過夜，含0.3%NP-40的2×SSC洗液常溫浸泡5 min后移除去蓋玻片，72 ℃洗液2 min洗去未結合的探針，暗處風干后，滴加DAPI復染細胞核并封片，30 min后用熒光顯微鏡讀片。(3)同一切片免疫組化染色后FISH檢測：切片先行免疫組化染色，同步驟(1)，1周后將已封片的免疫組化切片放入二甲苯中浸泡1～2天，等待蓋玻片自然脫落，無水乙醇漂洗后，省去預處理步驟，直接37 ℃胃酶消化25 min后同步驟(2)。

1.3 統(tǒng)計學分析采用SPSS 22.0軟件進行統(tǒng)計學分析，實驗組與對照組FISH檢測結果使用Kappa一致性檢驗分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

細胞學標本：對照組檢出FISH陽性5例(25%)，F(xiàn)ISH陰性15例(75%)；實驗組檢出FISH陽性3例(15%)，F(xiàn)ISH陰性17例(85%)(圖1)?；顧z標本：對照組檢出FISH陽性7例(35%)，F(xiàn)ISH陰性13例(65%)；實驗組檢出FISH陽性6例(30%)，F(xiàn)ISH陰性14例(70%)(表1，圖2)。細胞學標本實驗組與對照組FISH結果一致性較好(Kappa系數(shù)=0.692，P<0.05)，活檢標本實驗組與對照組FISH結果一致性很好(Kappa系數(shù)=0.886，P<0.05)。從實驗結果圖來看，將進行過免疫組化染色的切片再重復利用行FISH檢測的切片與直接用白片行FISH檢測的結果一致。

表1 對照組與實驗組ALK FISH檢測結果對比

圖1 細胞學標本：A.實驗組ALK免疫組化陰性結果，EnVision兩步法；B.實驗組免疫組化染色后再行FISH檢測的陰性結果；C.對照組直接行FISH檢測的陰性結果 圖2 活檢標本：A.實驗組ALK免疫組化陽性結果，EnVision兩步法；B.實驗組免疫組化染色后再行FISH檢測的陽性結果；C.對照組直接行FISH檢測的陽性結果

3 討論

研究表明，ALK重排陽性多見于較年輕、吸煙較少甚至不吸煙的肺腺癌患者。棘皮動物微管相關蛋白-間變淋巴瘤激酶(echinoderm microtubule associated protein like 4-anaplastic lymphoma kinase, EML4-ALK)是ALK基因重排最常見的融合形式[2]。ALK基因靶向藥物的上市，顯著延長了ALK基因突變的晚期NSCLC患者生存期，這也使ALK基因重排的檢出具有重大意義。晚期肺癌患者在臨床使用ALK抑制劑之前，大多需行FISH檢測確定ALK基因是否重排。少量的肺癌活檢標本通常在前期行HE、免疫組化染色后已所剩無幾，導致無法進行FISH檢測確診，從而影響患者的靶向治療。

免疫組化檢測ALK表達使用抗體與蛋白質結合，著色部位定位于細胞質。FISH技術是熒光標記的特異性核苷酸片段與切片中的基因組DNA雜交[3]，利用堿基互補配對原則，探針在細胞核內與靶基因結合。理論上兩種檢測方法應該互不影響，由于免疫組化檢測中已經(jīng)進行過高溫高壓修復，因此在FISH檢測中省去預處理步驟，直接從胃酶消化過程開始進行[4]。

從FISH檢測結果圖片來看，實驗組的細胞數(shù)量稍低于對照組的細胞數(shù)量，可能是由于過多的實驗流程導致少部分細胞在處理過程中丟失，這也是此項方法在實際應用中的局限所在。

綜上所述，通過對免疫組化染色后切片重復使用，發(fā)現(xiàn)其FISH結果可信度較高，能為臨床治療提供可靠依據(jù)，為難以獲取標本的晚期NSCLC患者能否進行ALK靶向治療提供有力的支持，從而提高患者的生存期，也為其他樣本稀缺的晚期癌癥患者后續(xù)進行臨床分子檢測提供了一種新的方法和思路。