城市河道沉積物溶解性有機(jī)質(zhì)特征及其對(duì)反硝化過程的影響研究

翁蕊 韋政 楊燕梅 韓靜 何巖 黃民生

摘要： 為了解決城市河道治理過程中氮營養(yǎng)鹽去除難題， 城市河道體系中溶解性有機(jī)質(zhì) （DOM） 對(duì)反硝化過程的影響作用值得重視. 研究表明， 河道沉積物中DOM的腐殖化程度較低、芳香性弱， 以小分子的富里酸為主， 其濃度平均為 （1 868.5 ± 63.2） mg/kg. 與空白組相比， DOM可以促進(jìn)反硝化過程， 對(duì)TN和NO3–-N去除率分別提升了7.24% ± 0.36%和23.52% ± 1.17%， 而DOM協(xié)同乙酸鹽組對(duì)TN和NO3–-N的去除效果更好， 分別可以達(dá)到74.48% ± 1.29%和98.62% ± 0.07%. 微生物分析表明， DOM組的菌群多樣性和豐富度均高于空白組， 但其中的異養(yǎng)反硝化菌屬Pseudomonas和Brevundimonas以及nirK型反硝化菌屬Paracoccus的豐度均低于DOM協(xié)同乙酸鹽組. 此外， DOM運(yùn)行體系中NH4+-N濃度維持較高的水平 （大于3.7 mg/L）， 而且含有DOM體系中與異化硝酸鹽還原成銨 （DNRA） 功能相關(guān)的厭氧粘細(xì)菌（Anaeromyxobacter）， 其相對(duì)豐度明顯增加， 推測(cè)DOM在促進(jìn)反硝化的同時(shí)誘導(dǎo)了DNRA過程的發(fā)生.

關(guān)鍵詞： 城市河道； 溶解性有機(jī)質(zhì)； 反硝化； 富里酸； 異化硝酸鹽還原成銨

中圖分類號(hào)： X522 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A DOI：10.3969/j.issn.1000-5641.2021.04.006

Characteristics of dissolved organic matter and its effects on denitrification in urban river sediments

WENG Rui1，2，3，4， WEI Zheng1，2，3，4， YANG Yanmei1，2，3，4， HAN Jing1，2，3，4， HE Yan1，2，3，4， HUANG Minsheng1，2，3，4

（1. Shanghai Key Laboratory for Urban Ecological Processes and Eco-Restoration， School of Ecological and Environmental Sciences， East China Normal University， Shanghai 200241， China； 2. Institute of EcoChongming， Shanghai 202162， China； 3. Shanghai Engineering Research Center of Biotransformation of Organic Solid Waste， Shanghai 200241， China； 4. Technology Innovation Center for Land Spatial EcoRestoration in Metropolitan Area （Ministry of Natural Resources）， Shanghai 200062， China）

Abstract： Understanding the impact of dissolved organic matter （DOM） on the denitrification process is critical to addressing the challenges associated with nitrogen removal in urban river treatment. In this paper， we show that DOM in urban rivers are mainly comprised of small-molecule fulvic acids. The humic acid content and aromaticity of the DOM， moreover， were found to be low. Compared with the control case， DOM can promote the denitrification process； specifically， the removal efficiency of TN and NO3–-N in the DOM-added group increased by 7.24% ± 0.36% and 23.52% ± 1.17%， respectively. DOM with an acetate group had an even better effect on the removal of TN and NO3–-N， reaching 74.48% ± 1.29% and 98.62% ± 0.07%， respectively. Microbiological analysis showed that the DOM-added group can significantly increase the diversity and richness of the bacteria community compared with the control case. However， the relative abundance of the heterotrophic denitrifiers Pseudomonas and Brevundimonas as well as the nirKtype denitrifier Paracoccus in the DOM-added group was less than that of the DOM with an acetate group. Additionally， a relatively high concentration of NH4+-N （> 3.7 mg/L） was observed in the DOM-added group. The addition of DOM can significantly increase the relative abundance of Anaeromyxobacter related to dissimilatory nitrate reduction to ammonium （DNRA） functional genes. It is speculated that DOM promotes the denitrification process and induces the DNRA process simultaneously.

Keywords： urban river； dissolved organic matter； denitrification； fulvic acid； dissimilatory nitrate reduction to ammonium

0 引 言

近年來， 隨著城市黑臭河道整治工作的相繼開展， 水質(zhì)的黑臭現(xiàn)象逐步得到緩解， 水質(zhì)也得到了極大改善， 但治理過程中氮營養(yǎng)鹽難以去除的問題逐漸凸顯[1]. 反硝化被認(rèn)為是氮的生物地球化學(xué)循環(huán)中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)， 也是削減河道沉積物內(nèi)源氮負(fù)荷的重要途徑. 溶解性有機(jī)質(zhì) （DOM） 作為沉積物中活躍的組成部分[2]， 在氮素遷移轉(zhuǎn)化過程中的作用日益受到重視.

然而， 當(dāng)前的研究主要集中在污水處理系統(tǒng)[3]及地下水系統(tǒng)[4]中DOM對(duì)反硝化過程的影響， 對(duì)于城市河道中DOM對(duì)反硝化的影響尚未有定論. 本文探究了城市河道沉積物DOM的賦存特征及其對(duì)城市河道反硝化過程的影響作用， 同時(shí)解析了相關(guān)的微生物作用機(jī)制， 為強(qiáng)化城市河道氮素削減提供有益補(bǔ)充.

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象

本實(shí)驗(yàn)選取上海市普陀區(qū)桃浦鎮(zhèn)里店浦作為研究對(duì)象， 該河是工業(yè)河的一條支流， 經(jīng)整治后黑臭現(xiàn)象消除， 目前出現(xiàn)季節(jié)性水華. 實(shí)驗(yàn)所采用的上覆水和沉積物均取自該河道， 上覆水pH值為7.39 ± 0.12， 氨氮 （NH4+-N）、硝氮 （NO3–-N） 及總氮 （TN） 的濃度分別為2.03 ～ 3.38 mg/L、2.25 ～ 2.62 mg/L和5.79 ～ 6.58 mg/L， 沉積物中DOM濃度為 （1 868.5 ± 63.2） mg/kg.

1.2 實(shí)驗(yàn)?zāi)M體系

采用逐步提高進(jìn)水NO3–-N濃度 （14 mg/L—28 mg/L—42 mg/L） 的方式對(duì)河道沉積物進(jìn)行定向富集培養(yǎng). 然后通過預(yù)實(shí)驗(yàn)確定相對(duì)優(yōu)化的DOM濃度， 發(fā)現(xiàn)DOM濃度為72 mg/L時(shí)與反硝化成明顯的正相關(guān)， 因此本實(shí)驗(yàn)選取該濃度進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn). 實(shí)驗(yàn)所添加的DOM是根據(jù)文獻(xiàn)[5]所述方法并加以修改后制備： 先將河道沉積物經(jīng)冷凍干燥 （LABCONCO 6L， 美國） （冷凝箱–55℃， 干燥箱–40℃） 后制得樣品， 再研磨過100目篩， 接著按V水∶m土為5∶1的比例稱取定量樣品于250 mL錐形瓶中， 在轉(zhuǎn)速200 r/min、溫度 （30 ± 1）℃下振蕩16 h， 并在4℃、轉(zhuǎn)速12 000 r/min下離心15 min，隨后將上清液通過0.45 μm玻璃纖維濾膜， 所得濾液即為DOM.

本實(shí)驗(yàn)?zāi)M體系包括空白組、DOM組和DOM協(xié)同乙酸鹽組. 培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)使用250 mL血清瓶， 按體積比1∶5加入富集培養(yǎng)好的40 mL沉積物與200 mL反硝化液體培養(yǎng)基， 混合均勻后用氮?dú)庀蜓迤宽敳抗拇?0 min排除空氣， 迅速加蓋密封.

1.3 分析方法

本研究所涉及的常規(guī)理化指標(biāo)除pH值直接使用儀器測(cè)定外， 總氮 （TN）、氨氮 （NH4+-N）、硝氮（NO3–-N） 及亞硝氮 （NO2–-N） 等均參照標(biāo)準(zhǔn)[6]進(jìn)行測(cè)定. 1.3.1 紫外-可見光譜分析

紫外-可見光譜采用紫外-可見吸收分光光度儀 （UNICO UV4802S， 上海） 測(cè)定， 掃描波長(zhǎng)（lWL）為200 ～ 700 nm， 石英比色皿光程10 mm， 以Milli-Q超純水為空白.

1.3.2 三維熒光光譜分析

三維熒光光譜采用熒光分光光度計(jì) （HITACHI F-4500， 日本） 測(cè)定， 儀器參數(shù)： 激發(fā)光源采用150 W氙弧燈； PMT電壓為700 V； 激發(fā)和發(fā)射狹縫寬度均為5 nm； 激發(fā)波長(zhǎng) （lEx） 為250 ～ 600 nm， 發(fā)射波長(zhǎng) （lEm） 為200 ～ 550 nm， 掃描間隔均是10 nm； 掃描速度為12 000 nm/min； 響應(yīng)時(shí)間自動(dòng)； 空白為Milli-Q （Millipore， 18.2 MW·cm） 超純水； 掃描光譜進(jìn)行儀器自動(dòng)校正.

1.4 高通量測(cè)序分析

本研究采用Illumina Hiseq 2500平臺(tái)進(jìn)行高通量測(cè)序， 以解析城市河道沉積物DOM對(duì)反硝化過程的微生物作用機(jī)制. 整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程是委托上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司， 實(shí)驗(yàn)所用引物及序列如表1所示.

2 結(jié)果與討論

2.1 城市河道沉積物DOM的賦存特征

從圖1（a）三維熒光圖譜中可以看出， DOM中出現(xiàn)了三類特征熒光峰， 分別是A峰 （405.4）、C峰 （2 210）和D峰 （2 480）. 其中， A、C峰主要用來反映外源輸入的腐殖酸和富里酸， 其形成與腐殖質(zhì)結(jié)構(gòu)中的羥基和羧基有關(guān)[10-11]； D峰是類蛋白質(zhì)熒光峰， 用來反映與生物降解性相關(guān)的色氨酸、酪氨酸所形成的熒光峰[12]. 圖1（a）中A峰和C峰強(qiáng)度之和明顯大于D峰， 說明城市河道DOM中主要包括腐殖酸和富里酸.

另外， 根據(jù)城市河道沉積物DOM的紫外-可見光譜（見圖1（b））可知， 隨著掃描波長(zhǎng)（lWL）的增加， 吸光度呈現(xiàn)出先增加后降低的趨勢(shì)， 河道沉積物DOM在220 nm附近出現(xiàn)明顯的吸收峰， 吸光度（A）為3.08 cm–1. 有研究發(fā)現(xiàn)， 220 nm附近出現(xiàn)吸收峰的主要原因是DOM中含有苯環(huán)的p-p鍵躍遷，且峰強(qiáng)度與苯環(huán)等芳香結(jié)構(gòu)含量有關(guān)[13]. 因此， 推測(cè)河道沉積物DOM中含有芳香族化合物. 此外， E3/E4 （A300/A400） 是300 nm和400 nm波長(zhǎng)處的紫外吸光度之比， 常用來表示DOM的腐殖化程度、芳香性以及分子量分布等特征[14]. 周石磊等[15]研究表明， 當(dāng)E3/E4 < 3.5時(shí)， 以腐殖酸為主； 當(dāng)E3/E4 > 3.5時(shí)， 以富里酸為主. E3/E4值越大， 則DOM的腐殖化程度越低、芳香性越弱， 分子量也越小， 富里酸含量就越高[16]. 本研究中河道沉積物DOM的E3/E4值為6.54， 說明沉積物DOM的腐殖化程度較低， 芳香性弱， 以小分子的富里酸為主. 綜合三維熒光圖譜和紫外-可見光譜來看， 城市河道DOM中主要以小分子的富里酸為主.

2.2 DOM對(duì)反硝化過程的影響

模擬體系中TN、NO3–-N、NO2–-N及NH4+-N的動(dòng)態(tài)變化如圖2所示. 總的來講， 所有實(shí)驗(yàn)組的NO3–-N濃度均呈現(xiàn)下降趨勢(shì)， 并在18 d后趨于穩(wěn)定， 穩(wěn)定時(shí)濃度分別為 （17.31 ± 0.87） mg/L （空白組）、（7.40 ± 30.37） mg/L （DOM組） 及 （0.58 ± 0.03） mg/L （DOM協(xié)同乙酸鹽組）. 與空白組相比， DOM組對(duì)TN和NO3–-N的去除率分別提升了7.24% ± 0.36%和23.52% ± 1.17%， DOM協(xié)同乙酸鹽組對(duì)TN和NO3–-N的去除效果更好， 分別可以達(dá)到39.83% ± 2.00%和46.03% ± 2.28%. 這些結(jié)果表明， DOM在一定程度上能夠提高反硝化效果， 并且在乙酸鹽的協(xié)同作用下體系的反硝化效果更強(qiáng). 推測(cè)認(rèn)為， 部分DOM可以直接作為反硝化過程的碳源， 加快了微生物對(duì)NO3–-N的利用， 進(jìn)而促進(jìn)了反硝化過程的發(fā)生； 乙酸鹽的加入一方面可以直接作為反硝化過程的碳源， 另一方面也可以通過共代謝過程促進(jìn)反硝化菌對(duì)DOM的利用， 從而促進(jìn)反硝化過程. Bleyen等[17]也發(fā)現(xiàn)乙酸鹽的存在不僅能顯著提高微生物的還原活性， 還能作為輔助底物被微生物利用促進(jìn)DOM降解.

另外， 所有實(shí)驗(yàn)組均出現(xiàn)了NO2–-N濃度先積累后降低的現(xiàn)象， 其中空白組NO2–-N積累量最多（（39.35 ± 1.97） mg/L）， 可能是由于空白組可利用碳源的不足發(fā)生了不完全反硝化導(dǎo)致NO2–-N的積累； 其次是DOM組 （（34.95 ± 1.75） mg/L） 和DOM協(xié)同乙酸鹽組 （（21.04 ± 1.05） mg/L）， 表明DOM中存在難以被微生物利用的碳源， 部分可利用碳源促進(jìn)了反硝化過程. 乙酸鹽的加入不僅可以直接作為可利用的碳源參與反硝化過程， 而且可作為激發(fā)物質(zhì)[18]刺激NO3–-N還原微生物對(duì)DOM中難降解組分的利用， 從而使NO2–-N快速被消耗. 值得一提的是， DOM體系中出現(xiàn)明顯的NH4+-N濃度先快速增加而后降低并逐漸穩(wěn)定的現(xiàn)象， 而且運(yùn)行穩(wěn)定后NH4+-N濃度維持在較高水平 （大于3.7 mg/L）， 推測(cè)認(rèn)為， DOM會(huì)促進(jìn)DNRA過程的發(fā)生， 從而導(dǎo)致了體系中NH4+-N濃度較高.

2.3 DOM對(duì)反硝化影響的微生物作用機(jī)制

2.3.1 細(xì)菌菌群結(jié)構(gòu)特征

通過高通量測(cè)序分析發(fā)現(xiàn)， 變形菌門 （Proteobacteria）、擬桿菌門 （Bacteroidetes） 和綠彎菌門（Chloroflexi） 為各組的優(yōu)勢(shì)菌群， 其相對(duì)豐度分別為60.56% ～ 65.98%、11.04% ～ 18.46% 和1.09% ～10.57% （見圖3）. 擬桿菌門是典型的反硝化菌門， 在硝酸鹽的去除和木質(zhì)素的降解中起著重要作用[19].與空白組相比， 含DOM體系的擬桿菌門的相對(duì)豐度明顯增加， 由11.04%上升至13.19% ～ 18.46%，說明加入DOM有利于促進(jìn)該類微生物的生長(zhǎng)， 從而促進(jìn)了反硝化作用. 綠彎菌門在DOM組的相對(duì)豐度較空白組有所增加， 從5.32%提升至9.44%. 該類微生物在氮循環(huán)中發(fā)揮著重要作用[20]， 而且還與溶解性碳水化合物的降解相關(guān)[21]. 但其在乙酸鹽組的相對(duì)豐度僅有1.09%， 說明體系中加入乙酸鹽可能對(duì)氮循環(huán)過程及溶解性碳水化合物的降解產(chǎn)生不利影響. 此外， 其他兩組浮霉菌門 （Planctomycetes）的相對(duì)豐度均低于空白組， 該菌門主要參與厭氧氨氧化過程[22]， 推測(cè)DOM及乙酸鹽協(xié)同DOM作用下會(huì)對(duì)該細(xì)菌的生長(zhǎng)產(chǎn)生一定影響， 因而抑制了厭氧氨氧化作用.

不同組細(xì)菌在屬水平下的相對(duì)豐度如圖3（b）所示， 可以看出各組優(yōu)勢(shì)菌群的相對(duì)豐度存在差異.各組主要的優(yōu)勢(shì)反硝化菌屬包括硫桿菌屬 （Thiobacillus）、假單胞菌屬 （Pseudomonas）、陶厄氏菌屬（Thauera）、熱單胞菌屬 （Thermomonas） 和短波單胞菌屬 （Brevundimonas）. 其中， 硫桿菌屬和熱單胞菌屬為硫自養(yǎng)反硝化菌 （見表2）， 它們?cè)贒OM組的豐度高于其他組， 說明該體系中硫自養(yǎng)反硝化的活性較高， 推測(cè)DOM可以促進(jìn)該種微生物的生長(zhǎng)， 從而促進(jìn)了反硝化作用. 與空白組相比， 含有DOM體系的假單胞菌屬和短波單胞菌屬的相對(duì)豐度明顯增加， 推測(cè)投加DOM有利于該類微生物的生長(zhǎng). 有研究表明， 假單胞菌屬可以利用DOM中較易氧化的官能團(tuán)作為電子供體來促進(jìn)自身的生長(zhǎng)[17].而陶厄氏菌屬在含DOM體系的相對(duì)豐度均低于空白組， 可能是陶厄氏菌屬對(duì)有機(jī)物的競(jìng)爭(zhēng)能力低于其他反硝化菌屬.

另外， DOM組的ACE和Chao1指數(shù)最大， 分別為120 177.1和54 330.08， 其次是空白組 （分別為118 352.9和45 799.84） 和DOM協(xié)同乙酸鹽組 （分別為36 565.59和16 829.54）， 說明DOM組的菌群豐富度最大， 而含有乙酸鹽的體系菌群豐富度低于空白組. 根據(jù)Shannon指數(shù)， 可以發(fā)現(xiàn)， 微生物多樣性是DOM組 （4.975 574） > 空白組 （4.762 311） > DOM協(xié)同乙酸鹽組 （4.280 182）， 說明DOM能夠促進(jìn)體系中微生物多樣性增加， 但在乙酸鹽的協(xié)同作用下菌群的結(jié)構(gòu)較為單一.

2.3.2 nirK型反硝化細(xì)菌菌群結(jié)構(gòu)特征

nirK型基因是亞硝酸鹽還原酶Nir的一種， 該基因編碼的亞硝酸還原酶在反硝化過程中具有決定性的作用[29]. 各組nirK型反硝化細(xì)菌屬水平相對(duì)豐度堆積圖如圖4所示. 副球菌屬（Paracoccus） 是一種典型的異養(yǎng)反硝化菌屬， 其在DOM組和DOM協(xié)同乙酸鹽組的相對(duì)豐度均較空白組 （18.18%）高， 分別為31.82%和50.00%， 推測(cè)DOM可為nirK型反硝化微生物提供能源物質(zhì)， 乙酸鹽作為碳源也促進(jìn)了該類微生物的生長(zhǎng). 亞硝化單胞菌屬 （Nitrosomonas） 為主要的硝化功能菌[30]， 其在DOM組的相對(duì)豐度最高， 其次是空白組， DOM協(xié)同乙酸鹽組中的相對(duì)豐度最低， 分析認(rèn)為DOM有利于該類微生物的生長(zhǎng)， 而DOM協(xié)同乙酸鹽體系中會(huì)抑制該類微生物的生長(zhǎng).

2.3.3 DNRA功能菌群結(jié)構(gòu)特征

DNRA細(xì)菌能夠?qū)⒊练e物中硝酸鹽異化還原為氨氮， 被認(rèn)為是底泥生態(tài)系統(tǒng)氮循環(huán)過程中不可忽視的重要過程， 對(duì)DNRA細(xì)菌多樣性的研究常采用硝酸鹽還原酶基因nrfA. 與DNRA功能相關(guān)的微生物在屬水平的相對(duì)豐度如圖5所示. 厭氧粘細(xì)菌 （Anaeromyxobacter） 是一種可以利用有機(jī)物還原硝酸鹽的異養(yǎng)菌[31]， 其屬于變形菌門 （Proteobacteria）. DOM組和DOM協(xié)同乙酸鹽組中Anaeromyxobacter的相對(duì)豐度均較空白組有所增加， 從0.79%提升至5.06% ～ 6.19%， 推測(cè)DOM有利于刺激該類微生物的生長(zhǎng)， 且乙酸鹽協(xié)同作用下該類微生物增加得更多， 從而導(dǎo)致體系中氨氮增加.

3 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)探究了城市河道沉積物DOM的賦存特征以及其對(duì)城市河道反硝化過程的影響作用. 城市河道沉積物DOM以小分子的富里酸為主要賦存形式， E3/E4值為6.54， 腐殖化程度較低、芳香性弱.由于DOM含有難以被微生物利用的碳源， 其對(duì)反硝化過程的促進(jìn)作用相對(duì)較弱， 本實(shí)驗(yàn)條件下DOM對(duì)TN和NO3–-N去除率分別提升了7.24% ± 0.36%和23.52% ± 1.17%. 乙酸鹽與DOM協(xié)同體系下的反硝化效果相對(duì)最優(yōu)， 對(duì)TN和NO3–-N的去除率分別可以達(dá)到74.48% ± 1.29%和98.62% ±0.07%. 微生物的分析表明， DOM組中的硫自養(yǎng)反硝化菌屬Thiobacillus和Thermomonas的相對(duì)豐度明顯增加， 而DOM協(xié)同乙酸鹽組中的異養(yǎng)反硝化菌屬Pseudomonas和Brevundimonas及nirK型反硝化菌屬Paracoccus的相對(duì)豐度明顯提升. 此外， DOM組和DOM協(xié)同乙酸鹽組中NH4+-N濃度均維持在較高的水平 （大于3.7 mg/L）， 而且二者體系中與DNRA功能相關(guān)的厭氧粘細(xì)菌 （Anaeromyxobacter）的相對(duì)豐度也均明顯增加， 推測(cè)DOM在促進(jìn)反硝化的同時(shí)誘導(dǎo)了DNRA過程的發(fā)生， 從而導(dǎo)致體系中NH4+-N濃度增加. 然而， DNRA過程的發(fā)生不利于城市河道氮素的削減. 建議通過適宜的曝氣在泥水界面形成合理的好氧-缺氧微環(huán)境， 促進(jìn)硝化-反硝化有效耦合作用， 強(qiáng)化氮的脫除.

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（責(zé)任編輯： 張 晶）