HPLC-ELSD法測定玄麥甘桔顆粒中桔梗皂苷D的含量

陳雯 劉勛 李欣茹 程韜 陳鳳

【摘 要】 目的：建立以HPLC-ELSD法測定玄麥甘桔顆粒中桔梗皂苷D含量的方法。方法：以Agilent C18（250mm×4.6 mm，5μm）為色譜柱;以乙腈-水（25∶75）為流動相;流速1.0 mL/min;柱溫30 ℃;蒸發(fā)光散射檢測器檢測。結(jié)果：桔梗皂苷D在0.4794～5.9915μg（r=0.9994）范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，回歸方程：y=1.7258x-0.4426，平均加樣回收為99.0%（RSD=1.0%）。結(jié)論： 本研究方法準(zhǔn)確可靠、重復(fù)性好，可用于該制劑的質(zhì)量控制和評價。

【關(guān)鍵詞】 玄麥甘桔顆粒;桔梗皂苷D;高效液相色譜蒸發(fā)光散射法;含量測定

【中圖分類號】R286 【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】 A 【文章編號】1007-8517（2021）14-0031-03

Abstract：Objective To establish a HPLC-ELSD method for the determination of platycodon D in Xuanmaganju granules. Methods Agilent C18 （250 mm×4.6 mm，5 μm） was used as chromatographic column. Acetonitrile-water （25∶75） was used as mobile phase. The flow rate of 1.0 mL/min; Column temperature 30 ℃. The temperature of the drift tube was 105℃ and the carrier gas was nitrogen （flow rate was 2.5L/min）. Results The linear relationship of platycodon platycodon D was good in the range of 0.4794～5.9915 μg（r=0.9994）. The regression equation was y=1.7258x-0.4426， and the average sample recovery was % （RSD=99.0%）.Conclusion The method is accurate， reliable and reproducible， and can be used for the quality control and evaluation of this preparation.

Keywords：Xuanmaganju Granules;Platycodin D;HPLC-ELSD;Content Determination

玄麥甘桔顆粒是由玄參、麥冬、甘草、桔梗四味藥材的水煎液濃縮為稠膏，加入適量的輔料（蔗糖或糊精）制成的顆粒[1]811。處方中四味藥材用量均等，玄參清熱解毒，麥冬潤肺養(yǎng)陰，甘草補(bǔ)脾調(diào)和諸藥，桔梗能宣肺祛痰，四藥合用，有清熱解毒、滋陰降火、祛痰利咽的功效。但在質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)控制上，《中國藥典》2015年版通過薄層色譜和高效液相色譜法對其中玄參、甘草進(jìn)行定性和定量控制，對麥冬和桔梗未進(jìn)行質(zhì)量控制。文獻(xiàn)報道中，也多對甘草酸、甘草苷、哈巴苷、哈巴俄苷、肉桂酸進(jìn)行研究，而未建立其中桔梗藥味的質(zhì)量控制方法。

桔梗有宣肺、利咽、祛痰、排膿的功效[1]277，趙秀玲[2]指出桔梗在食用和藥用上都有較高的價值，其中主要活性成分為皂苷類，具備抗高溫、抗水腫、抗毒、抗炎等作用。而桔梗皂苷D是桔梗皂苷中的主要皂苷[4]，本實驗通過建立桔梗皂苷D的含量測定方法，為進(jìn)一步評價玄麥甘桔顆粒的品質(zhì)提供科學(xué)的辦法。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 Waters 2695液相色譜儀及配套工作站，蒸發(fā)光散射檢測器，色譜柱為Agilent C18柱，4.6 mm×150 mm，流速1.0 mL/min。

1.2 試藥 玄麥甘桔顆粒分別來自于云南白藥股份有限公司（樣1、樣2）、葵花藥業(yè)集團(tuán)（重慶）有限公司（樣3、樣4）、太極集團(tuán)重慶中藥二廠有限公司（樣5、樣6）;桔梗皂苷D來源于中國食品藥品檢定研究院（批號：111851-201405，含量：93.0%）;乙腈為色譜純，甲醇、正丁醇、氨水、等試液均為分析純，水為純化水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 色譜柱：Agilent C18（250 mm×4.6 mm 5 μm）;流動相：乙腈-水（25∶75）：蒸發(fā)光散射檢測器檢測;柱溫30 ℃;流速：1.0mL/min;測定法：分別精密吸取對照品溶液10 μL與供試品溶液10～20 μL，注入液相色譜儀，測定。

2.2 對照品溶液的制備 取桔梗皂苷D對照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1 mL含0.25 mg的溶液，即得。

2.3 供試品溶液的制備 取裝量差異項下的本品，混勻，取適量，研細(xì)，取約20 g，精密稱定，置具塞錐瓶中，精密加入甲醇150 mL，稱定重量，超聲（功率250 w，頻率35 kHz）提取30 min，放冷，再稱定重量，用甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過，精密量取續(xù)濾液100 mL，置水浴上蒸干，殘渣加水20 mL使溶解，用水飽和的正丁醇振搖提取3次，每次20 mL，合并正丁醇液，用氨試液50 mL洗滌，棄去氨液，再用正丁醇飽和的水50 mL洗滌，棄去水液，正丁醇液蒸干，殘渣加甲醇溶解，轉(zhuǎn)移至5 mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，作為供試品溶液。

2.4 陰性供試品溶液的制備 取缺桔梗的陰性樣品，按照2.3制備成陰性供試品溶液，即得。

2.5 專屬性考察 取桔梗皂苷D對照品溶液、玄麥甘桔顆粒供試品溶液及陰性供試品溶液，按照“2.1”色譜條件注入液相色譜儀，供試品溶液色譜在與對照品溶液色譜相應(yīng)位置有相應(yīng)的色譜峰，且陰性無干擾，如圖1所示。

2.6 線性關(guān)系考察 精密吸取桔梗皂苷D對照品溶液（0.2397 μg/mL）2 μL、4 μL、5 μL、10 μL、15 μL、20 μL、25 μL依次注入液相色譜儀，測定峰面積。以對照品進(jìn)樣量X（μg）為橫坐標(biāo)，峰面積Y為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸計算，得出桔梗皂苷D線性回歸方程為：y=1.7258x-0.4426，r=0.9994。桔梗皂苷D在0.4794～5.9915μg的范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.7 精密度試驗 精密量取同一混合對照品10 μL，連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄色譜圖峰面積，桔梗皂苷D對照品的峰面積RSD為0.5%，結(jié)果說明儀器精密度良好。

2.8 重復(fù)性試驗 取同一批玄麥甘桔顆粒，按“2.3”供試品溶液制備方法制備6份，按“2.1”色譜條件測定桔梗皂苷D的含量，結(jié)果測定桔梗皂苷D平均含量43.3μg/g，RSD為1.8%，表明方法重復(fù)性良好。

2.9 穩(wěn)定性試驗 取同一批玄麥甘桔顆粒，按“2.1”色譜條件，于0 h、2 h、4 h、8 h、12 h、18 h，測定桔梗皂苷D的峰面積，RSD為1.7%，表明供試品溶液在18 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.10 回收率試驗 采用加樣回收法.取已測定含量的玄麥甘桔顆粒（平均含量43.3 μg/g）10g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入含桔梗皂苷D對照品溶液（2.12412 μg/mL）150 mL，稱定重量，自“超聲處理……”起按“2.3”供試品溶液制備方法制備6份，按“2.1”色譜條件測定桔梗皂苷D的含量，計算回收率。結(jié)果表明，該方法準(zhǔn)確度良好，見表1。

2.11 樣品測定 取三家企業(yè)各2批玄麥甘桔顆粒樣品，按“2.3”項下方法制備供試品溶液，按“2.1”色譜條件測定桔梗皂苷D的含量， 結(jié)果見表2。

3 討論

桔梗皂苷D為2015年版《中國藥典》桔梗的含量控制指標(biāo)，丁大勇等[3]采用75%乙醇對樣品進(jìn)行回流提取，提取液離心，上清液大孔樹脂吸附過柱，不同濃度乙醇洗脫。文獻(xiàn)[4]也提出了大孔吸附樹脂分離桔梗總皂苷的方法。朱丹妮等[5]以甲醇為溶劑，使用超聲提取法提取桔梗中的桔梗皂苷D，不進(jìn)行后續(xù)純化處理?！吨袊幍洹方酃ｍ椣路椒ㄗ顬閺?fù)雜，使用50%甲醇超聲提取后，對提取液進(jìn)行了萃取、萃取后藥液加于硅膠柱上，以三氯甲烷-甲醇不同比例混合溶液分次洗脫[1]277。

參照《中國藥典》和相關(guān)文獻(xiàn)[3-7]，考察實驗條件。單純超聲提取，桔梗皂苷D和其他成分無法達(dá)到較好的分離效果;超聲提取后，使用正丁醇萃取，氨試液洗滌，樣品能較好分離;在此基礎(chǔ)上分別使用大孔樹脂和硅膠柱進(jìn)行洗脫分離，結(jié)果大孔樹脂分離的結(jié)果含量較低，硅膠柱分離結(jié)果含量與未過柱前無明顯差異，故選擇了更加簡單、且無需使用易制毒試劑三氯甲烷的方法。

在供試品溶液制備提取溶劑的選擇中，對50%甲醇、80%甲醇、甲醇、乙醇的提取效果進(jìn)行比較，結(jié)果乙醇提取含量較低，而不同濃度的甲醇提取含量值無明顯變化，因甲醇處理的樣品容易過濾，故選擇甲醇方便操作。經(jīng)方法學(xué)考察，表面本法準(zhǔn)確可靠、重復(fù)性好，靈敏度高，為今后桔梗皂苷D在制劑中的定量分析提供參考。

參考文獻(xiàn)

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（收稿日期：2020-12-12 編輯：劉斌）