快速褪黑色素方法在免疫組織化學(xué)染色中的應(yīng)用

賴?yán)m(xù)文，王蔚，仝桂慧，朱銘誼 ，賴晃文，王卓才，張偉*

（南部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院1病理科，2基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室，廣州，510010）

在常規(guī)病理診斷中，惡性黑色素瘤的組織和細(xì)胞標(biāo)本需要做免疫組織化學(xué)染色進(jìn)行診斷與鑒別診斷，但這些組織和細(xì)胞標(biāo)本由于黑色素顆粒的存在，而使細(xì)胞形態(tài)模糊、不易辨認(rèn)，干擾免疫組織化學(xué)抗原和抗體的結(jié)合，且色素的顏色影響免疫組織化學(xué)染色結(jié)果的觀察和判讀，給病理診斷帶來(lái)嚴(yán)重的影響。有效地去除黑色素且不影響后續(xù)檢測(cè)是富含黑色素病變正確診斷的前提。目前有多種去除黑色素顆粒的方法[1,2]，如過(guò)氧化氫脫色法、過(guò)氧化氫聯(lián)合高錳酸鉀等，但大都脫色效果欠佳。我們通過(guò)試驗(yàn)比較多種脫色方法，以探討更加快速，高效和滿意的脫色素方法，滿足臨床病理診斷的需要。

材料與方法

1 病例選擇

選取我院2014年1月至2019年12月經(jīng)病理確診的20例惡性黑色素瘤，均為富含黑色素顆粒惡性黑色素瘤病例，選5例無(wú)色素性惡性黑色素瘤作為對(duì)照。

2 試劑

高錳酸鉀和30%過(guò)氧化氫為廣州化學(xué)試劑廠產(chǎn)品。一抗：?jiǎn)慰寺】贵wHMB45（批號(hào)：ZM-0187）、Melan-A（批號(hào)：ZM-0398）及CK（批號(hào)：ZM-0069）均購(gòu)自北京中杉國(guó)際有限公司；二抗為 Envision免疫組織化學(xué)試劑盒購(gòu)自丹麥DAKO公司。

3 褪色試劑配制方法

0.25%高錳酸鉀：0.25g高錳酸鉀溶液+蒸餾水100ml；0.5%高錳酸鉀：0.5g高錳酸鉀+蒸餾水100ml；10%過(guò)氧化氫溶液：30%過(guò)氧化氫30ml+蒸餾水60ml；15%過(guò)氧化氫溶液：30%過(guò)氧化氫50ml+蒸餾水50ml。

4 褪色方法

按脫色素方法分為A、B、C、D 4組。0.5%高錳酸鉀水浴法（A組）：組織切片經(jīng)0.5%高錳酸鉀溶液，55℃水浴加熱4min，1%草酸溶液處理1s×3次。0.25%高錳酸鉀溶液滴入法（B組）：0.25%高錳酸鉀溶液滴入切片，常溫下15～45min，其間視色素脫失情況結(jié)束處理時(shí)間。15%過(guò)氧化氫浸泡法（C組）： 15%過(guò)氧化氫浸泡切片30min后，0.5%高錳酸鉀液室溫浸泡5min。傳統(tǒng)過(guò)氧化氫脫色法[1]（D組）：用10%過(guò)氧化氫液處理切片24～48h。

5 染色

所有組織標(biāo)本經(jīng)10%中性甲醛固定，常規(guī)脫水、透明和石蠟包埋成石蠟組織標(biāo)本，切片3μm厚各16張，每組4張，用涂抹多聚賴氨酸玻片撈片，烘干。切片經(jīng)脫蠟、水洗后分別按不同褪色方法處理，脫顆粒處理后進(jìn)行HE染色和免疫組織化學(xué)染色，免疫組化采用Envision二步法。

結(jié) 果

4組脫色素方法染色效果見(jiàn)表1。HE染色顯示腫瘤組織富含色素（圖1A），以B組方法的退色素結(jié)果較理想，切片色素顆粒去除充分，切片完整，組織形態(tài)和細(xì)胞結(jié)構(gòu)清晰（圖1B）；免疫組織化學(xué)染色結(jié)果清晰易判讀，且顯示較強(qiáng)的敏感性和特異性（圖1C）。A組、C組和D組均有不同程度的缺陷，如組織結(jié)構(gòu)和細(xì)胞形態(tài)模糊、免疫組織化學(xué)染色時(shí)切片易脫落、免疫組織化學(xué)反應(yīng)產(chǎn)物定位差等（圖1D）。

圖1 不同脫色素方法處理惡性黑色素瘤組織HE和免疫組織化學(xué)染色效果比較。A，0.5%高錳酸鉀水浴法脫色素，HE染色，富含黑色素；B，脫色素，HE染色，色素顆粒去除充分，染色效果好；C，0.25%高錳酸鉀溶液滴入法脫色素，HMB45免疫組織化學(xué)染色，染色清晰易判讀，敏感性和特異性較強(qiáng)；D，10%過(guò)氧化氫法脫色素，HMB45免疫組織化學(xué)反應(yīng)產(chǎn)物定位差；比例尺，100μmFig. 1 Comparison of HE and immunohistochemical staining results of malignant melanoma tissues treated with different depigmentation methods. A,the section depigmented with the 0.5% potassium permanganate water bath method showed still rich in melanin when stained with HE; B, the section depigmented with the 0.25% potassium permanganate solution dropping method showed sufficient removal of the pigment particles and good HE staining effect; C, the section depigmented with the 0.25% potassium permanganate solution dropping method showed clear image which was easy to interpret when stained with HMB45; D, the section depigmented with the 10% hydrogen peroxide method showed poor localization when stained with HMB45; scale bar, 100μm

表1 4種脫色素方法染色效果比較Tab.1 Comparison of staining effects of four groups of depigmentation method

討 論

惡性黑色素瘤是臨床病理診斷中常見(jiàn)的腫瘤，由于其病理形態(tài)的結(jié)構(gòu)多樣性，需要與各種非黑色素性惡性腫瘤、痣或交界性病變鑒別。惡性黑色素瘤的黑色顆粒在電鏡下為特征性黑素體，對(duì)診斷具有決定性意義[4]，但因各個(gè)病理科條件所限或?qū)θ〔奶厥庖?，并非病理常?guī)檢測(cè)手段。由于惡性黑色素瘤起源于皮膚的黑色素細(xì)胞，黑色素顆粒是一種高分子生物色素，是由酪氨酸，多巴胺和酪胺等物質(zhì)合成，其顆粒在常規(guī)病理制片中不易溶解，在HE切片染色中，這些顆粒掩蓋細(xì)胞形態(tài)、結(jié)構(gòu)模糊不清，無(wú)法觀察細(xì)胞核的異型性變化、有無(wú)核仁以及核分裂像等的計(jì)數(shù)，影響正確的病理診斷及分型。免疫組織化學(xué)染色黑色素瘤細(xì)胞特殊標(biāo)記抗體HMB45和Melan-A有助于病變的正確診斷與鑒別診斷[5]。因此，去除惡性黑色素瘤的色素顆粒，對(duì)于HE染色切片形態(tài)觀察及免疫組化染色的陽(yáng)性判斷，具有重要的意義。

黑色素顆粒常見(jiàn)于黑色素瘤和良性的痣細(xì)胞病變中，由于顆粒穩(wěn)定，不溶于水和有機(jī)溶劑，在病理技術(shù)常規(guī)中難以去除，嚴(yán)重影響病理切片染色質(zhì)量，尤其對(duì)免疫組化的抗原表達(dá)很難區(qū)別，目前有許多報(bào)道[2,3]嘗試多種方法去除黑色素顆粒，但大都效果欠佳。本研究比較了4種脫色素方法，經(jīng)兩位診斷經(jīng)驗(yàn)豐富的病理醫(yī)師采用盲法分析比對(duì)，證明以0.25%高錳酸鉀溶液滴入法脫色素方法比較理想，達(dá)到高效去除黑色素顆粒，組織形態(tài)清晰和不掉片，免疫組織化學(xué)染色結(jié)果清晰易判讀。該方法解決了常規(guī)染色和免疫組織化學(xué)染色脫色素顆粒的難題。該方法由于在處理上采用低濃度高錳酸鉀，脫色素時(shí)間短，并在鏡下動(dòng)態(tài)觀察脫色素顆粒的過(guò)程，使切片不至于因過(guò)度的浸泡而產(chǎn)生掉片。此方法處理過(guò)程簡(jiǎn)單且時(shí)間短，易于在常規(guī)臨床工作中推廣使用。