液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法檢測食品中 托曲珠利及其殘留標(biāo)志物

◎ 柯麗群，王同珍，張泳儀

（廣東省中鼎檢測技術(shù)有限公司，廣東 東莞 523000）

托曲珠利是三嗪類抗球蟲藥物，具有高效、低毒和廣譜的驅(qū)蟲特性，在畜牧業(yè)生產(chǎn)中作為抗球蟲藥物被廣泛應(yīng)用。托曲珠利被動物吸收后，通過代謝轉(zhuǎn)化為托曲珠利標(biāo)志物，即托曲珠利砜[1-3]。托曲珠利的藥效時間短，實際生產(chǎn)中需要長期給藥，才能達到防治球蟲的目的，因此此藥物容易造成殘留積累，經(jīng)過食物鏈傳遞至消費者體內(nèi)，影響消費者的身體健康。在生產(chǎn)中托曲珠利藥物的使用有嚴格的限量標(biāo)準，《食品安全國家標(biāo)準 食品中獸藥最大殘留限量》 （GB 31650—2019）規(guī)定了托曲珠利標(biāo)志物托曲珠利砜在家禽（產(chǎn)蛋期禁用）和所有哺乳類食品動物（泌乳期禁用）的肌肉中的最高殘留限量為100 μg·kg-1[4-5]。

目前對托曲珠利的測定方法主要有液相色譜法[6-9]和液質(zhì)法[10-11]。液相色譜法，測定時各種化合物之間的相互干擾較大，容易造成各個目標(biāo)峰的結(jié)果不準確。由于托曲珠利的特征碎片離子較少，因此采用液質(zhì)法測定該化合物時，通常采用母離子碎片信息定性定量，容易受基質(zhì)效應(yīng)的影響，造成測試結(jié)果不準確。本文對樣品的提取、凈化和儀器方法條件進行了優(yōu)化，建立了具有高靈敏度和高選擇性的高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法，同時快速準確檢測托曲珠利及其標(biāo)志物托曲珠利砜，內(nèi)標(biāo)法定量，能夠降低基質(zhì)效應(yīng)的影響。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

H-Class-TQS-Micro液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀（美國Waters公司）；氮吹儀（上海安譜實驗科技股份有限公司）；離心機（北京時代北利離心機有限公司）。

托曲珠利、托曲珠利砜，采購于德國DR.E公司；托曲珠利-D3、托曲珠利砜-D3，采購于德國WITEGA Laboratorien公司。

乙腈、甲醇、甲酸（色譜純，Merck公司）；HLB固相萃取柱（6 mL，200 mg，Waters公司）；0.22 μm水系濾膜（天津津滕公司）；實驗室用水為Milli-Q超純水。

1.2 試驗方法

1.2.1 溶液配制

（1）標(biāo)準貯存溶液配制。分別準確稱取10 mg托曲珠利、托曲珠利砜及托曲珠利-D3、托曲珠利砜 -D3于10 mL的容量瓶中，用乙腈配成4份濃度各為 1 000 mg·L-1標(biāo)準貯備液，-20 ℃保存。

（2）混合標(biāo)準中間液配制。量取托曲珠利、托曲珠利砜貯備液置棕色容量瓶中，用乙腈稀釋成濃度為10 mg·L-1混合標(biāo)準工作液。

（3）混合內(nèi)標(biāo)中間液配制。量取托曲珠利-D3、托曲珠利砜-D3貯備液置棕色容量瓶中，用乙腈稀釋成濃度為10 mg·L-1混合標(biāo)準工作液。

（4）標(biāo)準工作曲線溶液配制。準確移取適量混合標(biāo)準工作液及混合內(nèi)標(biāo)工作液，用10%乙腈水稀釋配制成1～500 ng·mL-1的系列標(biāo)準溶液（內(nèi)標(biāo)均為40 ng·mL-1）。

（5）0.5%甲酸-30%甲醇提取液配制。取5 mL甲酸，300 mL甲醇置于1 L容量瓶中，用水定容至刻度。

1.2.2 樣品前處理

（1）提取。準確稱取5.0 g（精確至0.01 g）樣品置于50 mL離心管中，準確加入混合內(nèi)標(biāo)工作液100 μL， 20 mL 30%甲醇水（含0.5%甲酸）溶液，漩渦混勻，超聲提取15 min，4 500 r·min-1離心5 min，上清液備用。

（2）凈化。HLB凈化柱（200 mg，6 mL），預(yù)先依次用5 mL甲醇、5 mL水活化，精確移取4 mL備用液，以1～2滴/s的速度通過凈化柱，用5 mL 5%甲醇水淋洗，5 mL 90%乙腈10%甲醇洗脫，收集全部洗脫液于15 mL離心管中，置于45 ℃水浴下，氮吹至近干，準確加入1 mL 10%乙腈水溶解殘余物，過0.22 μm聚砜醚針式濾頭。濾液供液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測定。

1.2.3 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜條件

（1）液相色譜條件。Waters CORTECST UPLC C18色譜柱（2.1 mm×100 mm，1.6 μm）；流動相： 5 mmol·L-1乙酸銨水溶液（A）-乙腈（B）；流速：0.3 mL·min-1；進樣體積：2 μL；柱溫：45 ℃。液相色譜梯度洗脫程序：0～1.0 min，10% B；1.0～2.0 min，10%～90% B；2.0～4.0 min，90% B；4.0～4.1 min， 90%～10% B；4.1～7.0 min，10% B。

（2）質(zhì)譜條件。離子源：電噴霧電離（ESI-），毛細管：2.0 kV；錐口電壓：25V；離子源溫度：150 ℃； 碰撞氣：氬氣；脫溶劑管溫度：500 ℃；掃描模式：多反應(yīng)監(jiān)測模式。

2 結(jié)果與分析

2.1 質(zhì)譜條件優(yōu)化

分別將托曲珠利、托曲珠利砜及2種內(nèi)標(biāo)的標(biāo)準溶液配制成100 μg·L-1濃度的標(biāo)準溶液，確定化合物的質(zhì)譜條件，質(zhì)譜參數(shù)優(yōu)化結(jié)果見表1。

表1 托曲珠利等化合物質(zhì)譜參數(shù)表

2.2 流動相的選擇

本研究優(yōu)化色譜流動相時，首先比較了乙腈-水體系和甲醇-水體系的分離效果。結(jié)果表明，當(dāng)使用甲醇-水體系作為分離流動相時，化合物峰出現(xiàn)拖尾現(xiàn)象，故選擇乙腈-水體系作為分離流動相。采用負離子掃描的質(zhì)譜方法，為避免抑制負離子掃描模式下的離子化效果，流動相為不含酸體系。為進一步改善峰形，使用5 mmol·L-1醋酸銨代替純水。

2.3 前處理條件優(yōu)化

分別考察了乙腈-水（3∶7，V/V）、含0.5%甲酸的乙腈-水（3∶7，V/V）、甲醇-水（3∶7，V/V）、含0.5%甲酸的甲醇-水（3∶7，V/V）溶液的提取效果。乙腈和甲醇體系作為提取溶劑進行提取，均能得到良好的提取效果，但其中乙腈體系能夠更好的沉淀蛋白，減少雜質(zhì)的干擾，有利于下一步用HLB凈化，因此選用乙腈體系作為提取溶劑。對比乙腈-水（3∶7，V/V）與含有0.5%甲酸的乙腈-水（3∶7，V/V）的提取效果，發(fā)現(xiàn)使用含有0.5%的乙腈-水（3∶7，V/V）時整體表現(xiàn)出更好的回收率，因此最終選用含有0.5%的乙腈-水（3∶7，V/V）作為提取溶劑。

2.4 線性范圍及定量限

準確移取適量混合標(biāo)準工作液及混合內(nèi)標(biāo)工作液，用10%乙腈水稀釋配制成5 ng·mL-1、10 ng·mL-1、20 ng·mL-1、50 ng·mL-1、100 ng·mL-1、200 ng·mL-1、500 ng·mL-1的系列標(biāo)準溶液（內(nèi)標(biāo)均為40 ng·mL-1），依次從低濃度到高濃度進行分析，按照峰面積與對應(yīng)的溶液的質(zhì)量濃度做標(biāo)準曲線，見表2。

表2 托曲珠利、托曲珠利砜的線性范圍、相關(guān)系數(shù)及檢出限表

2.5 回收率及精密度實驗

以空白雞蛋為樣品，在5 μg·kg-1、20 μg·kg-1和100 μg·kg-13個水平下進行加標(biāo)回收實驗，每個水平平行測定7次，計算回收率和相對標(biāo)準偏差，在優(yōu)化后的實驗條件下托曲珠利及其標(biāo)志物的回收率為73.4%～104.7%，RSD≤9.2%，滿足日常檢測的要求，結(jié)果見表3。

表3 托曲珠利及其標(biāo)志物回收率和相對標(biāo)準偏差表（n=7）

3 結(jié)論

本研究建立一種托曲珠利及其殘留標(biāo)志物的液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測方法，樣品經(jīng)30%乙腈水（含0.5%甲酸）溶液提取，過HLB固相萃取柱凈化。本方法中托曲珠利及其殘留標(biāo)志物在一定范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)均大于0.99。通過優(yōu)化前處理過程的提取溶劑，提高回收率和穩(wěn)定性。該方法操作簡便，靈敏度高，可滿足食品中托曲珠利及其殘留標(biāo)志物的日常檢測要求。