超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法同時(shí)測(cè)定特殊醫(yī)學(xué)用途配方食品中8種水溶性維生素

◎ 張辰辰，潘 爽，于 新

（1.濟(jì)寧市食品藥品檢驗(yàn)檢測(cè)研究院，山東 濟(jì)寧 272000；2.辰欣藥業(yè)股份有限公司，山東 濟(jì)寧 272000）

特殊醫(yī)學(xué)用途配方食品（以下簡(jiǎn)稱“特醫(yī)食品”）是為滿足進(jìn)食受限、消化吸收障礙、代謝紊亂或特定疾病狀態(tài)人群對(duì)營養(yǎng)素或膳食的特殊需要，專門加工配制而成的配方食品。維生素是維持人體正常機(jī)能不可缺少的營養(yǎng)物質(zhì)，也是特醫(yī)食品中必須添加的成分之一，其添加量要求在一定范圍內(nèi)，由此可避免成分含量比例不當(dāng)，影響身體健康。維生素一般分為水溶性及脂溶性維生素，前者又以B族維生素最為重要[1]。

目前，有一系列國標(biāo)方法用于食品中水溶性維生素的檢測(cè)，主要為HPLC法、微生物法等，微生物法靈敏度高，但步驟復(fù)雜、環(huán)境要求高、重復(fù)性差[2]；HPLC法樣品前處理簡(jiǎn)單，但因其化學(xué)性質(zhì)和結(jié)構(gòu)差別大，許多需要使用離子對(duì)試劑，易造成性質(zhì)相近的維生素保留時(shí)間和洗脫順序發(fā)生變化，影響結(jié)果的準(zhǔn)確性和重復(fù)性[3]?，F(xiàn)行方法多采用維生素的單項(xiàng)檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)，且未曾有應(yīng)用于液體特醫(yī)食品中水溶性維生素測(cè)定的報(bào)道。本文旨在建立一種UPLC-MS/MS法同時(shí)測(cè)定液態(tài)特醫(yī)食品中多種水溶性維生素，探求樣品前處理簡(jiǎn)單快速、重復(fù)性好、精密度高的測(cè)定方法，為特醫(yī)食品中B族維生素的快速檢測(cè)提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 儀器

Exion LC-triple quad 3500液質(zhì)聯(lián)用儀（美國SCIEX）、高速冷凍離心機(jī)（湖南湘儀）、DSHZ-300A水浴恒溫振蕩器（太倉實(shí)驗(yàn)科技）、XSE104天平（梅特勒-托利多）、超純水儀（美國Millipore）。

1.2 試劑及溶液配制

VB1（純度99.09%）、VB2（純度98.12%）、VB6（純度98.80%）、生物素（純度98.61%），購自Stanford Analytical Chemicals Inc；煙酸（純度99.5%）、葉酸（純度97.0%）、VB5（純度99.4%）、煙酰胺（純度99.9%），購自A Chemtek Inc；淀粉酶（酶活力≥ 1.5 U·mg-1，Sigma）；乙腈、甲醇（色譜純，F(xiàn)isher）； 甲酸（分析純，上海阿拉丁）；鹽酸、氫氧化鈉、氨水 （分析純，天津科密歐）。

VB1標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液（1 mg·mL-1）：精密稱取VB10.1 g，用0.01 mol·L-1鹽酸溶解并定容于100 mL容量瓶中。VB2、生物素、葉酸標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液（1 mg·mL-1）：分別精密稱取各組分0.1 g，加30 mL氨水溶解，甲酸調(diào)pH至7.0，用水轉(zhuǎn)移并分別定容至100 mL容量瓶中。VB6、煙酸、煙酰胺、VB5標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液（1 mg·mL-1）：分別精密稱取0.1 g，加水溶解并定容至100 mL容量瓶中。

依次準(zhǔn)確吸取上述標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液適量，用空白基質(zhì)溶液將其稀釋成含量分別為0.001 μg·mL-1、 0.005 μg·mL-1、0.010 μg·mL-1、0.050 μg·mL-1、 0.100 μg·mL-1、0.500 μg·mL-1、1.000 μg·mL-1和 2.000 μg·mL-1的混合標(biāo)準(zhǔn)工作液。

1.3 色譜和質(zhì)譜條件

色譜柱：Agilent Eclipse Plus C18（2.1 mm×100 mm，1.8 μm）。流動(dòng)相A：0.1%甲酸水溶液，流動(dòng)相B： 0.1%甲酸甲醇。洗脫程序：0～3 min，99%A； 3～5 min，99%～5%A；5～8 min，5%～50%A；8～9min，50%～99%A；9～10 min，99%A。流速： 0.3 mL·min-1，進(jìn)樣量：10 μL，柱溫：40 ℃。電噴霧正離子模式掃描，電噴霧電壓：5 500 V；霧化器壓力：0.345 MPa；氣簾氣壓力：0.069 MPa；離子源溫度：550 ℃；噴霧氣壓力：344.74 kPa；輔助氣壓 力：344.74 kPa。

1.4 樣品處理

含淀粉樣品：稱取液體試樣10 g（精確至0.01 g） 于100 mL具塞錐形瓶中，加入0.5 g淀粉酶，混勻后向瓶?jī)?nèi)充氮?dú)?，蓋上瓶塞，置于55 ℃培養(yǎng)箱內(nèi)30 min， 取出冷卻至室溫。不含淀粉樣品無需此操作。

用5 mol·L-1、0.1 mol·L-1鹽酸溶液調(diào)試樣溶液pH至1.7±0.1，放 置2 min，再 用5 mol·L-1、0.1 mol·L-1氫氧化鈉溶液調(diào)pH至4.5±0.1，置于50 ℃水浴振蕩器中15 min，取出冷卻后轉(zhuǎn)至100 mL容量瓶中，用水沖洗錐形瓶，合并洗液，用水定容至刻度，混勻；取適量至離心管中8 000 r·min-1離心10 min，上清液過0.22 μm濾膜，供上機(jī)分析?？瞻谆|(zhì)為實(shí)驗(yàn)室自制的不含水溶性維生素的樣品，與樣品同法處理，全程避光操作。

2 結(jié)果與分析

2.1 前處理?xiàng)l件優(yōu)化

水溶性維生素分為游離態(tài)和結(jié)合態(tài)兩種，游離態(tài)可直接用水提取，而對(duì)于特醫(yī)食品這樣復(fù)雜的基質(zhì)，結(jié)合態(tài)的維生素通常被蛋白質(zhì)或糖等偶聯(lián)或包裹[4]，因此需通過一定的方法在保證維生素結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的情況下將其提取出來。本文采用熱水浴超聲法使游離態(tài)的維生素快速進(jìn)入提取液中，再通過優(yōu)化等電點(diǎn)蛋白質(zhì)沉淀法提取結(jié)合態(tài)維生素。樣品中的蛋白質(zhì)來源主要為酪蛋白和乳清蛋白，等電點(diǎn)為4.6～4.8，但產(chǎn)品中含有大量的金屬元素使溶液中的陽離子偏多，可能導(dǎo)致其等電點(diǎn)偏移。故本文考察了pH為4.2、4.4、4.6、4.9對(duì)沉淀效果的影響，結(jié)果表明，pH為4.4～4.6時(shí)能達(dá)到較好的沉淀效果。

2.2 質(zhì)譜條件優(yōu)化

在ESI正離子模式下，各組分均能獲得較高豐度的母離子，其中鹽酸鹽、鈣鹽等均會(huì)在脫去鹽后以單一分子的狀態(tài)離子化，得到[M+H]+峰；在負(fù)離子模式下，大部分組分響應(yīng)較低。確定母離子后，采用子離子掃描，選擇高豐度特征碎片離子為子離子，優(yōu)化碎裂電壓和碰撞能量。結(jié)果見表1。

表1 監(jiān)測(cè)離子對(duì)優(yōu)化參數(shù)表

2.3 流動(dòng)相的選擇

本研究對(duì)水-乙腈和水-甲醇流動(dòng)相體系進(jìn)行比較，結(jié)果表明乙腈響應(yīng)噪音較大，故選用甲醇為有機(jī)相?？紤]到質(zhì)譜中流動(dòng)相的選擇除考慮色譜分離效果外。還應(yīng)考慮化合物的離子化效率，故在流動(dòng)相中添加0.1%甲酸用于提高目標(biāo)物離子化效率和改善色譜峰，結(jié)果表明0.1%甲酸溶液對(duì)被測(cè)物的電離均有促進(jìn)作用，最終采用0.1%甲酸溶液-0.1%甲酸甲醇溶液進(jìn)行梯度洗脫，采集10 min，各組分在6 min內(nèi)獲得良好峰形。

2.4 方法學(xué)評(píng)價(jià)

2.4.1 線性范圍和定量限

實(shí)驗(yàn)以標(biāo)準(zhǔn)曲線法對(duì)目標(biāo)物進(jìn)行定量，取已配制濃度0.001～2.000 μg·mL-1的混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線（Y為峰面積；X為質(zhì)量濃度，μg·mL-1），以10倍基線噪音所對(duì)應(yīng)的濃度計(jì)算出方法的定量限（LOQ）。各組分線性關(guān)系良好，r≥0.998 1，LOQ為4～10 μg/100 g，滿足國家標(biāo)準(zhǔn)要求，結(jié)果見表2。

表2 方法的線性回歸方程、相關(guān)系數(shù)和定量限表

2.4.2 回收率和精密度

分別在空白基質(zhì)中添加3個(gè)濃度水平的標(biāo)準(zhǔn)品，每個(gè)水平進(jìn)行6組平行實(shí)驗(yàn)，按相應(yīng)的前處理方法處理后測(cè)定，結(jié)果見表3。結(jié)果顯示樣品的加標(biāo)回收率為85.52%～116.00%，RSD為0.49%～4.10%。說明該法在不同添加水平均有很好的回收率和重復(fù)性，方法準(zhǔn)確度與精密度滿足實(shí)驗(yàn)需求。

表3 方法的加標(biāo)回收率和精密度表（n=6）

2.5 樣品測(cè)定

采用本法對(duì)藥店購買的4種類型的液體特醫(yī)食品進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果見表4。實(shí)際測(cè)定含量與標(biāo)示值相符，符合我國食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)GB 29922—2013的要求[5]。

表4 樣品檢出結(jié)果表（單位：mg/100 g）

3 結(jié)論

本文建立了同時(shí)測(cè)定液體特醫(yī)食品中VB1、VB2、生物素、葉酸、VB6、煙酸、煙酰胺和VB5的UPLCMS/MS法。樣品經(jīng)酶解、沉淀蛋白后，通過質(zhì)譜MRM掃描方式在10 min內(nèi)完成多種B族維生素的測(cè)定，該方法簡(jiǎn)單快速、準(zhǔn)確靈敏，有望用于液體特醫(yī)食品中水溶性維生素含量的同步測(cè)定。