吡蟲啉對異遲眼蕈蚊抗性篩選及其對解毒酶活性的影響

張 睿，何 超，李 河，沈登榮，袁盛勇，李 珣

（紅河學(xué)院 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院/云南省高校滇南特色生物資源研究與利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南 蒙自 661199）

異遲眼蕈蚊（Bradysia difformisFrey）是一種世界性的農(nóng)、林業(yè)害蟲[1]，以幼蟲取食危害，造成食用菌出菇量顯著下降，引起植物體內(nèi)營養(yǎng)和水分運(yùn)輸受阻，嚴(yán)重影響農(nóng)作物的產(chǎn)量和質(zhì)量[2-3]。該蟲自2009年首次在我國云南省栽培食用菌上發(fā)現(xiàn)以來，目前已在甘肅、廣西、江蘇、浙江等?。▍^(qū)）的食用菌栽培區(qū)造成危害[3-5]。在甘肅天水地區(qū)還發(fā)現(xiàn)該蟲是韭菜種植區(qū)的優(yōu)勢種，常與韭菜遲眼蕈蚊（Bradysia odoriphaga）混合發(fā)生[3]。由于該蟲世代周期短、繁殖力強(qiáng)、具有鉆蛀危害等習(xí)性，目前在生產(chǎn)中主要采取化學(xué)藥劑對其進(jìn)行防治。吡蟲啉是一種新煙堿類的高效殺蟲劑，目前已廣泛用于大田作物、蔬菜、果樹和花卉植物上的害蟲防治[6]。研究表明，吡蟲啉是一種對食用菌、韭菜等作物安全性高、殘留量低，對眼蕈蚊科害蟲具有高效作用的殺蟲劑[7-10]。隨著殺蟲劑的頻繁使用，國內(nèi)外已有眼蕈蚊抗藥性的研究報(bào)道，如美國賓夕法尼亞州和特拉華州的厲眼蕈蚊（Lycoriella mali）已對芐氯菊酯產(chǎn)生了高抗性[11]。我國7個(gè)韭菜主產(chǎn)區(qū)的韭菜遲眼蕈蚊（B.odoriphaga）均對辛硫磷、毒死蜱等有機(jī)磷類殺蟲劑產(chǎn)生了抗性，部分主產(chǎn)區(qū)對吡蟲啉、噻蟲嗪、噻蟲胺等新煙堿類殺蟲劑產(chǎn)生了中、高抗性[12-13]。

在昆蟲抗藥性機(jī)制中，昆蟲解毒酶代謝作用的增強(qiáng)是昆蟲對殺蟲藥劑產(chǎn)生抗藥性的重要機(jī)制之一。研 究 發(fā) 現(xiàn)，棉 蚜（Aphis gossypii）[14]、西 花 薊 馬（Frankliniellaoccidentalis）[15]、褐 飛 虱（Nilaparvata lugens）[16]等昆蟲體內(nèi)多功能氧化酶（O-脫甲基，MFO）、羧酸酯酶（CarE）、谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶（GST）活性增強(qiáng)是昆蟲對吡蟲啉代謝抗性形成的主要原因。異遲眼蕈蚊是一類腐食性昆蟲，可在設(shè)施栽培作物（食用菌、溫室花卉等）和大田作物（韭菜、蔥等）之間交替危害。近年來，吡蟲啉已逐漸成為我國蔬菜上的骨干藥劑，目前國內(nèi)外尚無異遲眼蕈蚊對吡蟲啉抗性的研究報(bào)道。鑒于此，采用吡蟲啉對異遲眼蕈蚊進(jìn)行抗性篩選，分析吡蟲啉亞致死劑量對異遲眼蕈蚊敏感和抗性品系MFO、CarE、GST活性的影響，旨在評價(jià)異遲眼蕈蚊對吡蟲啉產(chǎn)生抗藥性的潛在風(fēng)險(xiǎn)，探討其對吡蟲啉代謝抗性形成的生化機(jī)制，為該蟲的抗性預(yù)防和治理提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 供試蟲源

異遲眼蕈蚊于2014年采自云南省蒙自市文瀾鎮(zhèn)平菇上，在室內(nèi)采用滅菌的腐殖土作為飼養(yǎng)基質(zhì)進(jìn)行連續(xù)飼養(yǎng)，幼蟲期添加2～4次黃豆粉（購于云南省蒙自市文瀾鎮(zhèn)農(nóng)貿(mào)市場）作為營養(yǎng)補(bǔ)充。在飼養(yǎng)期間不接觸任何藥劑，已連續(xù)飼養(yǎng)4 a。飼養(yǎng)和試驗(yàn)處理?xiàng)l件：溫度為(25±1)℃、相對濕度為（70±5）%、光周期為16L∶8D。

1.2 供試試劑

供試殺蟲劑：70%吡蟲啉水分散粒劑（拜耳作物科學(xué)有限公司）。主要化學(xué)試劑：α-乙酸萘酯、毒扁豆堿、固藍(lán)B鹽、十二烷基硫酸鈉、還原型谷胱甘肽（GSH）、1-氯-2,4-二硝基苯（CDNB）、對硝基苯酚、牛血清蛋白、考馬斯亮藍(lán)G250、還原型輔酶Ⅱ（NADPH）、對硝基苯甲醚，均購于上海阿拉丁生化科技公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 吡蟲啉對異遲眼蕈蚊的毒力測定 采用慕衛(wèi)等[17]的胃毒觸殺聯(lián)合毒力法，略做改動。采用蒸餾水將吡蟲啉稀釋為5個(gè)質(zhì)量濃度，設(shè)置蒸餾水為對照。取曬干黑木耳（購于云南省蒙自市文瀾鎮(zhèn)農(nóng)貿(mào)市場）3～4片放入各處理藥液中浸泡30 min，待木耳泡開后用圓形打孔器（直徑3.5 cm）打取木耳圓片，將木耳圓片放入50 mL塑料瓶（直徑4 cm，高6.3 cm）中，每瓶1片。挑選個(gè)體大小一致的三齡幼蟲30頭放在木耳上，用紗布封口，各處理設(shè)3次重復(fù)。處理后的幼蟲采取黑暗處理，置于光照培養(yǎng)箱中飼養(yǎng)，24 h后統(tǒng)計(jì)幼蟲死亡數(shù)。

1.3.2 異遲眼蕈蚊對吡蟲啉的抗性篩選 采用單體篩選法進(jìn)行敏感品系和抗性品系的分離。將羽化12 h以內(nèi)的單對成蟲放入產(chǎn)卵杯（直徑8.5 cm，高11 cm）中，杯內(nèi)預(yù)先放置3%水瓊脂用來收集卵粒，幼蟲孵化后轉(zhuǎn)移至滅菌的腐殖土中飼養(yǎng)繁殖1代，建立20個(gè)穩(wěn)定種群。根據(jù)1.3.1結(jié)果，采用5.0 mg/L吡蟲啉（死亡率10%～15%）處理各種群3齡幼蟲，處理方法同1.3.1。挑選死亡率較高的2～3個(gè)種群混合飼養(yǎng)作為敏感種群正常飼養(yǎng)（期間不接觸任何化學(xué)農(nóng)藥）。挑選死亡率較低的2～3個(gè)種群混合飼養(yǎng)作為抗性種群進(jìn)行抗性篩選，采用吡蟲啉（選擇上一代幼蟲死亡率為40%～50%的質(zhì)量濃度）處理三齡幼蟲，將幼蟲放入藥液中浸漬30 s，用相同濃度藥液處理滅菌腐殖土用于幼蟲飼養(yǎng)，期間添加1～2次黃豆粉，至三齡幼蟲發(fā)育至成蟲。將羽化12 h的成蟲接入不含藥劑的腐殖土中飼養(yǎng)至三齡幼蟲，作為下一代抗性篩選的蟲源，每3代進(jìn)行1次毒力測定，完成21代的抗性篩選。

1.3.3 抗性現(xiàn)實(shí)遺傳力和抗性風(fēng)險(xiǎn)評估 采用TABASHNIK等[18]的閾性狀分析法計(jì)算抗性現(xiàn)實(shí)遺傳力h2，參照王建軍等[19]方法進(jìn)行抗性風(fēng)險(xiǎn)評估。

1.3.4 異遲眼蕈蚊解毒酶活性測定 采用1.3.1的測定方法計(jì)算吡蟲啉對異遲眼蕈蚊敏感品系和抗性品系三齡幼蟲的亞致死劑量LC10、LC20和LC40（即引起三齡幼蟲死亡率分別達(dá)到10%、20%和40%的藥劑質(zhì)量濃度）。采用亞致死劑量LC10、LC20和LC40分別處理敏感品系和抗性品系異遲眼蕈蚊三齡幼蟲，設(shè)置蒸餾水為空白對照，各質(zhì)量濃度處理90頭三齡幼蟲，3次重復(fù)，分別于24、48、72 h后收集各質(zhì)量濃度處理存活的三齡幼蟲，用于解毒酶活性的測定與分析。MFO、CarE、GST活性測定參照余慧靈等[20]的方法，單位分別為nmol/(min·mg)、mmol/(min·mg)、mmol/(min·mg)。酶原蛋白質(zhì)含量測定參照BRADFORD等[21]的考馬斯亮藍(lán)G-250測定法。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 19.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)算毒力回歸方程、致死中質(zhì)量濃度（LC50）、亞致死劑量和95%置信限，采用Duncan’s法進(jìn)行差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 利用吡蟲啉對異遲眼蕈蚊抗性的篩選結(jié)果

從表1可看出，經(jīng)過21代的抗性篩選，吡蟲啉對異遲眼蕈蚊三齡幼蟲的致死中質(zhì)量濃度LC50由13.302 mg/L上升到54.449 mg/L，抗性倍數(shù)為4.09倍。室內(nèi)篩選21代后該蟲處于敏感性下降水平。從抗性選育中可看出，F(xiàn)0—F9代的抗性倍數(shù)增長緩慢；F9—F21代的抗性倍數(shù)增長較快，抗性水平呈現(xiàn)逐漸增長的趨勢。

表1 利用吡蟲啉對異遲眼蕈蚊抗性的篩選結(jié)果Tab.1 Resistance selection of B.difformis to imidacloprid

2.2 異遲眼蕈蚊對吡蟲啉的抗性現(xiàn)實(shí)遺傳力和發(fā)展速率預(yù)測

從表2可看出，吡蟲啉對異遲眼蕈蚊室內(nèi)連續(xù)篩選21代后，其抗性現(xiàn)實(shí)遺傳力（h2）為0.091 3，毒力回歸方程的平均斜率為2.555 3，表現(xiàn)型標(biāo)準(zhǔn)方差δp為0.391 3。假定以吡蟲啉致異遲眼蕈蚊的死亡率分別為50%、60%、70%、80%、90%、99%作為藥劑選擇壓力，預(yù)測抗性提高10倍所需的代數(shù)如圖1所示。隨著吡蟲啉選擇壓力的增加，異遲眼蕈蚊抗性水平增長10倍所需代數(shù)逐漸減少，選擇壓力在50%～70%時(shí)，抗性增加10倍需要24.1～35.1代；選擇壓力在80%～90%時(shí)，抗性增加10倍需要15.9～20.1代。說明異遲眼蕈蚊對吡蟲啉產(chǎn)生抗性的風(fēng)險(xiǎn)較低。

圖1 不同選擇壓力下異遲眼蕈蚊對吡蟲啉抗性提高10倍所需代數(shù)Fig.1 Generations for developping 10-fold resistance of B.difformis to imidacloprid under different selection pressures

表2 異遲眼蕈蚊對吡蟲啉的抗性現(xiàn)實(shí)遺傳力Tab.2 Realized heritability of the resistance of B.difformis to imidacloprid

續(xù)表2 異遲眼蕈蚊對吡蟲啉的抗性現(xiàn)實(shí)遺傳力Tab.2（Continued） Realized heritability of the resistance of B.difformis to imidacloprid

2.3 吡蟲啉亞致死劑量對敏感和抗性品系異遲眼蕈蚊多功能氧化酶O-脫甲基活性的影響

從圖2可知，隨著吡蟲啉亞致死劑量的提高，敏感和抗性品系異遲眼蕈蚊的多功能氧化酶O-脫甲基活性逐漸增大，其中敏感品系在亞致死劑量LC20和LC40處理下多功能氧化酶O-脫甲基活性顯著高于空白對照（P＜0.05），抗性品系在亞致死劑量LC10、LC20和LC40處理下多功能氧化酶O-脫甲基活性均顯著高于空白對照（P＜0.05）。敏感和抗性品系異遲眼蕈蚊的多功能氧化酶O-脫甲基活性在亞致死劑量LC10、LC20和LC40處理24～72 h呈現(xiàn)先升高后下降的趨勢，均在48 h達(dá)到峰值，敏感和抗性品系在LC40處理48 h時(shí)酶活性較空白對照分別上升了63.81%和119.42%。表明吡蟲啉亞致死劑量對抗性品系多功能氧化酶O-脫甲基活性有較強(qiáng)的提升作用，該酶活性的增強(qiáng)與異遲眼蕈蚊對吡蟲啉的代謝抗性有關(guān)。

圖2 吡蟲啉亞致死劑量對異遲眼蕈蚊多功能氧化酶O-脫甲基活性的影響Fig.2 Effectsof sublethal doses of imidacloprid on MFO O-demethylation activity in B.difformis

2.4 吡蟲啉亞致死劑量對敏感和抗性品系異遲眼蕈蚊谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶活性的影響

從圖3可知，隨著吡蟲啉亞致死劑量的提高，敏感和抗性品系異遲眼蕈蚊的谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶活性逐漸提高，同一處理時(shí)間不同處理濃度以及不同處理時(shí)間同一處理濃度下各品系異遲眼蕈蚊谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶活性與空白對照均無顯著差異，且該酶在敏感和抗性品系間變化水平也較小。表明吡蟲啉亞致死劑量對谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶活性無明顯的誘導(dǎo)作用。

圖3 吡蟲啉亞致死劑量對異遲眼蕈蚊谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶活性的影響Fig.3 Effects of sublethal doses of imidacloprid on GST activity in B.difformis

2.5 吡蟲啉亞致死劑量對敏感和抗性品系異遲眼蕈蚊羧酸酯酶活性的影響

從圖4可知，隨著吡蟲啉亞致死劑量提高，敏感和抗性品系異遲眼蕈蚊的羧酸酯酶活性逐漸增大，其中敏感品系在亞致死劑量LC20和LC40處理48 h的羧酸酯酶活性顯著高于空白對照（P＜0.05）；抗性品系除LC10處理24 h外，其余各濃度處理不同時(shí)間的羧酸酯酶活性均顯著高于空白對照（P＜0.05）。各處理酶活性均在處理48 h達(dá)到峰值，敏感和抗性品系在LC40處理48 h時(shí)酶活性較空白對照分別上升了18.40%和48.13%。表明吡蟲啉亞致死劑量對抗性品系羧酸酯酶活性具有較強(qiáng)的提升作用，該酶活性的增強(qiáng)與異遲眼蕈蚊對吡蟲啉的代謝抗性有關(guān)。

圖4 吡蟲啉亞致死劑量對異遲眼蕈蚊羧酸酯酶活性的影響Fig.4 Effects of sublethal doses of imidacloprid on Car E activity in B.difformis

3 結(jié)論與討論

本研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過室內(nèi)抗性篩選21代后，異遲眼蕈蚊對吡蟲啉的抗性倍數(shù)增長了4.09倍，篩選后的異遲眼蕈蚊抗性仍處于敏感性下降階段。目前,國內(nèi)外尚無異遲眼蕈蚊對吡蟲啉抗性的研究報(bào)道，但在國內(nèi)已有韭菜遲眼蕈蚊對吡蟲啉等煙堿類殺蟲劑產(chǎn)生抗藥性的研究報(bào)道[12-13]。究其原因，主要是近年在我國北方主要韭菜種植區(qū)大面積推廣使用吡蟲啉等煙堿類殺蟲劑控制韭菜遲眼蕈蚊所致[13]，各地區(qū)因用藥頻率的差異表現(xiàn)出對吡蟲啉不同的抗性水平，而在食用菌中使用吡蟲啉控制菇蚊、菇蠅的時(shí)間還較短，且食用菌生長周期短，頻繁使用化學(xué)殺蟲劑極易引起農(nóng)藥殘留[22]，因此在食用菌上吡蟲啉對害蟲的藥劑選擇壓力較小。另外，韭菜屬于多年生的蔬菜植物，而食用菌屬于階段性種植的蔬菜，兩者在用藥濃度和頻率上也存在較大差異。

昆蟲抗藥性風(fēng)險(xiǎn)評估是在抗性選育基礎(chǔ)上，依據(jù)抗性現(xiàn)實(shí)遺傳力預(yù)測不同選擇壓力下昆蟲的抗性發(fā)展速率。該方法已用于許多昆蟲抗性的風(fēng)險(xiǎn)評估，例如溴氰菊酯對異遲眼蕈蚊選擇壓力在80%～90%時(shí)，抗性增加10倍需要11～14代[23]；吡蟲啉對棉蚜選擇壓力在80%～90%時(shí)，抗性增加100倍需要30～38代[24]；吡蟲啉對白背飛虱（Sogatella furcifera）選擇壓力在80%～90%時(shí)，抗性增加10倍僅需4～5代[25]；吡蟲啉對新疆煙粉虱（Bemisia tabaci）隱種選擇壓力在70%～90%時(shí)，抗性增加10倍僅需4～6代[26]。本研究表明，當(dāng)吡蟲啉對異遲眼蕈蚊選擇壓力在80%～90%時(shí)，抗性增加10倍需要15.9～20.1代，說明異遲眼蕈蚊對吡蟲啉產(chǎn)生抗性的風(fēng)險(xiǎn)較低。考慮到該蟲食性較雜，可在設(shè)施栽培作物（食用菌、溫室花卉等）和大田作物（韭菜、蔥等）之間交替危害，為避免該蟲過早出現(xiàn)抗性問題，在不同作物間作中也要盡量降低吡蟲啉的施用量和使用頻率。

研究證實(shí)，昆蟲解毒酶代謝作用的增強(qiáng)是昆蟲對殺蟲藥劑產(chǎn)生抗藥性的重要機(jī)制之一[6]。本研究表明，吡蟲啉亞致死劑量能顯著提升異遲眼蕈蚊抗性品系多功能氧化酶O-脫甲基和羧酸酯酶的活性，在吡蟲啉各亞致死劑量處理下異遲眼蕈蚊抗性品系多功能氧化酶O-脫甲基和羧酸酯酶均在處理后48 h達(dá)到峰值，表明上述2種解毒酶活性的增強(qiáng)與異遲眼蕈蚊對吡蟲啉抗性的提高有密切關(guān)系。這與崔麗等[14]研究棉蚜抗吡蟲啉品系和敏感品系的多功能氧化酶O-脫甲基和羧酸酯酶活性、王圣印等[15]研究西花薊馬抗吡蟲啉品系和敏感品系的羧酸酯酶活性、WEN等[27]研究褐飛虱抗吡蟲啉品系和敏感品系的多功能氧化酶活性的結(jié)果相似。本研究結(jié)果也為生產(chǎn)上利用增效醚（多功能氧化酶抑制劑）、磷酸三苯酯（羧酸酯酶抑制劑）增強(qiáng)吡蟲啉對異遲眼蕈蚊抗性種群的防治效果提供了理論依據(jù)。在后續(xù)研究中，還需從2種解毒酶的抗性基因和表達(dá)水平深入研究，以全面揭示異遲眼蕈蚊對吡蟲啉的代謝抗性形成及相關(guān)機(jī)制，為異遲眼蕈蚊對吡蟲啉的抗性預(yù)防和吡蟲啉的科學(xué)使用提供科學(xué)依據(jù)。