CRISPR/Cas9技術(shù)在作物遺傳育種中的應用進展

焦耀磊，王春生，曲 碩，孫珊珊，朱婷婷，趙 賀，王丕武

（1.吉林農(nóng)業(yè)大學 農(nóng)學院，吉林 長春 130118；2.吉林農(nóng)業(yè)大學 園藝學院，吉林 長春 130118）

近幾十年，世界人口數(shù)量大幅增長，糧食產(chǎn)量供給不足成為當代人面臨的一大問題[1-2]。影響農(nóng)作物產(chǎn)量的因素除了耕地面積外，還有自然環(huán)境，包括非生物脅迫（干旱、高鹽、低溫、高溫等）和生物脅迫（真菌、細菌、病害、蟲害等），其中病害導致農(nóng)作物產(chǎn)量下降10%～15%[3]。CRISPR/Cas9（Clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISRP-associated nuclease 9）技術(shù)是近幾年發(fā)展起來的第3代基因組編輯技術(shù)，它是一種能夠研究基因功能并且提高作物產(chǎn)量的手段[4-5]，從在植物上第一次應用至今近10 a時間，研究人員利用該技術(shù)在植物領(lǐng)域進行了大量研究工作。目前，基因組編輯技術(shù)共出現(xiàn)了3代。第1代基因組編輯技術(shù)是ZFNs（Zinc finger nucleases）[6-8]，優(yōu)點是可與細胞內(nèi)DNA修復機制共同發(fā)揮作用，使研究者自如地編輯基因組，具有高度特異性，因而避免了免疫應答；缺點是需要組裝復雜的蛋白質(zhì)序列，導致構(gòu)建難度較大，并且容易發(fā)生脫靶現(xiàn)象、導致細胞死亡。第2代基因組編輯技術(shù)是TALENs（Transcription activator like effector nucleases）[9-12]，優(yōu)點是在很大程度上避免了脫靶現(xiàn)象，構(gòu)建復雜蛋白質(zhì)序列時較第一代技術(shù)簡單，缺點是該技術(shù)易受環(huán)境影響。第3代基因組編輯技術(shù)是CRISPR/Cas9，與前2代技術(shù)相比，優(yōu)點是僅需設(shè)計和構(gòu)建幾十個堿基的CRISPRRNA序列即可，用時更少且簡便、突變效率高；缺點是易發(fā)生脫靶現(xiàn)象，而且靶突變驗證難度高，目前該技術(shù)已被應用于多種生物的基因組定向編輯[13-16]。綜述了CRISPR/Cas9系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)、分類、作用機制及在作物遺傳改良中的應用進展，并探討了其存在的問題，展望了其應用前景。

1 CRISPR/Cas系統(tǒng)介紹

1.1 CRISPR/Cas9系統(tǒng)的發(fā)展史

20世紀80年代末，日本科學家ISHINO發(fā)現(xiàn)大腸桿菌基因組中堿性磷酸酶同工酶基因IAP上游存在一系列間隔的重復序列[17]。研究人員對大腸桿菌進行基因組測序，發(fā)現(xiàn)許多單拷貝的前導序列和多拷貝的短序列。隨后，有更多的相似位點在細菌和古細菌中被測出[18]。多位科學家認為，該結(jié)構(gòu)能在DNA修復和基因調(diào)控中起作用[19-20]。2002年，JANSEN等[21]在細菌與古細菌中發(fā)現(xiàn)了新的重復序列家族，該重復序列結(jié)構(gòu)特點為25～37 bp的序列片段與非重復的間隔序列交替出現(xiàn)，因為核苷酸序列與片段大小在同一物種內(nèi)高度保守，種間則無相似性，JANSEN依照此結(jié)構(gòu)將其命名為成簇的規(guī)律性間隔短回文重復序列，即CRISPR。2005年，BOLOTIN[22]發(fā)現(xiàn)，CRISPR中的這些短序列來自病毒和質(zhì)粒，對CRISPR/Cas系統(tǒng)中的Cas蛋白結(jié)構(gòu)進行分析，發(fā)現(xiàn)其具有核酸酶和解旋酶活性[23-24]。隨后人們通過研究發(fā)現(xiàn)，CRISPR/Cas系統(tǒng)是存在于細菌和古細菌中的一種適應性免疫系統(tǒng)[25]。2007年，BARRANGOU等[26]通過對嗜熱鏈球菌進行試驗進一步證實了CRISPR/Cas系統(tǒng)的適應性免疫過程，噬菌體侵染細菌后，細菌會從噬菌體基因組中將一段序列整合進自身基因組成為新的間隔序列，形成了特異性抵抗噬菌體的表型。2012年，成熟的crRNA（CRISPR RNA）被鑒定為與Cas蛋白相關(guān)的引導序列，有助于細菌對外源DNA的抵抗[27]。2013年，CONG等[28]使用人工設(shè)計的Ⅱ型CRISPR/Cas9系統(tǒng)成功誘導人和小鼠基因組的靶向切割，證實了RNA引導的CRISPR/Cas9技術(shù)具有廣泛適應性。ANDRIY等[29]利用CRISPR/Cas9技術(shù)在雙RNA復合物的引導下成功對肺炎雙球菌和大腸桿菌基因組進行定點突變，證明了該技術(shù)在細菌基因組中進行編輯的可行性。

1.2 CRISPR/Cas系統(tǒng)的分類

CRISPR/Cas系統(tǒng)中Cas核酸酶能夠通過引導RNA（Guide RNA，gRNA）的協(xié)助定點編輯基因組DNA。Cas蛋白作為一種核酸酶能夠在gRNA與外源DNA序列互補后定點切割外源基因序列。多項研究結(jié)果表明，CRISPR/Cas系統(tǒng)的成熟是通過產(chǎn)生種類不同的Cas蛋白來實現(xiàn)的[30]。MAKAROVA等[31]根據(jù)Cas蛋白的類別將CRISPR/Cas系統(tǒng)劃分為3種類型。Ⅰ型系統(tǒng)包括6個Cas蛋白，其中以Cas3蛋白為標志性蛋白質(zhì)。Cas3蛋白包含SF2(Superfamily-2)解旋酶結(jié)構(gòu)域和HD(Histidine-aspartate domain)核酸酶結(jié)構(gòu)域，為主要功能蛋白，能促進crRNA的合成，同時能在系統(tǒng)靶向干擾期間行使功能[32]。相較于其他2個類型，Ⅰ型系統(tǒng)Cas蛋白在數(shù)量和復雜程度上位居第一。SINKUNAS等[33]以嗜熱鏈球菌為材料，發(fā)現(xiàn)Cas3蛋白能夠憑借其HD結(jié)構(gòu)域優(yōu)先選擇單鏈DNA為作用底物。另外，Cas3蛋白HD結(jié)構(gòu)域的核酸酶活性是非ATP依賴性的，在對外源DNA切割時具有促進作用。Ⅱ型CRISPR/Cas系統(tǒng)以Cas9蛋白為主[34]。Cas9蛋白參與crRNA的合成[35]，含有HNH(Histine-asparagine-histine）核酸酶結(jié)構(gòu)域和RuvC(Crossover junction endodeoxyribonuclease）結(jié)構(gòu)域，能夠有效降解外源DNA和質(zhì)粒。HNH核酸酶結(jié)構(gòu)域能夠特異性切割外源DNA與間隔序列的互補鏈，RuvC結(jié)構(gòu)域能夠切割另一條鏈[36-37]。Ⅲ型CRISPR/Cas系統(tǒng)主要存在于古細菌中，大多數(shù)在臨床分離的致病菌中被發(fā)現(xiàn)，該系統(tǒng)以Cas10蛋白為標志性蛋白質(zhì)，對crRNA成熟起促進作用。3種類型系統(tǒng)各有特點，其中Ⅱ型CRISPR/Cas9系統(tǒng)僅需Cas9蛋白即可起到使外源DNA雙鏈斷裂的作用，而且只需要gRNA引導即可發(fā)揮功能，而Ⅰ型和Ⅲ型CRISPR/Cas系統(tǒng)需要復雜的蛋白質(zhì)復合物和多個RNA協(xié)助起作用。目前，CRISPR/Cas9系統(tǒng)已被人們改良并應用于多種生物基因組編輯[38]。

1.3 CRISPR/Cas系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)及作用機制

細菌與大多數(shù)古細菌在漫長的生物演變過程中，已經(jīng)進化出了由RNA引導的獲得性免疫系統(tǒng)，該系統(tǒng)主要由CRISPR位點和與之相關(guān)的基因編碼，用于抵抗噬菌體侵染和質(zhì)粒轉(zhuǎn)移[39-41]。

一個典型的CRISPR/Cas系統(tǒng)是由CRISPR基因座和CRISPR相關(guān)基因（Cas）以及反式編碼RNA（Trans-acting CRISPR RNA,tracrRNA）構(gòu)成。當噬菌體侵染時，CRISPR/Cas系統(tǒng)的免疫機制分為3個步驟進行。首先，當噬菌體首次侵染時，宿主體內(nèi)的蛋白質(zhì)復合體會與外源DNA靶標PAM（Protospacer adjacent motif）進行序列互補，將一小段外源DNA片段（原間隔序列）剪切并整合至宿主細胞CRISPR基因座中作為新的間隔序列保存[42]，從而保存了先前感染的遺傳記錄，這一過程使宿主能夠快速抵抗該入侵者的再次入侵[43]。其次，當噬菌體再次侵染時，新的間隔序列和其他間隔序列共轉(zhuǎn)錄成一個pre-crRNA（包含重復序列和間隔序列），tracrRNA也將被單獨轉(zhuǎn)錄，pre-crRNA在Cas蛋白的催化作用下加工為成熟的crRNA[44]，值得注意的是，不同類型系統(tǒng)中Cas蛋白種類也不同。最后，成熟的crRNA與Cas蛋白將在tracrRNA指導下組裝成效應復合物，成熟的crRNA中的間隔序列能與靶DNA序列互補，并引發(fā)Cas核酸酶對靶序列的特異性破壞，使得外源DNA功能缺失而失去對宿主的攻擊性。CRISPR/Cas系統(tǒng)的一個顯著特征是能夠識別外源DNA靶標PAM并破壞外源核酸中的互補序列[45-46]。

2 CRISPR/Cas9技術(shù)在作物遺傳育種中的應用進展

植物為人們提供食物、動物飼料、藥品、化學品、可再生材料和生物燃料。人們通過對植物進行培育來獲得人們需要的優(yōu)良性狀。常規(guī)育種方法依靠現(xiàn)有的自然遺傳變異，需要進行長期選育過程，才能將選定的性狀滲入到另一個優(yōu)良的品種中，且選育效果受到自然界中優(yōu)良等位基因的可用性限制。新的等位基因可以通過隨機誘變引入，但具有理想特性的突變體需要對大種群進行大規(guī)模的篩選才能確定，而篩選耗時長。因此，可以通過直接引入精確和可預測的基因組修飾來加速植物育種，而CRISPR/Cas9系統(tǒng)功能完備，且可以同時對多個靶位點進行修飾。

NHEJ（Non-homologous end joining）介導的基因敲除是最簡單的定向修飾形式，可用于消除對作物品質(zhì)有負面影響的基因。通過HDR(Homologous directed repair)插入序列，可以在確定的位點引入外源基因，促進高水平轉(zhuǎn)錄，且不干擾內(nèi)源基因的功能。

2.1 CRISPR/Cas9技術(shù)在作物品質(zhì)改良育種中的應用進展

較高的稻米蛋白質(zhì)含量能夠降低其食用口感和蒸煮品質(zhì)[47-48]。稻米蛋白質(zhì)含量是一個復雜農(nóng)藝性狀，通過對相關(guān)基因的調(diào)控，在一定范圍內(nèi)降低蛋白質(zhì)含量可以改善口感。氨基酸轉(zhuǎn)運體對蛋白質(zhì)合成有重要作用[49]。WANG等[50]利用CRISPR/Cas9技術(shù)對水稻氨基酸轉(zhuǎn)運體基因AAP6(Amino acid transporter gene 6)和AAP10進行靶向敲除，所獲突變體的蛋白質(zhì)含量顯著降低，并且直鏈淀粉含量降低，為培育食用口感和蒸煮品質(zhì)理想的水稻品種提供了新的策略。醇溶蛋白是大麥中的一種儲存蛋白，與麥芽品質(zhì)負相關(guān)。LI等[51]利用CRISPR/Cas9技術(shù)對大麥D醇溶蛋白（D hordein）基因進行靶向敲除，共得到2個突變株系，轉(zhuǎn)錄組分析表明，突變體的D醇溶蛋白基因轉(zhuǎn)錄水平比野生型低，該研究為培育高品質(zhì)麥芽品種提供依據(jù)。

WANG等[52]為研究CRISPR/Cas9技術(shù)在塊根作物中的應用效果，分別選取淀粉型甘薯品種徐薯22和富含胡蘿卜素型的甘薯品種泰中6為研究對象，以2個淀粉合成基因GBSSⅠ(Granule-bound starch synthaseⅠ)和SBEⅡ(Starch branching enzymeⅡ)為靶基因進行靶向敲除，其中GBSSⅠ基因控制直鏈淀粉的合成，SBEⅡ基因控制支鏈淀粉的合成，基因突變效率在62%～92%，突變體總淀粉含量無顯著變化，但徐薯22和泰中6的GBSSⅠ基因敲除突變體直鏈淀粉含量均下降，而徐薯22和泰中6的SBEⅡ基因敲除突變體中支鏈淀粉含量均下降。說明CRISPR/Cas9技術(shù)是提高甘薯淀粉品質(zhì)和選育多倍體塊根作物的有效工具。植物脂肪酸成分配比對食用和加工品質(zhì)有重要影響，因此，對油料作物脂肪酸相關(guān)基因進行改造成為育種目標之一。油菜中脂肪酸脫飽和酶基因FAD2(Fatty acid desaturase-2)是影響其油酸、亞油酸和亞麻酸含量的關(guān)鍵基因。HUANG等[53]利用CRISPR/Cas9技術(shù)對異源四倍體油菜中BnaFAD2基因的4個拷貝均進行突變，所獲突變體與野生型相比，油酸含量顯著提升，最高達到80%，亞油酸與亞麻酸含量下降。

2.2 CRISPR/Cas9技術(shù)在作物產(chǎn)量提升育種中的應用進展

目前，利用CRISPR/Cas9技術(shù)對作物產(chǎn)量性狀相關(guān)基因進行靶向編輯能夠有效提高作物產(chǎn)量。

水稻GS3（Grain size gene 3）和Gn1a（Grain number gene 1a）基因分別控制水稻的籽粒大小和粒數(shù)。沈蘭等[54]利用CRISPR/Cas9技術(shù)對水稻GS3和Gn1a基因進行靶向編輯，使用農(nóng)桿菌介導法轉(zhuǎn)化4個優(yōu)質(zhì)水稻品種，分別獲得了GS3和Gn1a的移碼突變體，突變體gs3和gn1a與野生型相比粒長變長,千粒質(zhì)量增加；gs3突變體與gn1a突變體相比,穗粒數(shù)顯著增加。ZHOU等[55]針對J809、L237和CNXJ 3個優(yōu)質(zhì)水稻品種進行產(chǎn)量相關(guān)性狀基因的QTL定位，發(fā)現(xiàn)了與籽粒大小相關(guān)的基因GS3、與籽粒長度和質(zhì)量相關(guān)的基因GW2（Grain width and weight gene 2）、與籽粒數(shù)量相關(guān)的基因Gn1a，利用CRISPR/Cas9基因組編輯技術(shù)對3個基因進行靶向編輯，水稻品種J809和L237的三重突變體的單穗產(chǎn)量分別增加了68%和30%，CNXJ的三重突變體僅表現(xiàn)為半矮化表型。水稻株高是與產(chǎn)量相關(guān)的重要農(nóng)藝性狀，水稻擁有適宜的株高有利于抗倒伏、增加種植密度，進而有利于產(chǎn)量的提高。在水稻中，GA20ox2是編碼GA20氧化酶的基因，其功能喪失可降低水稻株高。張笑寒[56]利用CRISPR/Cas9技術(shù)對GA20ox2基因進行定點突變，所得突變株與野生型相比，株高顯著降低，其他農(nóng)藝性狀未發(fā)生變化，這為培育水稻新品種提供了依據(jù)。在多倍體油菜育種中，抗碎莢性是影響多倍體油菜產(chǎn)量的重要因素之一。ZAMAN等[57]利用CRISPR/Cas9基因組編輯技術(shù)定向敲除影響油菜莢果形狀和大小的JAG（Jagged gene）同源基因JAG.A08，所得突變體與野生型比較，莢果開裂區(qū)發(fā)生顯著變化，突變體莢果細胞變大，果實凹凸不平、體積變小，抗碎莢性提高2倍。

2.3 CRISPR/Cas9技術(shù)在作物抗逆育種中的應用進展

通過CRISPR/Cas9基因組編輯技術(shù)對作物抗逆基因進行定向修飾，增強植株對環(huán)境的抗性，成為作物抗逆育種的一種有效方式。水稻RR22（B-type response regulator transcription factor 22）基因參與植物細胞分裂素信號轉(zhuǎn)導和代謝過程，該基因功能缺失可顯著提高植物耐鹽性[58]。ZHANG等[59]利用CRISPR/Cas9技術(shù)構(gòu)建OsRR22基因敲除載體轉(zhuǎn)入水稻中，所得T2突變株與野生型相比，苗期耐鹽性顯著提高。LIU等[60]從番茄中鑒定出1個LBDⅡ（Lateral organ boundaries domainⅡ）型基因家族LBD40（Lateral organ boundaries domain gene 40）基因，該基因能在植物根和果實中高表達，在PEG和高鹽的誘導下高表達，利用CRISPR/Cas9技術(shù)靶向敲除番茄LBD40基因，獲得突變體，干旱脅迫處理后，與野生型比較，突變體的保水能力提高。

白葉枯病是影響水稻生產(chǎn)的嚴重病害之一，由黃單胞桿菌變種引發(fā)，能使水稻減產(chǎn)50%。郝巍[61]對水稻轉(zhuǎn)錄組進行測序，發(fā)現(xiàn)1個易感白葉枯病的基因HW3（Rice bacterial blight susceptible gene），利 用CRISPR/Cas9技術(shù)構(gòu)建HW3基因敲除載體，通過農(nóng)桿菌介導法轉(zhuǎn)入水稻中，對轉(zhuǎn)基因陽性植株進行水稻白葉枯病菌株P(guān)XO99A的接菌處理，最終得到4株對PXO99A表現(xiàn)抗性的植株，說明通過敲除水稻感病基因HW3可提高感病品種對白葉枯病的抗病性。稻瘟病作為水稻最具破壞性的病害之一，常造成水稻大量減產(chǎn)。水稻ERF922（Ethylene-responsive factor gene 922）基因能夠調(diào)控水稻對稻瘟病的抗性。WANG等[62]利用CRISPR/Cas9技術(shù)對ERF922基因進行靶向敲除，所得突變植株表現(xiàn)出抗稻瘟病性，經(jīng)過純合加代后培育出抗稻瘟病品系。

2.4 CRISPR/Cas9技術(shù)在作物雄性不育性材料選育中的應用進展

雄性不育突變體和不育基因是作物雜交育種的珍貴資源。發(fā)展雜交制種技術(shù)，必須建立新的雄性不育突變系。CRISPR/Cas9技術(shù)非常適合針對基因組進行靶向修飾，從而產(chǎn)生雄性不育突變體。

LI等[63]利用TaU3(Triticum estivumRNA polymeraseⅢpromoters U3)啟動子驅(qū)動優(yōu)化后的CRISPR/Cas9載體，定點編輯3個小麥氧化還原酶同源等位基因NP1(No pollen 1)，得到完全雄性不育的突變體。劉玉琛等[64]利用CRISPR/Cas9技術(shù)對番茄花器官調(diào)控基因AP3(APETALA 3)進行突變，對所得陽性突變株進行測序，發(fā)現(xiàn)PAM序列上游存在核苷酸缺失現(xiàn)象，該現(xiàn)象可能導致AP3基因編碼蛋白質(zhì)出現(xiàn)氨基酸缺失和基因表達提前終止情況；對突變株農(nóng)藝性狀進行觀察，發(fā)現(xiàn)與野生型相比，突變株花瓣器官轉(zhuǎn)變成類似萼片的結(jié)構(gòu)，原本雄蕊的位置被類似心皮的結(jié)構(gòu)替代。SHEN等[65]利用CRISPR/Cas9技術(shù)對水稻雄性不育基因PTGMS2-2（Photoperiod-thermo-sensitive genic male sterile gene 2-2）進行靶向修飾，得到了光周期/熱敏核不育系。CHEN等[66]構(gòu)建CRISPR/Cas9載體用于靶向敲除玉米MS8（Male sterility gene 8）基因，所得突變株獲得雄性不育表型，且突變基因符合孟德爾遺傳規(guī)律，可穩(wěn)定傳遞到子代。

3 CRISPR/Cas9技術(shù)存在的問題及前景

3.1 問題

在過去的幾年里CRISPR/Cas9基因組編輯技術(shù)已經(jīng)取得了很大的進步，但該技術(shù)仍存在一些未完全解決的問題，如脫靶現(xiàn)象、外源基因殘留等。

3.1.1 脫靶問題 與ZFNs和TALENs基因組編輯技術(shù)相比，依賴于gRNA的CRISPR/Cas9技術(shù)在特異性識別方面更具有優(yōu)勢，但由于其編輯對象的基因組堿基數(shù)目龐大，相似片段也會廣泛存在，gRNA可能會識別靶點DNA以外的相似片段，進而會導致Cas9核酸酶對基因組的錯誤切割，引發(fā)脫靶現(xiàn)象。這種非特異性的基因組編輯易對編輯對象的生物學反應造成不確定性，影響該技術(shù)在研究和實踐中的可靠性。

3.1.2 外源基因殘留問題 從CRISPR/Cas9技術(shù)開發(fā)至今，針對植物基因組編輯的常規(guī)方法是構(gòu)建含有g(shù)RNA和Cas9蛋白基因序列的載體，然后通過農(nóng)桿菌介導等方法轉(zhuǎn)入受體，獲得基因組編輯突變植株，之后可經(jīng)過雜交或自交等方法剔除多余的外源基因。但質(zhì)粒在降解過程中可能會有未完全降解的小片段留在植物體內(nèi)，導致外源基因殘留。

3.2 前景

目前，研究人員針對脫靶現(xiàn)象不斷改進該技術(shù)，使其降低脫靶率，解決外源基因殘留問題。由于CRISPR/Cas9技術(shù)具有簡單、高效等優(yōu)勢，所以該技術(shù)依然具有廣泛應用于多種生物基因組編輯的前景。

CRISPR/Cas9系統(tǒng)雖然是一個非常好的基因組編輯工具，但需要更詳細地研究脫靶突變的程度，以及不同但完全匹配的靶點之間的切割效率差異。研究人員可同時生產(chǎn)并測試多種gRNA，并且大力發(fā)展新一代測序技術(shù)，這將為比較CRISPR/Cas9技術(shù)在多個物種和不同細胞類型中的應用效果提供充足的依據(jù)。此外，分析Cas9蛋白的結(jié)構(gòu)及其與gRNA和目標DNA的相互作用將促進更高效和特異性的新型核酸酶的開發(fā)。通過對Cas9蛋白的深入研究，研究人員開發(fā)出需要更長PAM的Cas9蛋白（更長的PAM在基因組中出現(xiàn)率更低），這可能會進一步減少脫靶效應。每一個涉及宿主-病原體相互作用的進化過程都是一場通過適應對手并產(chǎn)生新的對抗機制來戰(zhàn)勝對手的軍備競賽。因此，一些病毒很可能已經(jīng)進化出了能夠抵抗細菌免疫系統(tǒng)的調(diào)控因子，而這些尚未被發(fā)現(xiàn)的調(diào)控因子可能對病毒抵抗細菌CRISPR/Cas9系統(tǒng)提供幫助。