超期儲(chǔ)存小麥與水稻混合發(fā)酵生產(chǎn)燃料乙醇的研究

周娜娜，李永恒，孫振江，何太波，王小艷，佟 毅，王澤興，張俊奇，陳凡榮，李 凡，*

（1.中糧營(yíng)養(yǎng)健康研究院有限公司，北京 102209；2.廣西中糧生物質(zhì)能源有限公司，廣西 北海 536100；3.中糧生化能源（肇東）有限公司，黑龍江 肇東 151100；4.中糧生物科技股份有限公司，安徽 蚌埠 233010；5.玉米深加工國(guó)家工程研究中心，吉林 長(zhǎng)春 130033）

燃料乙醇作為一種清潔的可再生能源，具有資源豐富、碳沉積少、減少溫室氣體排放等優(yōu)點(diǎn)[1-3]。21世紀(jì)期初期我國(guó)開始發(fā)展燃料乙醇[4]，隨著車用燃料乙醇方案的推廣，燃料乙醇行業(yè)發(fā)展迅速，成為可再生能源的重要組成部分[5-8]。

燃料乙醇發(fā)酵主要原料包括谷物原料、薯類原料、糖質(zhì)原料以及纖維素原料，其中淀粉質(zhì)原料主要為玉米、小麥、水稻和木薯等[9-10]。隨著燃料乙醇行業(yè)的迅速發(fā)展，原料逐漸由單一原料向混合原料轉(zhuǎn)化[11-12]。近年來，隨著糧食產(chǎn)量的增加，我國(guó)水稻和小麥庫(kù)存量巨大，大量超期儲(chǔ)存糧亟待處理[13]。超期儲(chǔ)存小麥和水稻是長(zhǎng)期（3年以上）儲(chǔ)藏的糧食，由于霉變、真菌毒素和重金屬超標(biāo)等問題，一般用于燃料乙醇的生產(chǎn)[14-15]。小麥和水稻原料的利用，能夠?qū)崿F(xiàn)原料多元化的柔性生產(chǎn)，避免企業(yè)過度依賴玉米原料，有效緩解原料供應(yīng)緊張的問題[16]，形成多種原料替代格局，增強(qiáng)企業(yè)活力和市場(chǎng)競(jìng)爭(zhēng)能力，促進(jìn)企業(yè)的長(zhǎng)足、健康發(fā)展[17]。由于超標(biāo)的小麥和水稻價(jià)格較低，通過優(yōu)化處理等方式，能夠降低企業(yè)生產(chǎn)成本，取得較好的經(jīng)濟(jì)效益，還能保證糧食安全[18]。

目前，燃料乙醇的研究熱點(diǎn)主要聚焦在如何利用超期儲(chǔ)存小麥、水稻等多種原料發(fā)酵生產(chǎn)燃料乙醇。劉勁松等[19]研究了脫殼水稻粉與玉米粉混合發(fā)酵，并對(duì)于發(fā)酵醪進(jìn)行高效液相色譜（highperformanceliquidchromatography，HPLC）分析，篩選出超期儲(chǔ)存水稻添加比例40%時(shí)，淀粉出酒率最高。沈存忠等[20]研究了超期儲(chǔ)存水稻脫殼率對(duì)于燃料乙醇生產(chǎn)的影響，發(fā)現(xiàn)將稻谷進(jìn)行一定程度脫殼生產(chǎn)，有利于生產(chǎn)穩(wěn)定進(jìn)行且降低生產(chǎn)成本。孫振江等[21]對(duì)于以小麥為原料進(jìn)行酒精發(fā)酵研究，優(yōu)化了適用于小麥發(fā)酵的固形物含量、液化時(shí)間和酶加量。其他相關(guān)的研究還有很多，這些研究也為燃料乙醇生產(chǎn)提供了指導(dǎo)?；谝陨系那闆r，結(jié)合酒精工廠現(xiàn)有生產(chǎn)工藝情況，該研究以耐高溫酒用干酵母為發(fā)酵菌株，采用同步糖化發(fā)酵法，通過測(cè)定液化醪和發(fā)酵醪指標(biāo)，優(yōu)化了超期儲(chǔ)存小麥和水稻混合發(fā)酵的輔料，為復(fù)合原料生產(chǎn)燃料乙醇提供參考價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

超強(qiáng)復(fù)配淀粉酶（13萬(wàn)U/g）、低pH淀粉酶（14萬(wàn)U/g）：諾維信（中國(guó)）生物技術(shù)有限公司；耐高溫淀粉酶（18萬(wàn)U/g）、糖化酶（26萬(wàn)U/g）、酸性蛋白酶（10萬(wàn)U/g）：山東隆科特酶制劑有限公司；α-淀粉酶（14萬(wàn)U/g）：杰能科（中國(guó)）生物工程有限公司；蔚藍(lán)木聚糖酶（3萬(wàn)U/g）、夏盛木聚糖酶（3萬(wàn)U/g）、挑戰(zhàn)定制酶（5萬(wàn)U/g）分別為青島蔚藍(lán)生物股份有限公司、夏盛（北京）生物技術(shù)有限公司、北京挑戰(zhàn)生物技術(shù)有限公司惠贈(zèng)；耐高溫酒用干酵母：安琪酵母股份有限公司；安菌泰殺菌劑：柳州龍?zhí)┛萍加邢薰荆簧V標(biāo)品均為色譜純，其他試劑均為分析純；超期儲(chǔ)存水稻和小麥取自廣西中糧生物質(zhì)能源企業(yè)車間。

1.2 儀器與設(shè)備

ZHWY-2112F搖床：上海智城分析儀器制造公司；安捷倫1200型液相色譜：安捷倫科技公司；3-18K離心機(jī)：美國(guó)Sigma公司；KQ-800KDV超聲清洗機(jī)：江蘇省昆山超聲儀器公司；WELCH 2546C-02真空泵：美國(guó)威爾奇公司；AL204分析天平：瑞士Mettler公司；DSH-50-10快速水分測(cè)定儀：上海越平科學(xué)儀器有限公司；NDJ-5S黏度計(jì)：上海精密儀器有限公司；液化罐、蒸餾冷凝裝置：河南神泰公司定制；HWS-28水浴鍋：上海一恒科學(xué)儀器有限公司；PHSJ-3F pH計(jì)：上海雷磁儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 燃料乙醇生產(chǎn)工藝流程及操作要點(diǎn)

操作要點(diǎn)：

小麥和水稻粉碎后均過20目篩網(wǎng)，按一定比例混合，加入保溫70 ℃的混合水（清液∶工藝水∶中水比例為34∶51∶15），控制粉漿干物質(zhì)含量30%左右，調(diào)節(jié)pH5.6，添加α-淀粉酶0.17 kg/t糧，進(jìn)行拌料30 min。然后將溫度升至90 ℃，液化120 min，整個(gè)液糖化和發(fā)酵流程具體參考文獻(xiàn)[21]。

將液化醪降溫至32 ℃，硫酸調(diào)節(jié)pH至4.2～4.4，裝液量200 mL/500 mL，發(fā)利耐高溫酒用干酵母接種量0.05%，糖化酶加量0.68 kg/t糧，酸性蛋白酶加量0.035 kg/t糧，安菌泰5 mg/L，轉(zhuǎn)速100 r/min，發(fā)酵時(shí)間72 h。

發(fā)酵完成后，取100 mL成熟醪，加入100 mL去離子水，混合均勻后用蒸餾冷凝裝置蒸酒；蒸酒后剩余的殘液直接用板框布過濾，計(jì)算5 min內(nèi)的過濾速率；濾液用快速水分測(cè)定儀測(cè)定干物含量。

1.3.2 檢測(cè)方法

（1）理化指標(biāo)的測(cè)定

粗脂肪按國(guó)標(biāo)GB 5009.6—2016《食品中脂肪的測(cè)定》[22]測(cè)定；粗蛋白按國(guó)標(biāo)GB 5009.5—2010《食品中蛋白質(zhì)的測(cè)定》方法測(cè)定[23]；半纖維素和纖維素參考文獻(xiàn)測(cè)定[24]；灰分按國(guó)標(biāo)GB 5009.4—2016《食品中灰分的測(cè)定》[25]測(cè)定；淀粉按國(guó)標(biāo)GB/T 5009.9—2008《食品中淀粉的測(cè)定》[26]方法測(cè)定；還原糖的檢測(cè)：按國(guó)標(biāo)GB/T 5009.7—2008《食品中還原糖的測(cè)定》[27]測(cè)定；干物質(zhì)的檢測(cè)：使用快速水分測(cè)定儀測(cè)定；黏度：使用黏度測(cè)定儀測(cè)定；酒精度：酒精計(jì)法。

（2）DE值和淀粉出酒率的計(jì)算

葡萄糖當(dāng)量（dextrose equivalent）值及淀粉出酒率的計(jì)算公式如下：

（3）發(fā)酵醪組成的測(cè)定

采用高效液相色譜法進(jìn)行測(cè)定，色譜柱：HPX-87H（300 mm×7.8 mm）；流動(dòng)相：0.005 mol/L H2SO4；泵流速：0.6 mL/min；柱溫：65 ℃；示差折光檢測(cè)器，設(shè)置溫度：50 ℃；進(jìn)樣量20 μL；運(yùn)行時(shí)間30 min。

1.3.3 試驗(yàn)優(yōu)化

小麥添加比例優(yōu)化實(shí)驗(yàn)：拌料階段將小麥分別按0%、30%、50%和100%添加至水稻中，其余步驟與1.3.1一致，測(cè)定各組指標(biāo)。

不同種類淀粉酶的篩選實(shí)驗(yàn)：將小麥按30%比例與水稻混合，以淀粉酶活性一致進(jìn)行添加，設(shè)置4組實(shí)驗(yàn)，拌料階段分別添加超強(qiáng)復(fù)配淀粉酶（0.26 kg/t糧）、隆大耐高溫淀粉酶（0.21 kg/t糧）、低pH淀粉酶（0.26 kg/t糧）和杰能科α-淀粉酶（0.17 kg/t糧，對(duì)照），其余步驟與1.3.1一致，測(cè)定各組指標(biāo)。

降黏酶種類及添加方式的篩選實(shí)驗(yàn)：將小麥按30%比例與水稻混合，根據(jù)降黏酶的耐溫特性，設(shè)置4組實(shí)驗(yàn)，分別在拌料階段額外添加蔚藍(lán)木聚糖酶、夏盛木聚糖酶，同步糖化發(fā)酵階段額外添加夏盛木聚糖酶、挑戰(zhàn)定制酶，各組酶添加量均為0.3 kg/t糧，其余步驟與1.3.1一致，對(duì)照組為不添加降黏酶的實(shí)驗(yàn)，測(cè)定各組指標(biāo)。

1.3.4 數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均以均值表示，采用Excel 2010作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 原料成分分析

將超期儲(chǔ)存的小麥和水稻進(jìn)行全組分分析，結(jié)果如表1所示，從粗脂肪和灰分含量來看，小麥中的兩種成分含量均低于水稻，更利于發(fā)酵時(shí)的原料利用。從淀粉含量來看，小麥中的淀粉含量要比水稻中的高出約6個(gè)百分點(diǎn)，添加小麥更有利于發(fā)酵酒精度的提高。此外，小麥的粗蛋白和半纖維素含量分別是水稻的1.8和1.7倍，在液化發(fā)酵時(shí)會(huì)導(dǎo)致醪液的黏度較大，泡沫多，裝料系數(shù)小[28]。因此，需要摸索小麥的最佳添加比例，在提高混合原料的淀粉含量的同時(shí)，醪液黏度也在可接受范圍內(nèi)，減少設(shè)備的處理壓力。

表1 超期儲(chǔ)存小麥和水稻原料的全組分分析Table1 Total component analysis of aging wheat and rice raw materials%

2.2 小麥添加比例優(yōu)化實(shí)驗(yàn)

小麥中的蛋白和可溶性戊聚糖是小麥醪液黏度高的主要原因[28]，當(dāng)小麥與水稻摻混使用時(shí)，醪液濃度也會(huì)因高黏度受到限制，因此需要摸索小麥的添加比例。本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)了不同的小麥添加比例對(duì)液化醪進(jìn)行黏度、還原糖和干物等指標(biāo)的影響，結(jié)果見表2。

由表2可知，在同一拌料干物下，隨著小麥添加比例的升高，液化醪的黏度明顯升高，液化干物也隨之提高。這可能是小麥中麩皮的存在，導(dǎo)致混合原料整體吸水性增強(qiáng)[29]，使得干物含量升高，從而導(dǎo)致液化后醪液的黏度有大幅升高。醪液黏度升高在生產(chǎn)上會(huì)導(dǎo)致管道的堵塞和壓力升高，不利于生產(chǎn)設(shè)備的連續(xù)運(yùn)行[30]。基于工廠設(shè)備管道對(duì)于醪液黏度的承受范圍，陳化小麥添加30%是可以接受的。對(duì)不同小麥添加比例的成熟醪進(jìn)行高效液相色譜HPLC分析，結(jié)果見表3。

表3 不同小麥添加比例對(duì)成熟醪指標(biāo)的影響Table3 Effect of different wheat addition ratios on indexes of mature mash

由表3可知，隨著小麥添加比例的升高，殘?zhí)牵―P4+、麥芽三糖、麥芽糖、葡萄糖和果糖）、副產(chǎn)物（如甘油和乙酸）等有所升高，成熟醪黏度在小麥添加比例在50%及以上時(shí)黏度升高較明顯。

乙醇/甘油是反映發(fā)酵質(zhì)量的重要指標(biāo)[31]，其值越高說明發(fā)酵水平越高，需控制在一定范圍內(nèi)。當(dāng)小麥添加比例高于30%時(shí)，此值明顯下降。這說明小麥添加比例超過一定范圍時(shí)，會(huì)導(dǎo)致酵母發(fā)酵生產(chǎn)酒精的性能下降，產(chǎn)生更多的副產(chǎn)物—甘油等。淀粉出酒率是乙醇質(zhì)量（以95%vol計(jì)）與原料中淀粉含量的比值[31]，由于兩種原料按不同比例混合時(shí)的淀粉含量差異較大，以淀粉出酒率表征發(fā)酵效率較為準(zhǔn)確。結(jié)果顯示，當(dāng)小麥添加比例0和30%時(shí)，淀粉出酒率最高，均為53%。

結(jié)合液化醪及成熟醪分析結(jié)果，綜合考慮，30%小麥的添加比例比較合理，對(duì)于生產(chǎn)穩(wěn)定性影響較小，且提高了乙醇產(chǎn)量。

2.3 不同種類淀粉酶的篩選實(shí)驗(yàn)

耐高溫淀粉酶可以快速將長(zhǎng)鏈淀粉切割成長(zhǎng)短不一的糊精，因此具有明顯的降黏效果[32]。不同廠家的耐高溫淀粉酶來源有所差異，對(duì)于同一種底物的降解效果也會(huì)不同。針對(duì)優(yōu)化出的30%小麥添加比例的混合原料，主要考察淀粉酶對(duì)于液化醪黏度及發(fā)酵效果的影響，結(jié)果見圖1。

由圖1可知，從液化醪黏度來看，超強(qiáng)復(fù)配淀粉酶對(duì)于液化醪的降黏效果最佳，液化醪黏度為372 mPa·s，其次是杰能科α-淀粉酶。從發(fā)酵酒精度來看，使用超強(qiáng)復(fù)配淀粉酶的酒精度最高為12.37%vol，其余三種淀粉酶釀造的酒精度約為11.38%vol，約高出1個(gè)百分點(diǎn)。這可能與超強(qiáng)復(fù)配淀粉酶中復(fù)配了耐高溫的蛋白酶有關(guān)。由于小麥原料中蛋白含量較高（表1），影響著液化醪液的黏度，而超強(qiáng)復(fù)配淀粉酶中的蛋白酶可以較好的發(fā)揮作用，緩解了小麥添加帶來的黏度升高。由于小麥蛋白的降解，可能使得混合原料的淀粉釋放更徹底，從而導(dǎo)致酒精度的升高。因此，針對(duì)添加30%陳化小麥的混合原料，使用超強(qiáng)復(fù)配淀粉酶更適合。

圖1 不同種類淀粉酶對(duì)液化和發(fā)酵的影響Fig.1 Effect of different amylases on liquefaction and fermentation

2.4 降黏酶種類及添加方式的篩選實(shí)驗(yàn)

小麥麩皮中含有較高的非淀粉多糖，在水溶液中形成黏度較高的膠體溶液，導(dǎo)致添加小麥后醪液黏度升高，最終導(dǎo)致清液干物的升高，增大了后期污水處理的壓力。降黏酶含一系列能夠?qū)Ψ堑矸鄱嗵牵ɡw維素、半纖維素、木聚糖和β-葡聚糖）進(jìn)行轉(zhuǎn)化和分解的酶[33]。采用降黏酶來水解非淀粉多糖[34]，可以降低小麥預(yù)處理過程中的黏度[26]，從而提高初始拌料干物和后續(xù)發(fā)酵酒精度。根據(jù)不同酶的酶學(xué)特性，設(shè)計(jì)不同降黏酶種類及添加方式的降黏效果對(duì)比見圖2。

圖2 不同降黏酶種類及添加方式的降黏效果Fig.2 Viscosity lowering effect of different types and adding ways of viscosity lowering enzyme

首先，從降黏酶的添加方式來看，在拌料階段添加降黏酶可以顯著將液化醪黏度從449 mPa·s降低至140 mPa·s左右，并且發(fā)酵醪黏度也出現(xiàn)明顯下降；相比之下，在發(fā)酵階段添加降黏酶只能降低發(fā)酵醪黏度，并不能解決前期液化醪黏度高的問題。對(duì)于蒸酒后的殘液進(jìn)行濾速和濾后干物分析，發(fā)現(xiàn)不管何種降黏酶和添加方式，均能不同程度的提高殘液的濾速（以5 min內(nèi)的過濾速率計(jì)），在拌料階段添加蔚藍(lán)木聚糖酶的濾速最高，由對(duì)照（不添加降黏酶）的4.8 mL/min提高至7.8 mL/min；最終濾過的清液干物也由對(duì)照的8.2%降低至5.7%。這可能是由于小麥麩皮中半纖維素含量較高（表1），降黏酶尤其是木聚糖酶的添加促進(jìn)了小麥麩皮的部分降解，使得大分子的非淀粉多糖降解成長(zhǎng)短不一的小分子，從而導(dǎo)致表觀黏度下降，蒸餾殘液過濾速度快。因此，結(jié)合黏度、濾速及清液干物結(jié)果分析，降黏酶在拌料階段添加效果最佳，最優(yōu)的降黏酶是蔚藍(lán)木聚糖酶，參考工廠中降黏酶的添加量，選擇添加量為0.3 kg/t糧。

3 結(jié)論

該文通過搖瓶發(fā)酵小試實(shí)驗(yàn)，優(yōu)化了超期儲(chǔ)存小麥和水稻混合發(fā)酵生產(chǎn)燃料乙醇的發(fā)酵輔料。在兩者混合發(fā)酵生產(chǎn)乙醇時(shí)，干物質(zhì)含量為30%，小麥添加比例30%，使用超強(qiáng)復(fù)配淀粉酶的條件下，液化醪黏度最低（約370 mPa·s），酒精度最高可達(dá)12.37%vol。若在拌料階段額外添加0.3 kg/t糧的蔚藍(lán)木聚糖酶，可顯著降低液化醪和發(fā)酵醪黏度，蒸餾殘液濾速（以5 min內(nèi)過濾速率計(jì)）由4.8 mL/min提高至7.8 mL/min，清液干物由8.2%降低至5.7%，從而有效的減輕后期污水處理壓力。這為更多元谷物的生產(chǎn)優(yōu)化提供一定的指導(dǎo)思路。