啤酒中鄰苯二甲酸酯檢測(cè)方法優(yōu)化及遷移量研究

呂慧威，耿 迪，解 慧，郭 燦，蔡 勇，楊 剛*

（1.吉林師范大學(xué) 博達(dá)學(xué)院 食品科學(xué)與工程學(xué)院，吉林 四平 136000；2.四平金士百純生啤酒有限公司，吉林 四平 136001；3.長(zhǎng)春職業(yè)技術(shù)學(xué)院 食品生物技術(shù)分院，吉林 長(zhǎng)春 130033）

啤酒包裝的瓶蓋內(nèi)墊具有密封的作用，在加工過(guò)程中需要加入一定量增塑物質(zhì)來(lái)改善材料的低溫性能，提高其柔軟度[1]，其基材多采用聚氯乙烯（polyvinyl chloride，PVC）[2]、聚乙烯（polyethylene，PE）[3]等材料。鄰苯二甲酸酯類(lèi)是全球塑料生產(chǎn)中最常用的增塑劑，尤其是聚氯乙烯塑料（PVC）的塑化劑和軟化劑[4]，其用量占世界全年增塑劑消耗量的90%[5-6]。國(guó)內(nèi)超過(guò)60%的PVC瓶蓋內(nèi)墊含有鄰苯二甲酸酯（phthalate esters，PAEs）類(lèi)增塑劑，在瓶蓋內(nèi)墊中PAEs的用量可達(dá)到50%左右，其中大部分是鄰苯二甲酸二（2-乙基）己酯（di（2-ethyl）hexyl phthalate，DEHP）[7]。目前，國(guó)內(nèi)外對(duì)啤酒包裝瓶蓋內(nèi)墊潛在的安全性問(wèn)題越來(lái)越關(guān)注[8-9]。隨著居民收入和消費(fèi)水平的提高，我國(guó)啤酒消費(fèi)量日益增長(zhǎng)，因而，對(duì)啤酒中PAEs的檢測(cè)尤為重要[10]。

鄰苯二甲酸酯類(lèi)增塑劑有一定毒性、呈無(wú)色無(wú)味液體，不允許作為添加劑或加工助劑添加到食物中[12]，其中DEHP的危害較大，是一種環(huán)境激素，其毒性比三聚氰胺高20倍，對(duì)人體的生殖系統(tǒng)和生育能力有影響，干擾內(nèi)分泌，是導(dǎo)致人類(lèi)生育能力降低的罪魁禍?zhǔn)譡13-14]。長(zhǎng)期大量攝取還會(huì)導(dǎo)致乳腺癌和肝癌，微量塑化劑在24～48 h可以排出體外[15]。很多國(guó)家對(duì)食品及其包裝材料PAEs的使用和限量都有明確要求，日本、希臘、挪威等國(guó)要求禁止將PAEs用在聚氯乙烯等食品包裝材料中；歐盟新《食品接觸塑料材料和制品法規(guī)》中規(guī)定在用作與非脂肪類(lèi)食品接觸的重復(fù)使用材料和制品中鄰苯二甲酸二丁酯（dibutyl phthalate，DBP）含量不能超過(guò)0.05%，DEHP、鄰苯二甲酸二異壬酯（diisononyl phthalate，DINP）、鄰苯二甲酸二異癸酯（didecyl phthalate，DIDP）和鄰苯二甲酸苯基丁酯（butyl benzyl phthalate，BBP）含量不能超過(guò)0.1%，鄰苯二甲酸二烯丙酯（diallyl phthalate，DAP）不得檢出[16]；美國(guó)環(huán)境保護(hù)署（US Environmental Protection Agency，EPA）規(guī)定飲用水中DEHP的限量為6 μg/L[17-18]，我國(guó)生活飲用水衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)對(duì)DEHP的限量規(guī)定為8 μg/L[19]。

PAEs廣泛存在于環(huán)境中，但因其含量極低，通常為mg/kg，因此對(duì)樣品檢測(cè)的前處理、儀器設(shè)備及人員的操作等要求都非常嚴(yán)格。近年來(lái)，各國(guó)紛紛頒布出鄰苯二甲酸酯類(lèi)物質(zhì)的分析檢測(cè)方法標(biāo)準(zhǔn)，如歐盟EN14372—2004《兒童喂養(yǎng)餐具的安全要求及測(cè)試》、歐盟BSEN 15777—2009《紡織品鄰苯二甲酸酯的測(cè)定方法》、美國(guó)消費(fèi)品安全委員會(huì)（Consumer Product Safety Commission，CPSC）-CH-C1001-09.3《兒童玩具和護(hù)理品中鄰苯二甲酸酯的測(cè)試方法》、美國(guó)CPSC-CH-C1001-09.3ASTMD 3421-75《鄰苯二甲酸酯測(cè)定方法標(biāo)準(zhǔn)》[20]，我國(guó)2016年發(fā)布了GB 5009.271—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中鄰苯二甲酸酯的測(cè)定》[21-22]。針對(duì)啤酒樣品，目前我國(guó)還沒(méi)有專(zhuān)門(mén)針對(duì)其中PAEs的檢測(cè)方法標(biāo)準(zhǔn)，檢測(cè)只能參照食品中PAEs的檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)，但在GB 5009.271—2016 中只對(duì)食品大類(lèi)的PAEs檢測(cè)方法做出了要求，沒(méi)有對(duì)細(xì)分種類(lèi)的檢出限做出區(qū)分，方法中標(biāo)出檢出限D(zhuǎn)LDINP=9.0 mg/kg，DLDBP=0.3 mg/kg，其他16種目標(biāo)化合物定量限均為0.5 mg/kg，而對(duì)含量較低該檢出限的食品，該方法并不適用。如DBP和DEHP是我國(guó)地表水環(huán)境質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的檢測(cè)項(xiàng)目，檢出限（detection limit，DL）為DLDBP=0.1 μg/L，DLDEHP=0.4 μg/L[23]；劉靖靖等[20]對(duì)啤酒的PAEs檢測(cè)結(jié)果顯示，市售的30種啤酒樣品PAEs 含量在0.77～16.67 μg/L 范圍內(nèi)，均低于GB 5009.271—2016中的檢出限。因此，針對(duì)啤酒樣品，建立靈敏、精準(zhǔn)、高效的樣品前處理方法及分析檢測(cè)方法對(duì)啤酒的質(zhì)量安全控制是極其重要的。

本研究建立了頂空固相微萃取-氣質(zhì)聯(lián)用法（headspace solid-phase microextraction-gas chromatography-mass spectrometry HS-SPME-GC-MS）分析啤酒中塑化劑鄰苯二甲酸酯的測(cè)定方法，采用單點(diǎn)標(biāo)準(zhǔn)加入法測(cè)定了6種市售啤酒以及在3種遷移試驗(yàn)條件下瓶蓋內(nèi)墊片在啤酒和模擬物中PAEs的遷移量，為啤酒行業(yè)評(píng)估PVC和PE瓶蓋內(nèi)墊片問(wèn)題奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

16種PAEs混標(biāo)具體名稱(chēng)見(jiàn)表1。

表1 鄰苯二甲酸酯類(lèi)目標(biāo)化合物名稱(chēng)Table1 Name of phthalate esters target compound

混標(biāo)各組分質(zhì)量濃度為1 000 mg/L（正己烷溶劑）：廣州太瑋生物公司；正己烷、甲醇（junwei1色譜級(jí)）：百靈威科技有限公司；啤酒樣品：超市采購(gòu)；啤酒瓶蓋內(nèi)墊：某包裝企業(yè)提供；高純氦氣（純度≥99.99%）、高純氮?dú)猓兌取?9.95%）、高純二氧化碳（純度≥99.5%）：四平健新氣體有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Clarus600氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（配有自動(dòng)進(jìn)樣器、電子電離源）：美國(guó)珀金埃爾默儀器有限公司；DB-5MS毛細(xì)管色譜柱（30 m×0.32 mm×0.25 μm）：美國(guó)Agilent公司；50 μm DVB/CAR/PDMS萃取頭的固相微萃取裝置（solid phase micro extraction process，SPME）：美國(guó)Supelco公司；UGC-12MF氮吹儀：北京優(yōu)晟聯(lián)合科技有限公司；2101TH超聲波清洗器：上海安譜科學(xué)儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

PAEs混標(biāo)儲(chǔ)備液：將PAEs標(biāo)樣用正己烷定容至10 mL，配制成質(zhì)量濃度為100 mg/L的儲(chǔ)備液，于4 ℃冰箱保存。

PAEs混標(biāo)使用液：取16種PAEs混標(biāo)儲(chǔ)備液1mL于10 mL容量瓶中，用氮吹儀吹干，加甲醇復(fù)溶，定容至10 mL，質(zhì)量濃度為10 mg/L，于4 ℃冰箱保存待用。

1.3.2 啤酒中鄰苯二甲酸酯類(lèi)化合物的檢測(cè)[20，24]

采用頂空固相微萃取-氣質(zhì)聯(lián)用（HS-SPME-GC-MS）法測(cè)定。

GC條件色譜柱：DB-5MS石英毛細(xì)管柱（30m×0.32 mm×0.25 μm）。程序升溫：初溫為60 ℃，保持1 min，以20 ℃/min升至220 ℃，保持1 min，再以5 ℃/min升至280 ℃，保持4 min。進(jìn)樣口溫度：250 ℃；不分流模式：進(jìn)樣0.75 min前不分流，之后流速為10.0 mL/min；恒流模式：流量為1.0 mL/min；載氣為氦氣（He）（純度≥99.999%）；流速1 mL/min。

MS條件：電離方式采用電子電離（electctron ionization，EI）源；電子能量70eV；離子源溫度230℃；傳輸線(xiàn)溫度280℃；測(cè)定模式為選擇離子監(jiān)測(cè)（selected ion monitoring，SIM），溶劑延遲7 min；全掃描質(zhì)核比范圍為29～350 amu。

1.3.3 樣品處理[25]

啤酒瓶蓋墊片：將墊片破碎至最大顆粒不超過(guò)0.02 g，準(zhǔn)確稱(chēng)取0.2 g試樣（精確至0.1 mg）于100 mL具塞三角瓶中，加入20 mL正己烷，超聲提取30 min，單層濾紙過(guò)濾，再用正己烷重復(fù)上述操作3次，每次10 mL，合并提取液用正己烷定容至50 mL，進(jìn)行GC-MS分析，同時(shí)做試劑空白試驗(yàn)。

啤酒樣品：啤酒樣品超聲20 min除氣，取10 mL注入20 mL頂空瓶中，加蓋密封。將SPME手柄插入頂空瓶中，推出萃取頭水浴保溫一段時(shí)間后進(jìn)行GC-MS分析，解吸時(shí)間為5 min。

2 結(jié)果與分析

2.1 PAEs組分的定性和定量分析

2.1.1 PAEs組分的總離子流圖

16種PAEs混標(biāo)直接進(jìn)樣后獲得的總離子流色譜圖見(jiàn)圖1。由圖1可以看出，各組分的峰形基本對(duì)稱(chēng)，分離效果較好。

圖1 16種鄰苯二甲酸酯混標(biāo)總離子流色譜圖Fig.1 Total ion chromatogram of 16 plasticizer phthalate acid esters mixed standard

2.1.2 PAEs組分信息匯總

采用頂空固相微萃取法萃取樣品，定性方法采用選擇離子掃描，定量時(shí)采用積于多離子比例定量，每個(gè)化合物選擇1個(gè)定量離子，3個(gè)定性離子，這樣定性、定量更為準(zhǔn)確。通過(guò)對(duì)16種鄰苯二甲酸酯（PAEs）組分的定性分析，得到其信息匯總見(jiàn)表2。

表2 16種鄰苯二甲酸酯信息匯總Table2 Information aggregation of 16 phthalate acid esters

2.2 萃取條件的優(yōu)化

對(duì)于頂空固相微萃取法，萃取效果影響較大的因素是溫度和時(shí)間，萃取溫度和時(shí)間對(duì)鄰苯二甲酸酯類(lèi)化合物（DIBP、DBP、DEHP）的影響結(jié)果見(jiàn)圖2。

由圖2可知，DIBP、DBP和DEHP三種物質(zhì)的含量隨萃取時(shí)間的延長(zhǎng)，整體都呈上升趨勢(shì)，55 ℃水浴保溫60 min和65 ℃水浴保溫60 min萃取效果相差不大，說(shuō)明達(dá)到一定溫度和時(shí)間時(shí)，萃取頭吸附已接近飽和而對(duì)于萃取頭來(lái)說(shuō)，長(zhǎng)時(shí)間高溫萃取容易造成萃取頭老化加速甚至脫落，而且55 ℃條件較65 ℃條件更有利于檢測(cè)結(jié)果的穩(wěn)定，重現(xiàn)性較好。綜合因素考慮，選取55 ℃水浴保溫60 min條件進(jìn)行萃取效果最好。

圖2 萃取時(shí)間及溫度對(duì)鄰苯二甲酸酯類(lèi)化合物組分（DIBP、DBP、DEHP）含量的影響Fig.2 Effect of extraction time and temperature on phthalate acid esters components (DIBP、DBP、DEHP) contents

2.3 啤酒瓶蓋內(nèi)墊片中PAEs的定量分析

對(duì)于啤酒中痕量PAEs的來(lái)源，很少有相關(guān)的報(bào)道，有人推斷啤酒瓶蓋的PVC內(nèi)墊片可能對(duì)其有影響。為了驗(yàn)證瓶蓋內(nèi)墊對(duì)啤酒酒液中PAEs的影響，對(duì)本地某啤酒企業(yè)目前所使用的啤酒瓶蓋A廠(chǎng)PVC內(nèi)墊片的23個(gè)樣品、B廠(chǎng)PE內(nèi)墊片的26個(gè)樣品和C廠(chǎng)PE內(nèi)墊片的21個(gè)樣品進(jìn)行了測(cè)定，其中共檢出DIBP、DBP和DEHP三種PAEs，其結(jié)果平均值見(jiàn)表3。

表3 不同廠(chǎng)家不同材質(zhì)的瓶蓋內(nèi)墊片中鄰苯二甲酸酯類(lèi)化合物組分含量Table3 Contents of phthalate acid esters components in bottle cap gaskets made of different materials from different manufacturers

由表3可知，PVC和PE內(nèi)墊片差異很大，PVC內(nèi)墊片的DEHP含量很高，達(dá)到179 214 mg/kg，而PE內(nèi)墊片僅為6.25 mg/kg，兩者相差3萬(wàn)倍左右，作為與啤酒直接接觸的材料，PVC內(nèi)墊片是存在一定風(fēng)險(xiǎn)的。在2014年中國(guó)酒業(yè)協(xié)會(huì)啤酒分會(huì)年會(huì)上，就啤酒及啤酒瓶蓋內(nèi)墊塑化劑問(wèn)題展開(kāi)過(guò)專(zhuān)題討論，協(xié)會(huì)責(zé)成各大啤酒龍頭企業(yè)牽頭，將PVC內(nèi)墊逐步替換為PE內(nèi)墊，現(xiàn)大部分企業(yè)已經(jīng)開(kāi)始、正在進(jìn)行更換，甚至已經(jīng)更換完畢，但仍有部分企業(yè)更換進(jìn)展很慢，存在一定的安全隱患。

2.4 啤酒中PAEs的定量分析

采用單點(diǎn)標(biāo)準(zhǔn)加入法做定量分析，計(jì)算啤酒中PAEs的含量。通過(guò)前期對(duì)大量啤酒樣品的檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，所選樣品范圍內(nèi)僅能檢出DIBP、DBP和DEHP三種物質(zhì)，其余13種均為未檢出，在此，僅對(duì)這三種物質(zhì)進(jìn)行分析。采用此方法測(cè)定了6種市售啤酒，啤酒中所含的3種PAEs組分含量見(jiàn)表3，結(jié)果為三個(gè)平行樣品的平均值。

由表4可知，啤酒中也含有痕量的PAEs，其含量均為μg/L級(jí)，DBP含量稍高，在1.41～8.45 μg/L之間，而DIBP在0.79～3.62 μg/L之間，DEHP在≤7.88 μg/L。我國(guó)對(duì)于食品中的PAEs限量尚無(wú)要求，如果比照我國(guó)生活飲用水衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)對(duì)DEHP的限量為8 μg/L[18]的規(guī)定，啤酒樣品并未超標(biāo)，但檢測(cè)結(jié)果已經(jīng)接近飲用水的限量值，應(yīng)該采取更新包裝材料等手段進(jìn)行干預(yù)，避免其含量過(guò)高，也期待啤酒的相應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)盡快出臺(tái)。

表4 啤酒中3種鄰苯二甲酸酯類(lèi)化合物組分（DIBP、DBP、DEHP）的含量Table4 Contents of 3 phthalate acid esters components (DIBP、DBP、DEHP) in beer

2.5 遷移量試驗(yàn)

為研究啤酒瓶蓋內(nèi)墊片在啤酒中遷移量的問(wèn)題，根據(jù)GB/T 23296.1—2009《食品接觸材料塑料中物質(zhì)向食品及食品模擬物特定遷移試驗(yàn)和含量測(cè)定方法以及食品模擬物暴露條件選擇的指南》中對(duì)遷移試驗(yàn)條件的相關(guān)規(guī)定以及啤酒實(shí)際儲(chǔ)存的條件[26]，選取了3種遷移試驗(yàn)條件，即70 ℃保溫1 h、20 ℃儲(chǔ)存10 d、40 ℃儲(chǔ)存10 d，通常被認(rèn)為更嚴(yán)厲的試驗(yàn)條件為40 ℃儲(chǔ)存10 d[27]，啤酒和模擬物樣品應(yīng)橫放在培養(yǎng)箱中儲(chǔ)存。

2.5.1 溫度及時(shí)間對(duì)PVC內(nèi)墊片在啤酒中PAEs遷移量的影響

測(cè)定啤酒本底的含量以及在3種遷移試驗(yàn)條件下的遷移量，結(jié)果見(jiàn)圖3。

圖3 溫度及時(shí)間對(duì)PVC內(nèi)墊片在啤酒中鄰苯二甲酸酯類(lèi)化合物組分（DIBP、DBP、DEHP）遷移量的影響Fig.3 Effect of temperature and time on phthalate acid esters components (DIBP、DBP、DEHP) migration of PVC inner gasket in beer

由圖3可知，在70 ℃保溫1 h、20 ℃儲(chǔ)存10 d、40 ℃儲(chǔ)存10 d的條件下，PVC內(nèi)墊片在啤酒中DIBP的含量是啤酒本底的1.3～2.0倍，DBP是2.0～5.9倍，DEHP是1.7～8.3倍，DEHP的含量增加尤為顯著。因此，從整體的遷移量角度出發(fā)，發(fā)現(xiàn)：在40 ℃、儲(chǔ)存10 d的條件下，DBP的含量最高為9.48 μg/L，DIBP的含量最高為1.88 μg/L，DEHP的含量最高為1.89 μg/L。通過(guò)上述得出PVC內(nèi)墊片中的DBP在較高的溫度且較長(zhǎng)的儲(chǔ)存條件下，DBP較其他兩者更易遷移至啤酒中。

2.5.2 溫度及時(shí)間對(duì)PE內(nèi)墊片在啤酒中PAEs遷移量的影響

測(cè)定啤酒本底的含量以及在3種遷移試驗(yàn)條件下的遷移量，結(jié)果見(jiàn)圖4。

圖4 溫度及時(shí)間對(duì)PE瓶蓋內(nèi)墊片在啤酒中鄰苯二甲酸酯類(lèi)化合物組分（DIBP、DBP、DEHP）遷移量的影響Fig.4 Effect of temperature and time on phthalate acid esters components (DIBP、DBP、DEHP) migration of PE bottle cap inner gasket in beer

由圖4可知，在70 ℃保溫1 h、20 ℃儲(chǔ)存10 d、40 ℃儲(chǔ)存10 d的條件下，PE內(nèi)墊片在啤酒中DIBP的含量是啤酒本底的1.3～1.9倍，DBP是1.4～3.0倍，DEHP是3.2～4.0倍。因此，從整體遷移量來(lái)看，在40 ℃、儲(chǔ)存10 d的條件下DBP含量最高為8.26 μg/L，DIBP含量最高為1.73 μg/L，DEHP含量最高為1.46 μg/L，結(jié)合2.5.1結(jié)論可知：PE內(nèi)墊片中的DBP較其它兩者更易遷移至啤酒中，而且PVC內(nèi)墊片中的三者的含量均要高于PE內(nèi)墊片中的三者含量。

2.5.3 溫度及時(shí)間對(duì)PVC內(nèi)墊片在模擬物中PAEs遷移量的影響

測(cè)定模擬物本底的含量以及在3種遷移試驗(yàn)條件下的遷移量，結(jié)果見(jiàn)圖5。

圖5 溫度及時(shí)間對(duì)PVC內(nèi)墊片在模擬物中鄰苯二甲酸酯類(lèi)化合物組分（DIBP、DBP、DEHP）組分遷移量的影響Fig.5 Effect of temperature and time on phthalate acid esters components (DIBP、DBP、DEHP) migration of PVC inner gaskets in simulators

由圖5可知，在70 ℃保溫1 h、20 ℃儲(chǔ)存10 d、40 ℃儲(chǔ)存10 d的條件下，PE瓶蓋內(nèi)墊片在啤酒中DIBP的含量是啤酒本底的1.2～1.7倍，DBP是1.6～3.7倍，DEHP是0.3～7.6倍，DEHP的含量增加也是顯著的。因此，從整體遷移量的角度出發(fā)，在40 ℃，儲(chǔ)存10 d的條件下，PVC內(nèi)墊片中的DEHP在模擬物（10%含量的乙醇溶液）中的含量最高為7.55 μg/L，DBP的含量為3.04 μg/L，DIBP的含量為1.16 μg/L，說(shuō)明在較高的溫度且較長(zhǎng)的儲(chǔ)存時(shí)間下，DEHP更易溶于較高含量的乙醇溶液，而DEHP在酒精含量相對(duì)較低的啤酒中的遷移量最少。

總結(jié)圖3～圖5的結(jié)果，溫度及時(shí)間是啤酒中PAEs增加的重要因素，而且通過(guò)試驗(yàn)結(jié)果可知啤酒在正常條件下儲(chǔ)存，其中的DIBP、DBP與DEHP的含量是不會(huì)達(dá)到上述試驗(yàn)中的遷移量。在夏季時(shí)，啤酒放在冰箱里冷藏飲用、在運(yùn)輸過(guò)程中超過(guò)30 ℃，這些都是常有的現(xiàn)象，因此應(yīng)嚴(yán)格禁止將啤酒橫放、倒放或高溫儲(chǔ)存，避免酒液接觸內(nèi)墊片。

3 結(jié)論

本試驗(yàn)研究?jī)?yōu)化了采用頂空固相微萃取-氣質(zhì)聯(lián)用法測(cè)定啤酒中鄰苯二甲酸酯的方法，該方法操作簡(jiǎn)單，靈敏度較高，試驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果表明，啤酒中所含3種PAEs組分，即DIBP、DBP、DEHP，而且含量較低。PVC內(nèi)墊片中DBP的含量高達(dá)9.48 μg/L，PE內(nèi)墊片為8.26 μg/L。在遷移試驗(yàn)中，PVC、PE內(nèi)墊片中DEHP在啤酒中的遷移量有所提高，但在PVC內(nèi)墊片中DEHP在模擬物中即10%含量的乙醇溶液中的遷移量更為顯著。溫度及時(shí)間是啤酒中PAEs增加的一個(gè)重要因素，應(yīng)嚴(yán)格禁止將啤酒橫放、倒放或高溫儲(chǔ)存，避免酒液接觸內(nèi)墊片。