不同釀酒酵母對(duì)白蘭地香氣的影響研究

劉曉露，李記明，阮仕立，王根杰，張葆春，畢蕓杰，姚圣圣，張舒凡，馮 磊，趙玉平*

（1.煙臺(tái)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，山東 煙臺(tái) 264003；2.煙臺(tái)張?jiān)＜瘓F(tuán)有限公司 山東省葡萄酒微生物發(fā)酵技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 煙臺(tái) 264001）

白蘭地通常是以葡萄為原料，經(jīng)過發(fā)酵、蒸餾、貯藏以及陳釀而成[1-2]。其香氣成分非常復(fù)雜，其來(lái)源主要來(lái)源于以下三個(gè)方面[3-5]：品種、發(fā)酵過程及陳釀過程。香氣是衡量白蘭地感官品質(zhì)的重要組成部分。香氣成分的種類及其含量是評(píng)價(jià)白蘭地品質(zhì)高低的一個(gè)重要指標(biāo)[6]。不同品種釀制的白蘭地香氣成分千差萬(wàn)別，相同品種釀制而成的白蘭地香氣成分也會(huì)受到釀酒原料、栽培條件、發(fā)酵工藝、蒸餾工藝以及橡木桶陳釀等多種因素的影響[7]。目前，關(guān)于白蘭地香氣成分的研究較多[8-10]。如程顯好等[11]研究不同酵母菌對(duì)白蘭地?fù)]發(fā)性成分的影響，通過測(cè)定葡萄汁發(fā)酵前后以及葡萄酒蒸餾前后成分的差異，檢測(cè)到35種揮發(fā)性成分，發(fā)現(xiàn)不同酵母會(huì)影響白蘭地的揮發(fā)性成分。姜忠軍[12]研究不同的釀酒品種及釀酒酵母對(duì)發(fā)酵過程中的有機(jī)酸、pH、香氣成分的影響，發(fā)現(xiàn)不同酵母對(duì)白蘭地香氣和感官有不同的影響。白玉霓作為釀造白蘭地的優(yōu)良葡萄品種，在煙臺(tái)地區(qū)大面積種植。本研究采用頂空固相微萃取-氣質(zhì)聯(lián)用（headspace solid phase microextraction-gas chromatographymass spectrometry,HS-SPME/GC-MS）對(duì)3種不同釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）的白玉霓白蘭地?fù)]發(fā)性成分進(jìn)行分析，比較3種不同釀酒對(duì)白蘭地?fù)]發(fā)性成分的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

白玉霓葡萄、釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）D254、QA23、FC9：煙臺(tái)張?jiān)＜瘓F(tuán)有限公司。

NaCl（分析純）：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；3-辛醇（分析純）：美國(guó)Sigma公司。

1.2 儀器與設(shè)備

QP2010SE氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（GC-MS）儀：日本島津公司；DB-Wax型色譜柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm）：美國(guó)Agilent公司；57328-U萃取頭（50/30 μm DVB/CAR/PSMS）：美國(guó)Supelco公司；固相微萃?。╯olid phase micro-extraction，SPME）手動(dòng)進(jìn)樣手柄：美國(guó)Supelco公司；DF-101SZ恒溫加熱磁力攪拌器：鞏義市科瑞儀器有限公司；XLD夏朗德蒸餾器：山東盛泉泵業(yè)有限公司。

1.3 方法

1.3.1 白蘭地的制備

葡萄原料的處理：對(duì)白玉霓葡萄進(jìn)行除梗、破碎、壓榨，取葡萄汁（糖度為138 g/L）分別放入3個(gè)20 L的玻璃罐中。葡萄處理過程中添加適量干冰降溫以減少氧化，且不添加SO2。

酵母活化：將一定量酵母放入燒杯中，加入10倍酵母質(zhì)量的37 ℃去離子水，放入37 ℃的恒溫水浴鍋中活化15 min，在逐步加入少量的葡萄汁，酵母活化液降至溫度與葡萄汁溫差在10 ℃以內(nèi)。酵母接種量為0.2 g/L。

原酒發(fā)酵：18～20 ℃控溫發(fā)酵，發(fā)酵過程中每隔12 h監(jiān)測(cè)發(fā)酵液的溫度和比重。待發(fā)酵液的比重＜0.995、殘?zhí)恰? g/L，發(fā)酵結(jié)束。進(jìn)行澄清倒罐，得到原汁白蘭地原酒。

蒸餾：采用夏朗德壺式蒸餾鍋進(jìn)行二次蒸餾。第一次蒸餾待餾出液酒精度降至1%vol以下時(shí)，得到粗餾白蘭地，蒸餾酒精度大約28%vol～30%vol左右。將粗餾原白蘭地進(jìn)行二次蒸餾，去酒頭（約占酒精總含量的1%），待餾出液酒精度降至55%vol以下時(shí)停止蒸餾，獲得的酒身即為原白蘭地，酒精度68%vol～70%vol左右。

1.3.2 HS-SPME/GC-MS分析

HS-SPME進(jìn)行預(yù)處理：取待測(cè)樣品，用蒸餾水或乙醇將樣品乙醇含量稀釋至10%vol。準(zhǔn)確量取5 mL 10%vol的白蘭地樣品稀釋液于20 mL萃取瓶中，加入2.0 g NaCl，再加入3-辛醇（質(zhì)量濃度為0.818 g/mL）作為內(nèi)標(biāo)物。將待測(cè)樣品瓶放入帶有磁力攪拌的50 ℃恒溫水浴鍋中，調(diào)整轉(zhuǎn)速為500 r/min，預(yù)平衡10 min，將萃取頭插入萃取瓶中，萃取30 min。萃取結(jié)束后，并迅速插入氣相色譜的進(jìn)樣口中，解吸5 min。

GC條件：進(jìn)樣器溫度250 ℃，色譜柱為DB-Wax型色譜柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm）；檢測(cè)器溫度為220 ℃，載氣為高純氦氣（He），流速為2 mL/min。分流進(jìn)樣，分流比為1∶5。程序升溫條件：初始溫度40 ℃，保持2 min，6 ℃/min升溫至100 ℃，5 ℃/min升溫至200 ℃，保持10 min，溶劑不延遲。

MS條件：采用電子電離（electronic ionization，EI）源，電子能量70 eV，離子源溫度200 ℃，接口溫度240 ℃，掃描方式為全掃描，掃描范圍為30.00～500.00 amu。

定性分析：將GC-MS檢測(cè)的未知化合物的圖譜與美國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)與技術(shù)研究院（national insititute of standards and technology，NIST）譜庫(kù)II并結(jié)合文獻(xiàn)報(bào)道的保留指數(shù)（retention index，RI）進(jìn)行比對(duì)定性。

定量分析：采用3-辛醇作為內(nèi)標(biāo)，進(jìn)行半定量法分析。按照如下公式計(jì)算各組分含量：

1.3.3 統(tǒng)計(jì)分析

采用Microsoft Office Excel 2010和SPSS25.0軟件單因素方差分析（analysis of variance，ANOVA）對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理和分析。利用Origin 8.5軟件進(jìn)行主成分分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同酵母白蘭地?fù)]發(fā)性成分分析

采用酵母D254、QA23、FC9發(fā)酵、蒸餾得到的白蘭地樣品依次編號(hào)為D、Q、F。利用GC-MS測(cè)定3種白蘭地的揮發(fā)性成分，結(jié)果見表1。

表1 不同酵母釀造白蘭地中揮發(fā)性成分GC-MS分析結(jié)果Table1 Results of volatile components in Brandy brewed by different yeasts analysis by GC-MS

續(xù)表

由表1可知，總共檢測(cè)到69種主要成分，其中酯類29種、醇類13種、萜烯類8種、縮醛類7種、醛酮類5種、芳香類4種、有機(jī)酸類2種以及其他類1種。酯類和醇類物質(zhì)是揮發(fā)性成分中主要的物質(zhì)，占總揮發(fā)性化合物總量的60%以上。

酯類物質(zhì)是白蘭地?fù)]發(fā)性成分種含量最豐富的物質(zhì)，是由酸類物質(zhì)和醇類物質(zhì)在蒸餾過程中通過一系列的酯化反應(yīng)生成的[13]。D白蘭地中檢測(cè)到16種酯類物質(zhì)，總酯總量為804.58 mg/L；Q白蘭地中檢測(cè)到26種酯類物質(zhì)，總酯含量為2 751.00 mg/L；F白蘭地中檢測(cè)到26種酯類物質(zhì)，總酯含量為2 614.44 mg/L。3種白蘭地中含量最多的酯類分別為壬酸乙酯、月桂酸乙酯、辛酸乙酯、9-癸烯酸乙酯、己酸乙酯，同時(shí)這5種物質(zhì)也是白蘭地中骨架香氣中比較重要的幾種酯類物質(zhì)。除辛酸乙酯，其余4種酯類物質(zhì)含量，D與Q、F白蘭地有顯著差異性（P＜0.05）。乙酸異丁酯、辛酸丙酯、丁酸乙酯這3種酯類物質(zhì)含量在Q和F白蘭地中比較豐富，但在D白蘭地中未檢測(cè)到。壬酸乙酯是3種白蘭地中含量最高的酯類物質(zhì)，也是白蘭地的骨架香氣之一[9]。壬酸乙酯具有水果味，芳香帶甜，有脂肪臭[14]。

醇類一般是葡萄原料在發(fā)酵的過程中，通過酵母的發(fā)酵代謝使發(fā)酵汁中的糖轉(zhuǎn)化為醇，然后通過蒸餾過程，進(jìn)入到原白蘭地中。D、Q、F白蘭地均檢測(cè)到10種醇類物質(zhì)，總醇含量依次為472.4 mg/L、791.50 mg/L、718.99 mg/L。在3種白蘭地中，共有7種醇類物質(zhì)：1-丙醇、2-甲基丙醇、1-丁醇、4-甲基-1戊醇、3-甲基-1-戊醇、正己醇、正辛醇。在共有7種醇類物質(zhì)中，去除1-丁醇、4-甲基-1戊醇和3-甲基-1-戊醇這3種醇類物質(zhì)，其余4種醇類在不同的白蘭地中均有顯著性差異（P＜0.05）。這7種醇類物質(zhì)，是白蘭地香氣組成中非常重要的幾類化合物，也是構(gòu)成白蘭地骨架香氣的一部分[9-10，15]。對(duì)于單個(gè)化合物來(lái)說(shuō)，D白蘭地中醇類含量最多的物質(zhì)依次是：2-甲基丙醇（251.88 mg/L）、1-丙醇（143.14 mg/L）和正己醇（48.86 mg/L）。Q、F白蘭地中醇類物質(zhì)含量最多的化合物依次是：1-丙醇、2-甲基丙醇、2-甲基丁醇和正己醇。2-甲基丙醇在Q、F白蘭地中檢測(cè)到，并未在D白蘭地中檢測(cè)出來(lái)。

萜烯類物質(zhì)也是構(gòu)成白蘭地香氣的重要組成成分，主要來(lái)源于葡萄本身，通常以苷的形式存在，在發(fā)酵過程中被游離出來(lái)，然后蒸餾進(jìn)入白蘭地[16]。D白蘭地檢測(cè)到8種萜烯類物質(zhì)，萜烯類總含量為49.52 mg/L；Q和F白蘭地均檢測(cè)到4種萜烯類物質(zhì)，萜烯類總含量依次為是16.22 mg/L、14.77 mg/L，D白蘭地中萜烯類總含量是Q、F白蘭地中的3倍。大馬酮、紫羅蘭酮、TDN、1-萜品醇這4種萜烯類物質(zhì)是在3種白蘭地中可以檢測(cè)到。但D白蘭地中這4種萜烯類物質(zhì)含量與Q、F白蘭地有顯著性差異（P＜0.05）。紫羅蘭酮的含量在D白蘭地中最多（14.91 mg/L），占總萜烯類化合物總含量的30.11%。大馬酮在Q和F白蘭地中的含量是最多的，分別占總萜烯類化合物的60.29%、63.37%。大馬酮有蜂蜜的香味，對(duì)白蘭地的香氣有重要貢獻(xiàn)[9]，也有研究報(bào)道大馬酮對(duì)葡萄酒的香氣有重要影響[17]。乙酸松油脂、里那醇、（E）-橙花叔醇、香茅醇這4種萜烯類物質(zhì)僅在D白蘭地中檢測(cè)到，未在其余2種白蘭地中檢測(cè)到。1,1,6-三甲基-1,2-二氫萘在葡萄酒中呈現(xiàn)汽油的味道[18]，但在白蘭地中也有檢測(cè)到[9]，且是作為白蘭地骨架香氣成分之一。

白蘭地中的有機(jī)酸類物質(zhì)也是構(gòu)成白蘭地香氣的一部分，其主要來(lái)源于葡萄本身，經(jīng)過酵母的發(fā)酵過程，隨著蒸餾而進(jìn)入到原白蘭地中。

D、Q、F白蘭地中均檢測(cè)到2種有機(jī)酸類化合物—辛酸和癸酸，總酸含量依次為28.51mg/L、26.55mg/L、13.37mg/L。根據(jù)研究報(bào)道，辛酸和癸酸的產(chǎn)生主要來(lái)自于葡萄發(fā)酵過程中醛類物質(zhì)的氧化，其濃度主要取決于未發(fā)酵葡萄汁的初始發(fā)酵條件[19]。癸酸（21.52 mg/L）在D白蘭地中含量最多，占總酸含量的75.51%。在Q、F白蘭地中，酸類成分化合物含量最高是辛酸，各占64.91%、78.93%。癸酸在3種白蘭地中的含量差異性顯著（P＜0.05）。在本次實(shí)驗(yàn)中，3種白蘭地產(chǎn)生酸的含量比較低，對(duì)白蘭地香氣的影響可以忽略不計(jì)。

醛酮類物質(zhì)是構(gòu)成白蘭地整體香氣不可或缺的重要組成部分。D、Q、F白蘭地中均檢測(cè)到4種醛酮類物質(zhì)，總?cè)┩恳来螢? 521.12 mg/L、1 315.21 mg/L、1 257.3 mg/L。異丁醛、乙醛和庚醛是3種白蘭地共有醛酮類化合物，也是3種白蘭地醛酮類物質(zhì)含量最豐富的化合物。在D白蘭地中檢測(cè)出上述3種醛酮類化合物的含量與Q、F白蘭地中的含量有顯著性差異（P＜0.05）。辛醛在Q、F白蘭地中檢測(cè)到，并未在D白蘭地中檢測(cè)到。癸醛在D白蘭地檢測(cè)到，但并未在Q、F白蘭地中檢測(cè)出來(lái)。庚醛是在3種白蘭地中醛酮類化合物含量最高（含量依次為1 404.28 mg/L、1 203.72 mg/L、1 150.72 mg/L）。相關(guān)研究表明，白蘭地中的醛酮類化合物可能來(lái)源于葡萄原料，又有可能來(lái)源于釀造白蘭地的過程中。但這些醛酮類化合物對(duì)白蘭地的風(fēng)味有重要影響[20]。

D、Q、F白蘭地中均檢測(cè)出4種芳香類物質(zhì)，總芳香類含量依次為96.80 mg/L、45.47 mg/L、43.02 mg/L。這3種白蘭地中的芳香類物質(zhì)在種類上并未有差異性，主要表現(xiàn)在芳香類化合物含量的差異性。3種白蘭地中檢測(cè)到芳香類物質(zhì)：乙酸2-苯乙酯、苯甲醛、苯乙醇和3,4,4a,5,6,7-六氫-1,1,4a-三甲基-2（1H）-萘酮。在D白蘭地檢測(cè)出的4種芳香類化合物含量與Q、F白蘭地有顯著差異性（P＜0.05）。乙酸2-苯乙酯在3種白蘭地中的含量是最高的，其次是苯乙醇。2-乙酸苯乙酯和苯乙醇具有淡雅細(xì)膩的玫瑰花香[21-22]，有研究認(rèn)為2-乙酸苯乙酯對(duì)白蘭地呈現(xiàn)玫瑰花香起主導(dǎo)作用，也有研究認(rèn)為苯乙醇起主要的作用[23]。苯甲醛具有典型水果的香氣，也是白蘭地香氣非常重要的芳香類化合物[10]。

D、Q、F白蘭地均檢測(cè)出7種縮醛類化合物，總縮醛類含量依次為687.53 mg/L、799.26 mg/L、768.76 mg/L?？s醛類物質(zhì)與醛酮類物質(zhì)類似，既可能來(lái)源于葡萄本身，也可能在白蘭地的生產(chǎn)過程中產(chǎn)生，又有可能在陳釀的過程中由其他的物質(zhì)轉(zhuǎn)化而來(lái)，這些成分同樣對(duì)白蘭地的風(fēng)味有著不可代替的作用，是構(gòu)成白蘭地前香的重要組成部分[10]。從單個(gè)化合物上來(lái)說(shuō)，1,1-二乙氧基乙烷在3種白蘭地中的含量是最多的，分別占總縮醛類含量的59.38%、49.55%、49.58%。D、Q、F白蘭地均檢測(cè)到1種含硫化合物—二甲基硫。二甲基硫在D白蘭地中含量最高（33.86 mg/L），其次是在F白蘭地（25.41 mg/L），最后是Q白蘭地（10.59 mg/L），在3種白蘭地中具有顯著性差異（P＜0.05）。含硫化合物由于低閾值以及獨(dú)特的香氣特征，目前已有相關(guān)的研究報(bào)道。如糠硫醇是芝麻型白酒中具有芝麻香氣特征的關(guān)鍵成分[24-25]。

2.2 揮發(fā)性成分的主成分分析

對(duì)3種不同酵母釀制的白蘭地主要的揮發(fā)性成分進(jìn)行主成分分析，結(jié)果見圖1。由圖1可知，PC1和PC2對(duì)總方差的解釋率分別為72.1%和12.7%，前兩個(gè)主成分對(duì)初始數(shù)據(jù)總方差的解釋率為89.8%，可以體現(xiàn)不同釀酒酵母釀造的白蘭地香氣成分信息。

圖1 不同酵母釀造白蘭地樣品（A）及其揮發(fā)性成分（B）的主成分分析結(jié)果Fig.1 Principal component analysis results of brandy samples (A)brewed by different yeasts and volatile components (B)

3種不同酵母釀制的白蘭地樣品的主成分分析見圖1。由圖1A可知，由不同酵母釀制的白蘭地分布在不同的象限。D白蘭地樣品集中的分布在橫軸的負(fù)半軸，Q和F白蘭地樣品分散的分布在橫軸的正半軸。由此可見，以D254為酵母品種釀制的白蘭地可以與QA23、FC9型酵母白蘭地有明顯的差異。而QA23型酵母與FC9型酵母沒有明顯的差異性。

由圖1B可知，乙酸異丁酯、己酸乙酯、壬酸乙酯、9-癸烯酸乙酯、月桂酸乙酯、辛酸丙酯、異辛醇等這些化合物位于PC1的正半軸上，參考圖1A可知，這些化合物酵母QA23和FC9中的含量比較多。乙酸異戊酯、大馬酮、紫羅蘭酮、乙酸2-苯乙酯、苯乙醇、1-丙醇、2-甲基丁醇這些化合物位于PC1的負(fù)半軸，由圖1可知，這些化合物在酵母D254中的含量比較多。

3 結(jié)論

通過不同酵母發(fā)酵釀造得到3種不同的白蘭地，利用HS-SPME與GC-MS方法對(duì)白蘭地中的揮發(fā)性成分進(jìn)行了定性、定量的檢測(cè)，總共得到69種揮發(fā)性成分，包括酯類29種、萜烯類8種、縮醛類7種、醛酮類5種、芳香類4種、醇類13種、有機(jī)酸類2種以及其他類1種。酵母D254產(chǎn)生的萜烯類、醛酮類、有機(jī)酸類和芳香類含量較高。酵母D254在本次實(shí)驗(yàn)中產(chǎn)生的酸類物質(zhì)含量雖然是最多的，但其相對(duì)含量比較低，所以并不會(huì)給白蘭地帶來(lái)不愉快的氣味。酵母QA23產(chǎn)生的酯類、醇類和縮醛類含量較高，白蘭地香氣濃郁且復(fù)雜，并且壬酸乙酯的含量在酯類物質(zhì)中含量最高，具有芳香水果味，是構(gòu)成白蘭地骨架香氣的關(guān)鍵成分。酵母FC9產(chǎn)生各類揮發(fā)性化合物含量比較均衡。

對(duì)不同酵母品種（D254、QA23、FC9）釀制的白蘭地中揮發(fā)性成分進(jìn)行主成分分析，結(jié)果表明，選用D254型酵母與QA23、FC9型酵母有明顯的差異性。但對(duì)于QA23型與FC9型酵母，二者之間的差異性不明顯。

總的來(lái)說(shuō)，本次實(shí)驗(yàn)通過對(duì)3種不同酵母（D254、QA23、FC9）對(duì)白蘭地?fù)]發(fā)性香氣成分的研究，可以揭示出不同酵母的特點(diǎn)，根據(jù)其酵母的特點(diǎn)，釀造出高品質(zhì)的白蘭地。