枯草芽孢桿菌發(fā)酵麥糟制備蛋白肽培養(yǎng)基研究

肖連冬，李慧星，于海彥，羅建成，程 爽

（1.南陽(yáng)理工學(xué)院 生物與化學(xué)工程學(xué)院，河南 南陽(yáng) 473000；2.河南省工業(yè)微生物資源與發(fā)酵技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南 南陽(yáng) 473000）

麥糟是啤酒生產(chǎn)的主要副產(chǎn)物，含有豐富的非淀粉多糖和蛋白質(zhì)[1-5]，其中麥糟中的蛋白質(zhì)含量因大麥品種、麥芽制備及啤酒生產(chǎn)工藝等諸多因素的影響而不同，一般在12%～30%不等[6-7]，因此麥糟是一種良好的蛋白質(zhì)資源，適合作為開(kāi)發(fā)食品與保健品的原材料。我國(guó)是啤酒生產(chǎn)大國(guó)，2019年中國(guó)啤酒產(chǎn)量3.765×107kL[8]，以每千升啤酒產(chǎn)0.03 t干糟計(jì)，中國(guó)每年可產(chǎn)生約112.95萬(wàn)t啤酒糟[9]，如此數(shù)量的寶貴資源，如充分加以開(kāi)發(fā)利用，可以緩解我國(guó)蛋白質(zhì)資源不足的問(wèn)題。

麥糟蛋白肽是降解麥糟中蛋白質(zhì)制得低分子質(zhì)量、高活性的肽類[10]，其不僅具有優(yōu)良加工特性如溶解性、乳化性、起泡性、持水性等[11-12]，還具有抗疲勞、抗氧化、降血壓、降血糖、抗膽固醇和提高機(jī)體免疫力等生理活性[13-16]?？茖W(xué)研究證明，人體內(nèi)蛋白質(zhì)消化后大都以小肽的形式吸收，比氨基酸更容易被人體吸收利用，具有更高的生物活性和營(yíng)養(yǎng)價(jià)值[17]。因而，蛋白肽產(chǎn)品的生產(chǎn)已經(jīng)成為目前國(guó)際研究的熱門課題之一。目前，國(guó)內(nèi)外關(guān)于麥糟制備蛋白肽的研究尚不廣泛，多以酶法制備，水解程度低，成本比較高，采用枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）發(fā)酵麥糟制備蛋白肽未見(jiàn)報(bào)道。

本試驗(yàn)利用枯草芽孢桿菌固態(tài)發(fā)酵技術(shù)，通過(guò)生物轉(zhuǎn)化生產(chǎn)麥糟蛋白肽，以麥糟作為氮源探討發(fā)酵制備麥糟蛋白肽培養(yǎng)基條件。著重考察麥糟發(fā)酵培養(yǎng)基碳源種類、碳源添加量、培養(yǎng)基料液比、拌料水pH值及磷酸二氫鉀添加量對(duì)麥糟發(fā)酵生產(chǎn)蛋白肽的影響，優(yōu)化培養(yǎng)基條件，以期為工業(yè)化生產(chǎn)麥糟活性肽提供技術(shù)參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)菌種

枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）：河南省工業(yè)微生物資源與發(fā)酵技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供。

1.1.2 材料與試劑

麥糟：南陽(yáng)市京德啤酒技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司（干燥，粉碎過(guò)80目篩，粗蛋白含量18.35%）；耐高溫組培封口膜：常德比克曼生物科技有限公司；葡萄糖、蔗糖、氯化鈉（均為分析純）：天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；酒石酸鉀鈉（分析純）：天津市德恩化學(xué)試劑有限公司；硫酸銅、三氯乙酸、氫氧化鈉（均為分析純）：天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司；碘化鉀（純度＞99%）、牛肉膏、蛋白胨、瓊脂粉（均為生物試劑）：天津市永晟精細(xì)化工有限公司；牛血清白蛋白（色譜純）：北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；磷酸二氫鉀（分析純）：北京精求化工廠。

1.1.3 培養(yǎng)基

種子培養(yǎng)基：牛肉膏3 g/L，氯化鈉5.0 g/L，蛋白胨10 g/L，pH 7.2～7.4，121 ℃滅菌20 min。

發(fā)酵培養(yǎng)基：麥糟、碳源（淀粉/蔗糖/葡萄糖）、磷酸二氫鉀、水按一定比例配制。

1.2 儀器與設(shè)備

LDZW型立式壓力蒸汽滅菌鍋：上海申安醫(yī)療器械廠；SW-CJ-2G型雙人凈化工作臺(tái)：蘇州凈化設(shè)備有限公司；SPX-300-Ⅲ型生化培養(yǎng)箱：上海躍進(jìn)醫(yī)療器械有限公司；MQD-A3型高精度三層疊加式振蕩培養(yǎng)箱：上海旻泉儀器有限公司；UV1600-759型紫外可見(jiàn)光分光光度計(jì)：上海菁化科技器材有限公司；TDL·40C型低速臺(tái)式大容量離心機(jī)：上海安亭科學(xué)儀器廠；PHS-3C型pH計(jì)：上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司；DHG-9146A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱：上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；BSA124S型分析天平：賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 種子液制備

取1支活化菌種斜面，加入10 mL種子培養(yǎng)基，用接種環(huán)將斜面菌苔全部剝離洗下，搖勻；吸取2 mL接至已滅菌的20 mL種子培養(yǎng)基中，于36 ℃恒溫?fù)u床120 r/min條件下培養(yǎng)8 h，獲得種子液。

1.3.2 麥糟蛋白肽發(fā)酵試驗(yàn)

稱取麥糟樣品5.0 g置于250 mL三角瓶中，封口膜封口，包扎，121 ℃滅菌20 min；另取1支試管，根據(jù)麥糟與水的比加入所需的水量，然后加入一定比例的碳源及磷酸二氫鉀，溶解，調(diào)pH值，121 ℃滅菌20 min；待試管中溶液冷卻至室溫后，接入2 mL種子液，搖勻，制備成含菌拌料水，加入已滅菌的固體麥糟中，攪勻，置于恒溫培養(yǎng)箱中，37 ℃培養(yǎng)84 h。

1.3.3 發(fā)酵麥糟蛋白肽的萃取和測(cè)定

蛋白肽萃?。喝?00 mL蒸餾水加入發(fā)酵后的固態(tài)基質(zhì)中，于磁力攪拌器上攪拌30 min，4 000 r/min離心10 min，收集上清液并定容至100 mL。取上清液5 mL，加入5 mL 10%三氯乙酸，搖勻后常溫靜置30 min，4 000 r/min離心15 min，得上清液備用。

蛋白肽測(cè)定：采用雙縮脲法[18]。取上清液1 mL，加入4 mL雙縮脲試劑，搖勻后常溫靜置30 min，測(cè)OD540nm值，根據(jù)蛋白肽測(cè)定回歸方程，得出蛋白質(zhì)濃度，計(jì)算出總蛋白質(zhì)量，按公式（1）計(jì)算肽得率：

1.3.4 麥糟蛋白肽發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化單因素試驗(yàn)

以肽得率為考察指標(biāo)，在其他條件相同時(shí)，分別考察不同碳源（淀粉、蔗糖、葡萄糖）、碳源添加量（3%、4%、5%、6%、7%）、料液比（1∶1、1∶1.5、1∶2、1∶2.5、1∶3（g∶mL））、磷酸二氫鉀添加量（0.1%、0.3%、0.5%、0.7%、0.9%）和拌料水pH值（5、6、7、8、9）對(duì)發(fā)酵結(jié)果的影響。每個(gè)試驗(yàn)重復(fù)3次，結(jié)果取平均值。

1.3.5 麥糟蛋白肽發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化響應(yīng)面試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，設(shè)計(jì)Box-Behnken試驗(yàn)方案[19-20]進(jìn)一步研究葡萄糖添加量（A）、料液比（B）、磷酸二氫鉀添加量（C）對(duì)肽得率的影響，考察因素的交互作用及顯著性，優(yōu)化培養(yǎng)基配方。響應(yīng)面試驗(yàn)因素水平及編碼見(jiàn)表1。

表1 培養(yǎng)基優(yōu)化響應(yīng)面試驗(yàn)因素與水平Table1 Factors and levels of response surface experiments for medium optimization

2 結(jié)果與分析

2.1 蛋白肽測(cè)定回歸方程擬合

取不同體積的牛血清蛋白標(biāo)準(zhǔn)溶液，按照樣品測(cè)定方法顯色，于波長(zhǎng)540 nm下測(cè)定吸光度值，以蛋白質(zhì)含量（x）為自變量，以吸光度值（y）為因變量，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到回歸方程y=0.041x+0.001（R2=0.999）。

2.2 麥糟蛋白肽發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化單因素試驗(yàn)

2.2.1 碳源種類對(duì)肽得率的影響

碳源添加量5%，磷酸二氫鉀添加量0.5%，料液比1.0∶2.5（g∶mL），拌料水pH=7時(shí)，不同碳源對(duì)肽得率的影響見(jiàn)圖1。

圖1 碳源種類對(duì)肽得率的影響Fig.1 Effect of carbon sources on peptide yield

碳源為微生物生長(zhǎng)提供碳架和能源，而麥糟中殘留總糖很低[21]，需要外加碳源來(lái)補(bǔ)充培養(yǎng)基中碳源不足，保證枯草芽孢桿菌正常生長(zhǎng)代謝。由圖1可見(jiàn)，碳源種類對(duì)枯草芽孢桿菌發(fā)酵生產(chǎn)蛋白肽有明顯影響。三種碳源淀粉、蔗糖、葡萄糖中以葡萄糖作為碳源發(fā)酵效果最好，肽得率最高，蔗糖次之，淀粉因?yàn)檩^難利用對(duì)結(jié)果影響較小。通過(guò)對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)的方差分析表明，葡萄糖對(duì)肽得率的影響顯著，因此，試驗(yàn)確定在枯草芽孢桿菌發(fā)酵培養(yǎng)基中添加葡萄糖作為碳源。

2.2.2 葡萄糖添加量對(duì)肽得率的影響

當(dāng)磷酸二氫鉀添加0.5%，料液比1.0∶2.5（g∶mL），拌料水pH=7時(shí)，葡萄糖添加量對(duì)肽得率的影響見(jiàn)圖2。

圖2 不同葡萄糖添加量對(duì)肽得率的影響Fig.2 Effect of different glucose addition on peptide yield

葡萄糖是微生物生長(zhǎng)繁殖很重要的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，在蛋白肽的發(fā)酵生產(chǎn)過(guò)程中，需要大量的碳源來(lái)維持其微生物細(xì)胞生長(zhǎng)繁殖和產(chǎn)酶。由圖2可知，葡萄糖添加量對(duì)麥糟多肽發(fā)酵生產(chǎn)影響較大。當(dāng)葡萄糖濃度較低時(shí)，肽得率隨葡萄糖添加量的增加而提高，當(dāng)葡萄糖添加量為4%時(shí)，肽得率達(dá)到最高，隨著葡萄糖添加量的繼續(xù)增加肽得率逐漸下降。原因是過(guò)多的葡萄糖會(huì)加速菌體的呼吸作用，導(dǎo)致因溶氧不足而影響菌體的生長(zhǎng)和產(chǎn)酶[22]；如果葡萄糖含量繼續(xù)增加超過(guò)限定后會(huì)因?yàn)楦邼B透壓造成細(xì)胞失水，抑制微生物的生長(zhǎng)發(fā)酵，肽得率下降。試驗(yàn)得出較佳葡萄糖添加量為4%。

2.2.3 料液比對(duì)肽得率的影響

在葡萄糖添加量5%，磷酸二氫鉀添加量0.5%，拌料水pH=7條件下，麥糟與水的料液比對(duì)肽得率的影響見(jiàn)圖3。

水是微生物與營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)接觸的橋梁，培養(yǎng)基含水量的高低對(duì)微生物的生長(zhǎng)及代謝有重要影響。對(duì)固態(tài)發(fā)酵而言，含水量低會(huì)影響物料基質(zhì)的吸水膨脹，從而影響微生物對(duì)基質(zhì)接觸代謝，含水量過(guò)高又會(huì)影響培養(yǎng)基內(nèi)溶氧和CO2的排出，微生物難以生長(zhǎng)和產(chǎn)酶。由圖3可知，隨著加水量的增加，肽得率呈現(xiàn)先升后降趨勢(shì)，說(shuō)明培養(yǎng)基含水量過(guò)高過(guò)低都不利于蛋白肽的發(fā)酵生產(chǎn)，試驗(yàn)確定培養(yǎng)基的較好料液比為1.0∶2.0（g∶mL）。與袁建等[22]利用枯草芽孢桿菌固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)菜籽肽的研究一致，這可能與枯草芽孢桿菌的生長(zhǎng)代謝特性有關(guān)。

圖3 不同料液比對(duì)肽得率的影響Fig.3 Effect of different solid-liquid ratio on peptide yield

2.2.4 磷酸二氫鉀添加量對(duì)肽得率的影響

在葡萄糖添加量5%，料液比1.0∶2.5（g∶mL），拌料水pH=7的條件下，磷酸二氫鉀添加量對(duì)枯草芽孢桿菌發(fā)酵麥糟生產(chǎn)蛋白肽的影響結(jié)果見(jiàn)圖4。

圖4 不同磷酸二氫鉀添加量對(duì)肽得率的影響Fig.4 Effects of different potassium dihydrogen phosphate addition on peptide yield

磷酸二氫鉀除了提供微生物代謝所需的P、K礦質(zhì)營(yíng)養(yǎng)元素外，還可以緩沖培養(yǎng)基的pH 值。由圖4可見(jiàn)，當(dāng)磷酸二氫鉀濃度低時(shí)，隨著鹽濃度增加，肽得率增加，磷酸二氫鉀添加量為0.5%時(shí)，肽得率達(dá)到最大值11.17%，繼續(xù)增加磷酸二氫鉀的添加量，肽得率逐步下降，原因是高濃度磷酸鹽對(duì)微生物生長(zhǎng)代謝產(chǎn)生抑制作用，因此，枯草芽孢桿菌發(fā)酵麥糟生產(chǎn)蛋白肽培養(yǎng)基的較佳磷酸二氫鉀添加量為0.5%。

2.2.5 pH值對(duì)肽得率的影響

在葡萄糖添加量5%，磷酸二氫鉀添加量0.5%，料液比1.0∶2.5（g∶mL）的條件下，拌料水不同pH值對(duì)枯草芽孢桿菌發(fā)酵麥糟生產(chǎn)蛋白肽的影響見(jiàn)圖5。

pH值大小不僅會(huì)影響微生物的生長(zhǎng)代謝，也會(huì)影響蛋白酶及底物的解離狀態(tài)[23]，從而影響肽得率。由圖5可知，在pH5～9范圍內(nèi)，肽得率隨著pH值的增加呈先升后降趨勢(shì)，在配料水pH為7時(shí)，肽得率達(dá)到最大值?？紤]到實(shí)際應(yīng)用生產(chǎn)過(guò)程，中性pH對(duì)操作和設(shè)備的要求低，因此優(yōu)化試驗(yàn)中拌料水選擇在pH=7條件下進(jìn)行。

圖5 不同pH值對(duì)肽得率的影響Fig.5 Effect of different pH value on peptide yield

2.3 響應(yīng)面法優(yōu)化培養(yǎng)基條件

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用響應(yīng)曲面法的Box-Behnken試驗(yàn)方案優(yōu)化培養(yǎng)基條件，試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見(jiàn)表2。利用Minitab軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，所得回歸方程系數(shù)顯著性檢驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表3，模型的方差分析結(jié)果見(jiàn)表4。

表2 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Table2 Design and results of Box-Behnken experiments

表3 回歸系數(shù)顯著性分析Table3 Significance analysis of regression coefficients

表4 回歸模型方差分析Table4 Variance analysis of regression model

由表3可知，模型參數(shù)中，A、B、C、A2、B2、C2、AB、AC對(duì)肽得率影響極顯著（P＜0.01），BC對(duì)肽得率影響不顯著（P＞0.05）。自變量A、B、C對(duì)肽得率的影響大小為A＞B＞C，即葡萄糖添加量＞料液比＞磷酸二氫鉀添加量；各因素回歸擬合后得到回歸方程：

Y=12.26+0.776A+0.552B+0.349C-1.42A2-1.186B2-0.249C2+0.365AB-0.607AC+0.083BC

根據(jù)表4回歸模型方差分析結(jié)果，模型P＜0.01，表明該二次方程模型具有高度的顯著性；失擬項(xiàng)P＞0.05，表明模型失擬項(xiàng)不顯著；該模型決定系數(shù)R2=0.998 2，調(diào)整決定系數(shù)R2Adj=0.994 8，說(shuō)明模型擬合度較好，預(yù)測(cè)值與試驗(yàn)值具有高度相關(guān)性，可用該模型預(yù)測(cè)枯草桿菌發(fā)酵麥糟制備蛋白肽在不同條件下的肽得率。

根據(jù)回歸方程得出不同因子的響應(yīng)面及等高線分析圖，結(jié)果見(jiàn)圖6。響應(yīng)面及等高線圖可直觀反映各因素之間的交互作用對(duì)響應(yīng)值影響程度，曲面越陡，等密度線越密，影響越顯著[24-26]。由圖6可知，因素A與因素B、因素A與因素C兩對(duì)交互作用響應(yīng)圖陡峭，表明其對(duì)肽得率Y的影響極顯著（P＜0.01），而因素B與因素C的交互作用響應(yīng)圖平坦，即其對(duì)肽得率Y的影響不顯著（P＞0.05）。

圖6 各因素交互作用對(duì)肽得率影響的響應(yīng)面和等高線Fig.6 Response surface plots and contour lines of effects of interaction between each factor on the yield of peptide

經(jīng)過(guò)軟件分析優(yōu)化得到的條件為A=0.191 9，B=0.282 8，C=0.515 2，即葡萄糖添加量為4.192%、料液比為1∶2.141、磷酸二氫鉀添加量為0.603%，該條件下理論預(yù)測(cè)肽得率為12.504%?？紤]到實(shí)際操作，將葡萄糖添加量調(diào)整為4.2%，料液比取1.0∶2.1（g∶mL），磷酸氫二鉀添加量取0.6%，此條件下重復(fù)3次試驗(yàn)，取其平均值，肽得率實(shí)際值為12.40%，與預(yù)測(cè)值差別不大。

3 結(jié)論

采用枯草芽孢桿菌發(fā)酵生產(chǎn)麥糟蛋白肽過(guò)程中，確定了麥糟培養(yǎng)基中添加的最優(yōu)碳源為葡萄糖。試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，葡萄糖添加量、料液比、磷酸二氫鉀添加量三因素及其二次項(xiàng)對(duì)肽得率影響極顯著，在交互作用關(guān)系中，葡萄糖添加量與料液比、葡萄糖添加量與磷酸二氫鉀添加量間交互作用對(duì)肽得率影響極顯著。在選擇的水平范圍內(nèi)，優(yōu)化得到的培養(yǎng)基條件是：pH7.0，葡萄糖添加量4.2%，料液比1.0∶2.1（g∶mL），磷酸氫二鉀添加量0.6%，該條件下肽得率達(dá)12.40%。本試驗(yàn)利用微生物固態(tài)發(fā)酵麥糟制備蛋白肽方法可行，肽得率高，試驗(yàn)結(jié)果可為麥糟蛋白肽的工業(yè)化生產(chǎn)提供理論依據(jù)，具有較好的應(yīng)用價(jià)值。