馥郁香型白酒對高脂飲食小鼠脂代謝及腸道菌群的影響

陳欣怡，丁子元，劉永泉，余枚珠，韓詩雯，鄭曉衛(wèi)，*

（1.中糧營養(yǎng)健康研究院有限公司，北京 102209；2.酒鬼酒股份有限公司，湖南 吉首 416000；3.中國農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)與營養(yǎng)工程學(xué)院，北京 100083）

隨著社會的快速發(fā)展和人民生活水平的提高，人們餐桌上逐漸增加了大魚大肉等高脂食物，同時飲酒成為人們?nèi)粘Ｉ畹囊徊糠郑S多場合飲酒伴隨著高脂食物的攝入。而今人們開始重視健康的生活方式和飲食習(xí)慣，往往只關(guān)注不健康的飲酒習(xí)慣給機體造成的損傷，而忽視了適量、科學(xué)飲酒對機體的影響[1]。已有研究表明，長期過量飲酒會使肝臟功能受損，導(dǎo)致腸道菌群紊亂[2]。然而，適量飲酒能夠減少機體炎癥反應(yīng)的發(fā)生，有效降低高血壓、冠心病、動脈粥樣硬化、癡呆等疾病的發(fā)病風(fēng)險[3-4]。

白酒成分復(fù)雜，與人體健康的關(guān)系尚不明確，如何科學(xué)飲酒值得深入探討[5]。高脂飲食中食物脂肪含量高，長期食用會使體內(nèi)脂肪水平超出正常范圍，當(dāng)機體的能量攝入多于能量消耗時會導(dǎo)致肥胖，易造成心血管等一系列疾病[6-7]。此外，高脂飲食還能夠引起腸道組織氧化應(yīng)激發(fā)生，改變腸道微生態(tài)[8]。目前，已有研究表明飲用不同香型和品質(zhì)的白酒對機體的影響存在差異，而針對高脂飲食的動物研究相對較少。毛華等[9]探索了不同劑量的醬香型白酒對大鼠血脂、血糖、胰島素敏感性的影響，發(fā)現(xiàn)適量飲酒能提高大鼠高密度脂蛋白膽固醇（high density lipoprotein cholesterol，HDL-C）含量，且不產(chǎn)生胰島素抵抗；汪家文等[10]探討了不同濃度清香型白酒對大鼠血脂的影響及其與腦血管病的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)大鼠血清中總膽固醇（total cholesterol，TC）、甘油三酯（triglyceride，TG）、低密度脂蛋白膽固醇（low density lipoprotein cholesterol，LDL-C）升高水平或HDL-C降低水平與腦血管病變程度之間存在濃度效應(yīng)關(guān)系；李鈺等[11]報道，適量濃香型白酒可以在一定程度上具有預(yù)防動脈粥樣硬化發(fā)生發(fā)展的作用；方程[12]研究發(fā)現(xiàn)，醬香型白酒通過調(diào)節(jié)腸道菌群結(jié)構(gòu)可以減輕乙醇誘導(dǎo)的肝損傷；魯蕾等[13]研究發(fā)現(xiàn)，飲用不同品質(zhì)濃香型白酒對大鼠腸道菌群的影響存在差異，高品質(zhì)白酒對機體腸道菌群影響更小，更利于維護腸道微生態(tài)平衡。已有研究報道，充分發(fā)揮白酒中生物活性物質(zhì)的功效能減輕酒精成分對人體的損害，其中短鏈脂肪酸及其乙酯能加快乙醇在體內(nèi)的代謝，降低白酒的醉度，影響腸道內(nèi)微生物的生長代謝，保護腸黏膜屏障[14]。

近年來，白酒對脂代謝和腸道菌群的影響逐步成為很多人關(guān)注的問題。作為中國白酒十一大國標香型之一的馥郁香型白酒鮮有報道，故本研究采用高脂小鼠模型，通過灌胃不同劑量的馥郁香型白酒，研究小鼠臟器、血脂相關(guān)指標及腸道菌群結(jié)構(gòu)的變化，旨在探討一定劑量下馥郁香型白酒對高脂飲食小鼠脂代謝及腸道菌群的影響，為了解該香型白酒飲后舒適度提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

馥郁香型白酒（酒精度52%vol）：市售；無特定病原體（specific pathogen free，SPF）級健康雄性Balb/c小鼠（飼養(yǎng)于農(nóng)業(yè)部農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗測試中心（北京）SPF級動物房（SYXK（京）2020-0052），飼養(yǎng)環(huán)境溫度維持在（22±1）℃，濕度穩(wěn)定在（55±5）%，每12 h晝夜氣流交替一次）：北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司；基礎(chǔ)飼料、高脂飼料：北京華阜康生物科技股份有限公司Pro Kit：美國QIAGEN公司；總膽固醇（TC）測定試劑盒、甘油三酯（TG）測定試劑盒、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）測定試劑盒、高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）測定試劑盒、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）檢測試劑盒：南京建成生物工程研究所；16S rRNA的V3-V4區(qū)引物：上海生工生物工程股份有限公司；瓊脂糖：西班牙Biowest公司；FastPfu Polymerase：北京全式金生物技術(shù)有限公司；AxyPrep DNAGelExtractionKit：美國Axygen公司；NEXTFLEXRapid DNA-Seq Kit：美國Bioo Scientific公司；MiSeq Reagent Kit v3/NovaSeq Reagent Kits：美國Illumina公司；油紅O：阿拉丁試劑（上海）有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

ME403E天平、AC2-4S1生物安全柜：新加坡ESCO公司；7600全自動生化分析儀：日本HITACHI公司；Illumina Miseq PE300測序儀：美國Illumina公司；NANODROP紫外分光光度計：美國Thermo公司；5427R高速冷凍離心機、ABI9700型聚合酶鏈式反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）儀：美國ABI公司；DYY-6C電泳儀：北京市六一儀器廠；BX51光學(xué)顯微鏡：日本OLYMPUS公司。

1.3 方法

1.3.1 動物實驗

Balb/c小鼠共60只，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后按體質(zhì)量隨機分為5組，即基礎(chǔ)飼料對照組，飼喂基礎(chǔ)飼料；高脂飼料模型組、低劑量組、中劑量組和高劑量組，飼喂高脂飼料。每組12只，每6只一籠。按照《中國居民膳食指南》建議男性每日飲酒的酒精量≤25 g為參照，標準人體質(zhì)量60 kg計算，人體每日飲酒量為100 mL，由此設(shè)置52%vol馥郁香型白酒9.1 mL/kg體質(zhì)量為高劑量組；中劑量組為7.6 mL/kg體質(zhì)量，相當(dāng)于成人喝50 mL馥郁香型白酒；低劑量組為6.0 mL/kg體質(zhì)量。高、中、低劑量組灌胃受試樣品，基礎(chǔ)飼料對照組和高脂飼料模型組給予蒸餾水，連續(xù)灌胃6周。試驗期間各組小鼠均自由采食與飲水，每天固定時間進行灌胃處理，每周更換兩次墊料，每周記錄一次小鼠體質(zhì)量和食物剩余量。末次處理后，小鼠夜間禁食（不禁水）8 h后，眼球毛細管采血0.5～1.0 mL，隨后將小鼠脫頸處死，解剖后摘除肝臟、腎臟、附睪脂肪和腎周脂肪，取出小鼠盲腸內(nèi)容物1～2 g。

1.3.2 檢測方法

臟器系數(shù)[15]：用紙吸干肝臟、附睪脂肪和腎周脂肪表面液體，使用電子天平立即分別稱量質(zhì)量，計算小鼠臟器系數(shù)，其計算公式如下：

肝臟內(nèi)脂質(zhì)、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）指標：按照各檢測指標試劑盒說明書中的要求制備合適的組織勻漿液后進行測定。

附睪脂肪和腎周脂肪的油紅O染色切片[16]：分離附睪和腎周脂肪組織，液氮冷凍制作冰凍切片，隨后進行油紅O溶液染色（0.5 g油紅O/100 mL，溶解于異丙醇中），切片于光學(xué)顯微鏡下進行觀察。

血清指標：采集的血液于4 ℃靜置4 h，4 ℃、4 000 r/min條件下離心15 min，收集上層血清，采用試劑盒方法測定血清中TC、TG、HDL-C、LDL-C含量。

1.3.3 小鼠腸道菌群多樣性的分析

1.3.4 統(tǒng)計學(xué)分析方法

采用SPSS 24.0軟件進行數(shù)據(jù)的統(tǒng)計分析，結(jié)果采用“平均值±標準差”（x±s）表示。方差齊時進行單因素方差分析（analysis of variance，ANOVA），LSD檢驗進行組間兩兩比較；方差不齊時使用Kruskal-Wallis檢驗。

2 結(jié)果與分析

2.1 馥郁香型白酒對小鼠肝臟系數(shù)、肝臟內(nèi)脂質(zhì)及SOD活力的影響

基礎(chǔ)飼料對照組、高脂飼料模型組以及高脂-低、中、高劑量組小鼠肝臟系數(shù)、肝臟內(nèi)脂質(zhì)及SOD活力檢測結(jié)果見表1。

表1 各處理組小鼠肝臟系數(shù)、肝臟內(nèi)脂質(zhì)及超氧化物歧化酶活力的檢測結(jié)果Table1 Determination results of liver coefficient,lipids and superoxide dismutase activity in liver in treatment groups

由表1可知，與基礎(chǔ)飼料對照組相比，高脂飼料模型組小鼠的臟器指數(shù)、肝臟內(nèi)脂質(zhì)顯著增加（P＜0.05），SOD活力顯著下降（P＜0.05），說明高脂飲食會導(dǎo)致小鼠肝臟系數(shù)、肝臟內(nèi)脂質(zhì)增加、SOD活力下降。與高脂飼料模型組相比，高脂-低劑量組小鼠的肝臟系數(shù)顯著降低（P＜0.05），說明低劑量的馥郁白酒可以緩解高脂引起的小鼠肝臟系數(shù)的升高；高脂-低、中、高劑量組小鼠的肝臟內(nèi)脂質(zhì)顯著下降（P＜0.05），SOD活力顯著上升（P＜0.05），說明飼喂高脂飼料的同時攝入馥郁香型白酒有助于緩解高脂引起的小鼠肝臟內(nèi)脂質(zhì)的升高、SOD活力的降低，分析原因可能是適量的馥郁香型白酒具有一定的抗氧化作用，與文獻[22]報道結(jié)果一致。結(jié)果表明，適量飲用馥郁香型白酒能夠緩解高脂攝入對肝臟的影響及其脂質(zhì)的積累，白酒在釀造過程中產(chǎn)生的某些生物活性組分可能對肝臟起到一定的保護作用，機理尚待深入研究[23-24]。

2.2 馥郁香型白酒對小鼠附睪脂肪和腎周脂肪的影響

基礎(chǔ)飼料對照組、高脂飼料模型組以及高脂-低、中、高劑量組小鼠附睪脂肪系數(shù)和腎周脂肪系數(shù)的檢測結(jié)果見表2。

表2 各處理組小鼠附睪脂肪系數(shù)和腎周脂肪系數(shù)的檢測結(jié)果Table2 Determination results of epididymisadipose and perirenal fat coefficient of mice in treatment groups

由表2可知，與基礎(chǔ)飼料對照組相比，高脂飼料模型組小鼠的附睪脂肪系數(shù)與腎周脂肪系數(shù)顯著升高（P＜0.05）。與高脂飼料模型組相比，高脂-低、中、高劑量組小鼠的附睪脂肪系數(shù)及腎周脂肪系數(shù)顯著降低（P＜0.05），且除高脂-高劑量組小鼠的附睪脂肪系數(shù)外，均與基礎(chǔ)飼料對照組無顯著差異（P＞0.05）。說明飼喂高脂飼料的同時攝入馥郁香型白酒有助于緩解高脂引起的附睪脂肪系數(shù)及腎周脂肪系數(shù)的升高，甚至在一定劑量下可以恢復(fù)至基礎(chǔ)飼料對照組水平。同時，對附睪脂肪和腎周脂肪的油紅O染色切片觀察，結(jié)果見圖1。由圖1可知，高脂飼料能夠顯著增加脂肪滴在附睪和腎周中的聚集，適量的馥郁香型白酒能一定程度地抑制高脂飼料引發(fā)的附睪和腎周脂肪滴聚集和增多。

圖1 附睪脂肪和腎周脂肪的油紅O染色切片F(xiàn)ig.1 Oil red O stained sections of epididymisadipose and perirenal fat

2.3 馥郁香型白酒對小鼠血脂的影響

基礎(chǔ)飼料對照組、高脂飼料模型組以及高脂-低、中、高劑量組小鼠血清TC、TG、HDL-C及LDL-C含量的檢測結(jié)果見表3。

表3 各處理組小鼠血脂相關(guān)指標的檢測結(jié)果Table3 Determination results of blood lipid related indexes of mice in treatment groups

由表3可知，與基礎(chǔ)飼料對照組相比，高脂飼料模型組小鼠血清中的TC、HDL-C、LDL-C含量顯著升高（P＜0.05），TG含量變化不顯著（P＞0.05）。與高脂飼料模型組相比，除高脂-低劑量組小鼠的LDL-C外，高脂-低、中、高劑量組小鼠血清中的TG、HDL-C及LDL-C含量顯著降低（P＜0.05），TG含量下降但不顯著（P＞0.05）。結(jié)果表明，適量飲用馥郁香型白酒能夠降低高脂飲食帶來的血脂指標的升高，降低血脂指標的異常升高有助于預(yù)防心腦血管疾病發(fā)生和發(fā)展[25]。目前對于飲酒與血脂的關(guān)系有不同的報道，飲用劑量也各不相同，丁書文等[26]研究發(fā)現(xiàn)，少量飲酒無升高HDL-C含量作用，大量飲酒TC含量下降；康金森等[27]研究發(fā)現(xiàn)，飲用一定劑量的酒可使高脂血癥大鼠血清中TC、TG和LDL-C水平明顯降低；類春燕等[28]研究發(fā)現(xiàn)，低劑量白酒組LDL含量顯著降低，高劑量白酒組HDL明顯升高。

2.4 馥郁香型白酒對小鼠腸道菌群的影響

2.4.1 馥郁香型白酒對小鼠腸道菌群多樣性的影響

根據(jù)《中國居民膳食指南》推薦劑量，選擇高脂-高劑量組進一步研究馥郁香型白酒對小鼠腸道菌群的影響。Alpha多樣性分析能反映特定區(qū)域或生態(tài)系統(tǒng)內(nèi)的豐富度和均勻度[29]。相同物種豐富度的情況下，群落中各物種均勻度越大，則認為群落多樣性越高[30]。小鼠腸道菌群α-多樣性指數(shù)分析結(jié)果見表4。

表4 小鼠腸道細菌菌群α-多樣性指數(shù)分析結(jié)果Table4 Results of alpha diversity indexes analysis of intestinal flora in mice

由表4可知，與基礎(chǔ)飼料對照組比較，高脂飼料模型組的OUTs、Shannon指數(shù)顯著下降（P＜0.05），Simpson指數(shù)顯著升高（P＜0.05），ACE指數(shù)及Chao1指數(shù)無顯著變化（P＞0.05），說明高脂飲食能降低小鼠腸道菌群的多樣性，對豐富度影響不大。與高脂飼料模型組比較，高脂-高劑量組小鼠的OUTs、Shannon指數(shù)顯著升高（P＜0.05），Simpson指數(shù)顯著下降（P＜0.05），ACE指數(shù)及Chao1指數(shù)無顯著變化（P＞0.05），說明高脂飲食的同時飲用高劑量馥郁香型白酒對小鼠腸道菌群豐度沒有顯著變化，而多樣性有所提高。結(jié)果表明，適量的馥郁香型白酒能夠一定程度緩解因高脂飲食導(dǎo)致的腸道菌群多樣性失衡。

2.4.2 馥郁香型白酒對小鼠腸道菌群結(jié)構(gòu)的影響

各組小鼠腸道菌群在科、屬水平上的注釋結(jié)果見圖2。

由圖2a可知，在科分類水平上，基礎(chǔ)飼料對照組、高脂飼料模型組、高脂-高劑量組小鼠腸道的主要菌為毛螺菌科（Lachnospiraceae）（相對含量為25.96%、69.14%、49.84%）、脫硫弧菌科（Desulfovibrionaceae）（相對含量為5.04%、17.00%、12.72%）、普雷沃氏菌科（Prevotellaceae）（相對含量為23.42%、0.10%、11.00%）、顫螺旋菌科（Oscillospiraceae）（相對含量為2.95%、1.90%、9.18%）、瘤胃球菌科（Ruminococcaceae）（相對含量為1.16%、1.04%、3.19%）等。毛螺菌科屬于厚壁菌門（Firmicutes）的優(yōu)勢菌群，產(chǎn)生丁酸鹽將多糖進行降解并產(chǎn)生能量，小鼠吸收后有引起肥胖、糖尿病等代謝疾病的風(fēng)險[31]。與基礎(chǔ)飼料對照組相比，高脂飼料模型組小鼠腸道毛螺菌科含量提高了166.33%，高脂-高劑量組小鼠腸道毛螺菌科含量提高了91.99%，說明飲酒可以對高脂飲食產(chǎn)生大量能量效應(yīng)有一定抑制作用。有研究表明，在糖尿病患者的糞便中，普雷沃氏菌科的含量顯著低于正常人群[32]。本研究中高脂飲食后小鼠腸道的普雷沃氏菌科含量顯著低于基礎(chǔ)飼料對照組，雖然飲酒后同樣引起普雷沃氏菌科含量降低，但與高脂飼料模型組相比普雷沃氏菌科含量上升了109%（P＜0.05）。

由圖2b可知，在屬分類水平上，基礎(chǔ)飼料對照組、高脂飼料模型組、高脂-高劑量組小鼠腸道的主要菌為脫硫弧菌屬（Desulfovibrio）（相對含量為4.89%，、47.66%、32.97%）、布勞特氏菌屬（Blautia）（相對含量為0.64%、15.68%、20.76%）、擬普雷沃菌屬（Alloprevotella）（相對含量為21.38%、0.01%、0.15%）、羅斯氏菌屬（Roseburia）（相對含量為3.73%、0.49%、2.02%）、瘤胃球菌屬（Ruminococcus）（相對含量為0.01%、0.59%、3.90%）等。脫硫弧菌屬屬于脫硫弧菌科，是一種還原硫酸鹽的菌，可以降解短鏈脂肪酸、氨基酸等營養(yǎng)成分而產(chǎn)生有毒物質(zhì)H2S，從而破壞腸黏膜屏障，導(dǎo)致內(nèi)毒素進入循環(huán)系統(tǒng)而產(chǎn)生炎癥反應(yīng)[33]。與基礎(chǔ)飼料對照組相比，高脂飲食引起小鼠脫硫弧菌屬相對含量上升。與高脂飼料模型組相比，飲酒伴隨高脂飲食緩解了單純高脂飲食引起的脫硫弧菌屬含量上升，該菌屬含量下降30.82%（P＜0.05）。羅斯氏菌屬屬于毛螺菌科，該菌屬產(chǎn)生丁酸鹽，若同時食用高纖維飲食的小鼠患動脈粥樣硬化和炎癥減少[34]。與基礎(chǔ)飼料對照組相比，高脂飲食引起小鼠羅斯氏菌屬相對含量顯著下降（P＜0.05）。與高脂飼料模型組相比，飲酒伴隨高脂飲食緩解了單純高脂飲食引起的羅斯氏菌屬含量下降，該菌屬含量上升312.24%（P＜0.05）。瘤胃球菌屬屬于瘤胃球菌科（Ruminococcaceae），可以促進多種多糖和纖維的降解產(chǎn)生短鏈脂肪酸，且其豐度與酒精性肝硬化、增加腸道通透性及潰瘍性結(jié)腸炎等呈顯著負相關(guān)[35]。與基礎(chǔ)飼料對照組相比，高脂飼料模型組與高脂-高劑量組中的瘤胃球菌屬相對含量均有升高，后者更為顯著（P＜0.05）。與高脂飼料模型組相比，高脂-高劑量組中瘤胃球菌屬相對含量升高了561.02%（P＜0.05）。由此可見，適量的馥郁香型白酒顯著提高了瘤胃球菌屬含量，有助于降低肝病和潰瘍性結(jié)腸炎的風(fēng)險，對腸道保持穩(wěn)態(tài)具有一定意義[36]。

圖2 基于科（a）和屬（b）水平小鼠腸道菌群結(jié)構(gòu)Fig.2 Structure of intestinal flora in mice based on family (a) genus (b)level

2.4.3 差異物種線性判別分析

為了分析基礎(chǔ)飼料對照組、高脂飼料模型組及高脂-高劑量組特征細菌類群和顯著豐度差異特征，進行了LEfSe多級物種差異線性判別分析，結(jié)果見圖3。

圖3 LEfSe多級物種差異線性判別分析Fig.3 Linear discriminant analysis of LEfSe multilevel species differences

由圖3可知，在基礎(chǔ)飼料對照組中，擬普雷沃菌屬（LDA值為4.68）、乳酸菌屬（LDA值為4.06）、Candidatus Saccharimonas（LDA值為3.90）、Muribaculum（LDA值為3.85）、Prevotellaceae_UCG_001（LDA值為3.74）等紅色標記為差異物種，相對含量顯著高于高脂飼料模型組和高脂-高劑量組。脫硫弧菌屬（LDA值為5.26）在高脂飼料模型組中相對含量顯著高于基礎(chǔ)飼料對照組和高脂-高劑量組，是對高脂飼料模型組在組間差異具有顯著影響的菌屬。瘤胃球菌屬（LDA值為3.45）在高脂-高劑量組中相對含量顯著高于基礎(chǔ)飼料對照組和高脂飼料模型組，是對高脂-高劑量組在組間差異具有顯著影響的菌屬。該結(jié)果說明，適量的馥郁香型白酒可以提高瘤胃球菌屬含量，有效促進腸道中益生菌的增殖，瘤胃球菌屬是判別飲用馥郁香型白酒的特征菌屬。

3 結(jié)論

本研究通過評估馥郁香型白酒對小鼠脂代謝和腸道菌群的影響，發(fā)現(xiàn)適量飲用馥郁香型白酒能夠有效控制因高脂飼料引起的小鼠肝臟、附睪脂肪和腎周脂肪系數(shù)及其相關(guān)脂質(zhì)的積累，提高肝臟內(nèi)SOD活力，改善高脂飲食帶來的血脂中TG、LDL-C和HDL-C含量的升高，一定程度緩解因高脂飲食導(dǎo)致的腸道菌群多樣性失衡。在屬水平上，飲酒伴隨高脂飲食緩解了高脂飲食引起的脫硫弧菌屬相對含量的上升和羅斯氏菌屬相對含量的下降，顯著增加了瘤胃球菌屬相對含量。結(jié)果表明，適量飲用馥郁香型白酒對高脂飲食造成的小鼠脂代謝異常和腸道菌群的失衡有一定的緩解作用。