貴州不同地區(qū)“生花”糟辣椒中微生物多樣性研究

王雪雅，陸 寬 ，殷 勇，蓬桂華，孫小靜，李文馨

（1.貴州省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 辣椒研究所，貴州 貴陽(yáng) 550006；2.貴州省生物技術(shù)研究開(kāi)發(fā)基地，貴州 貴陽(yáng) 550002）

糟辣椒（fermented pepper）是貴州主要的民族特色辣椒制品之一，是將新鮮紅椒輔以姜、蒜、食鹽剁碎塊后以乳酸菌為優(yōu)勢(shì)菌發(fā)酵而成的調(diào)味品，口感爽脆，香辣適宜，風(fēng)味酸香。糟辣椒在貯藏過(guò)程中易受到腐敗微生物污染出現(xiàn)“生花”現(xiàn)象?！吧ā?，也稱(chēng)產(chǎn)膜，是指微生物在腌制蔬菜表面形成的一層白膜或少數(shù)白斑，引起該現(xiàn)象的微生物主要為芽孢桿菌（Bacillus）、假絲酵母（Candida）、畢赤酵母（Pichia pastoris）等[1]。漢遜酵母（Hansenula polymorpha）、畢赤氏酵母等發(fā)酵力低的產(chǎn)膜酵母在有氧條件下迅速生長(zhǎng)繁殖形成大量的菌醭，賦予“菌醭”味，同時(shí)還造成發(fā)酵液渾濁[2]，不僅分解組織內(nèi)有機(jī)物質(zhì)，同時(shí)發(fā)酵生成的乳酸和其他酯類(lèi)等代謝物質(zhì)，致使制品酸度下降和腐敗變質(zhì)，影響產(chǎn)品品質(zhì)風(fēng)味[3]。JEON S B等[4]對(duì)四川省不同城市采集的7份腐爛泡菜樣品進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)泡菜形成膜醭的微生物均為真菌。目前對(duì)糟辣椒的保質(zhì)方法主要有兩種，一是熱力消毒滅菌法，通過(guò)高溫殺滅糟辣椒中微生物，但該方法對(duì)糟辣椒的口感和風(fēng)味均有較大的影響；二是添加化學(xué)防腐劑，如山梨酸鉀、苯甲酸鈉等人工合成的化學(xué)防腐劑，該方法對(duì)風(fēng)味、品質(zhì)影響較小，但有一定的毒副作用，長(zhǎng)期使用造成食用安全隱患。因此，開(kāi)發(fā)綠色、安全、無(wú)害的天然防腐劑或抑菌劑是今后食品貯藏保鮮技術(shù)的研究熱點(diǎn)。

目前，發(fā)酵辣椒的研究主要集中在優(yōu)勢(shì)菌的篩選和多樣性分析方面，韓俊燕等[5]對(duì)家庭自制的剁辣椒、酸辣椒、腌辣椒和辣椒醬進(jìn)行MiSeq高通量測(cè)序分析樣品中細(xì)菌的多樣性，RIELA L等[6]從受污染辣椒醬罐頭中分離到曼氏畢赤酵母（Pichia manshurica）和彎曲乳桿菌（Lactobacilluscurvatus）；李玲玲等[7]從腐敗的黃燈籠辣椒醬中分離純化到11種細(xì)菌、1種酵母菌、8種霉菌，GARCíA-DIEZ J等[8]利用平板挖井?dāng)U散法從新鮮切斷辣椒中分離出4株腐敗菌。本研究通過(guò)Miseq高通量測(cè)序技術(shù)進(jìn)行微生物多樣性差異分析，結(jié)合傳統(tǒng)微生物培養(yǎng)分離方法、16S rDNA序列分析技術(shù)和引物內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（internal transcribed spacer，ITS）序列分析技術(shù)篩選引起糟辣椒“生花”現(xiàn)象的主要微生物，并對(duì)分離菌株進(jìn)行發(fā)酵特性試驗(yàn)及回接試驗(yàn)，研究“生花”糟辣椒中的微生物多樣性，并分離純化引起“生花”現(xiàn)象的菌株，可為糟辣椒綠色安全的天然保質(zhì)技術(shù)的開(kāi)發(fā)提供試驗(yàn)基礎(chǔ)，以期為糟辣椒綠色、安全保質(zhì)技術(shù)的開(kāi)發(fā)提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 糟辣椒樣品

選取貴州省不同地區(qū)“生花”的糟辣椒樣品：1號(hào)樣品采集自貴陽(yáng)（編號(hào)GY）；2號(hào)樣品采集自遵義烏江（編號(hào)WJ）；3號(hào)樣品采集自黔南龍里（編號(hào)LL）；4號(hào)樣品采集自畢節(jié)大方（編號(hào)DF）。以上樣品均為農(nóng)戶(hù)自制，存放于土陶發(fā)酵壇中，食用時(shí)開(kāi)蓋即取；樣品表面附有一層碎花狀的白斑，取樣時(shí)，利用已滅菌的器具，均勻取樣。

1.1.2 化學(xué)試劑

糖發(fā)酵生化鑒定管：青島日水生物技術(shù)有限公司；ExTaq酶（5 U/μL）、基因組脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）提取試劑盒、DNA回收試劑盒：天根生化科技（北京）有限公司；FastDNASpin Kit for Soil試劑盒：美國(guó)MP Biomedicals公司；AxyPrep DNA凝膠提取試劑盒：美國(guó)Axygen Biosciences公司；QuantiFluorTM-ST微型熒光劑：美國(guó)Promega公司；10×Taq緩沖液、脫氧核糖核苷三磷酸（deoxyribonucleoside triphosphates，dNTPs）、DNA聚合酶、瓊脂糖：上海生工生物公司；QIAquick膠回收試劑盒：安倍醫(yī)療器械貿(mào)易（上海）有限公司。其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純或生化試劑。

1.1.3 培養(yǎng)基

營(yíng)養(yǎng)瓊脂（nutrient agar，NA）培養(yǎng)基、馬鈴薯葡萄糖瓊脂（potato dextrose agar，PDA）培養(yǎng)基、察氏（Czapek's，CZ）培養(yǎng)基：北京陸橋技術(shù)股份有限公司；產(chǎn)氨培養(yǎng)基：100 mL/L脫脂牛乳，0.5 g/L NaCl，0.5 g/L精氨酸、奈氏試劑。105 ℃滅菌15 min。

1.2 儀器與設(shè)備

FSH-2A高速均質(zhì)機(jī)：常州越新儀器制造有限公司；TGL-24MC離心機(jī)：長(zhǎng)沙平凡儀器儀表有限公司；PB-10賽多利斯pH計(jì)：賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司；CRH-150生化培養(yǎng)箱：上海一恒科學(xué)儀器有限公司；SW-CJ-K超凈工作臺(tái)：蘇州華宏凈化技術(shù)有限公司；THZ-C-1恒溫振蕩器：蘇州培英實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；5331梯度聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）儀：德國(guó)Eppendorf公司；Nano Drop-2000超微量分光光度計(jì)：美國(guó)Nano Drop公司；QuantusTM熒光計(jì)：美國(guó)Promega公司；Illumina Miseq PE300測(cè)序儀：美國(guó)Illumina公司。

1.3 方法

1.3.1 高通量測(cè)序分析

糟辣椒菌群總DNA提?。壕嚎侱NA的提取采用FastDNASpin Kit for Soil試劑盒，按產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)要求對(duì)所有樣品進(jìn)行DNA抽提，使用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA的提取質(zhì)量，使用NanoDrop-2000測(cè)定DNA濃度和純度。

PCR擴(kuò)增產(chǎn)物與測(cè)序[9]：以提取的DNA為模板，細(xì)菌使用799F（5'-AACMGGATTAGATACCCKG-3'）和1193R（5'-ACGTCATCCCCACCTTCC-3''）對(duì)16S rRNA基因V5-V7可變區(qū)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增條件為：95 ℃預(yù)變性3 min；95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，共35個(gè)循環(huán)；72 ℃再穩(wěn)定延伸10 min，在4 ℃進(jìn)行保存。PCR擴(kuò)增體系為：5×TransStart FastPfu緩沖液4 μL，dNTPs（2.5 mmol/L）2 μL，上、下游引物（5 μmol/L）0.8 μL，TransStart FastPfu DNA聚合酶0.2 μL，模板DNA10 ng，加雙蒸水（ddH2O）補(bǔ)足至20 μL。每個(gè)試驗(yàn)重復(fù)3次。

真菌ITS擴(kuò)增區(qū)引物為ITS1F（5'-CTTGGTCATTTA GAGGAAGTAA-3'）和ITS2R（5'-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3'）。PCR擴(kuò)增條件為：95 ℃預(yù)變性3 min；95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，40個(gè)循環(huán)；72 ℃再穩(wěn)定延伸10 min，在4 ℃進(jìn)行保存。PCR擴(kuò)增體系為：5×TransStart FastPfu緩沖液2 μL，dNTPs（2.5 mmol/L）2 μL，上、下游引物（5 μmol/L）0.8 μL，TransStart FastPfu DNA聚合酶0.2 μL，模板DNA 10 ng，加雙蒸水（ddH2O）補(bǔ)足至20 μL。每個(gè)試驗(yàn)重復(fù)3次。

高通量測(cè)序分析：將同一樣本的PCR產(chǎn)物混合后使用2%瓊脂糖凝膠回收PCR產(chǎn)物，采用AxyPrep DNA Gel Extraction Kit對(duì)回收產(chǎn)物進(jìn)行純化，經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后，用QuantusTM熒光儀對(duì)回收產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)定量。使用NEXTFLEX Rapid DNA-Seq Kit建庫(kù)，文庫(kù)質(zhì)檢合格后，利用Illumina公司的Miseq PE300平臺(tái)由上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司進(jìn)行高通量測(cè)序。數(shù)據(jù)處理使用Fastp[10]軟件對(duì)原始測(cè)序序列進(jìn)行質(zhì)控，F(xiàn)LASH[11]軟件進(jìn)行拼接，使用UPARSE[12]（https：//drive 5.com/uparse/）軟件根據(jù)97%[13-14]的相似度對(duì)序列進(jìn)行操作分類(lèi)單元（operational taxonomic units，OTU）聚類(lèi)并剔除嵌合體。利用核糖體數(shù)據(jù)庫(kù)項(xiàng)目（ribosomal database project，RDP）Classifier（https：//rdp.cme.msu.edu）對(duì)每條序列進(jìn)行物種分類(lèi)注釋?zhuān)葘?duì)Silva 16S rRNA數(shù)據(jù)庫(kù)（Version 138），設(shè)置比對(duì)閾值為70%。

1.3.2 “生花”糟辣椒樣品中微生物的提取、分離及純化[15-16]

在無(wú)菌操作條件下，稱(chēng)取25 g“生花”糟辣椒樣品，加到225 mL無(wú)菌水中，在搖床中振蕩30 min制成1∶10的樣品均液，吸取1 mL上清液，選擇3個(gè)合適稀釋梯度，涂布于對(duì)應(yīng)的培養(yǎng)基上，每個(gè)稀釋度做3個(gè)平行，接種至NA培養(yǎng)基（37 ℃，24 h）和PDA培養(yǎng)基（28 ℃，48 h）中，均倒置培養(yǎng)，培養(yǎng)完成后挑取單菌落進(jìn)行多次劃線(xiàn)分離、純化培養(yǎng)，獲得單個(gè)菌落并進(jìn)行編號(hào)記錄備用。

1.3.3 分離菌株的分子生物學(xué)鑒定

真菌采用引物內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（internal transcribed spacer，ITS）Sanger測(cè)序[17]：取1.5 mL離心管，挑取純化過(guò)得單菌落置入100 μL無(wú)菌水中，輕微振蕩，取1 mL菌液，以4 000 r/min（4 ℃）離心2 min得到細(xì)胞沉淀，去上清，用1 mL無(wú)菌水清洗菌體2次，以酵母全基因組為模板，以引物ITS1（5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3'）和ITS4（5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'）進(jìn)行ITS序列擴(kuò)增，PCR擴(kuò)增體系（20 μL），正反引物各1 μL，DNA模板0.5 μL，10×ExTaqbuffer 2.0 μL，ExTaq（5 U/μL）0.2 μL，dNTP Mix（2.5 mmol/L）1.6 μL以及ddH2O 13.7 μL；PCR擴(kuò)增程序：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸1.5 min，25個(gè)循環(huán)；72 ℃再延伸10 min，最后降溫至10 ℃。擴(kuò)增產(chǎn)物采用2%的瓊脂凝膠進(jìn)行電泳檢測(cè)，將合格的ITS序列送至上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司。

細(xì)菌16S rDNA鑒定[18]：取1.5 mL離心管，挑取純化過(guò)的單菌落置入100 μL無(wú)菌水中，輕微振蕩，置于PCR儀中95～100 ℃處理10 min，8 000 r/min離心3 min，取上清液作為DNA模板，-20 ℃保存?zhèn)溆?。PCR擴(kuò)增采用16S rDNA通用引物，正向引物27F：5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'；反向引物1492R：5'-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3'；PCR擴(kuò)增體系：正反引物各1 μL，DNA模板0.5 μL，10×Ex-Taqbuffer 2.0 μL，ExTaq（5 U/μL）0.2 μL，2.5 mmol/L dNTP Mix1.6 μL以及ddH2O13.7 μL。PCR擴(kuò)增程序：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸1.5 min，25個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min，最后降溫至10 ℃。1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR反應(yīng)產(chǎn)物結(jié)果，30 min后再紫外燈下觀察結(jié)果并拍照記錄，并將PCR產(chǎn)物送至上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司測(cè)序，測(cè)序結(jié)果同上述真菌測(cè)序結(jié)果一樣處理。

將測(cè)序結(jié)果提交美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心（national center for biotechnology information，NCBI）的GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行基本局部比對(duì)搜索工具（basic local alignment search tool，BLAST）比對(duì)，確定與已報(bào)道的微生物16S rDNA基因核苷酸序列的同源性。分別下載每個(gè)序列相似性最高的同源序列及其種屬代表性微生物的ITS序列，采用Clustal W1.8軟件進(jìn)行多序列比對(duì)。采用MEGA 6.0軟件中的鄰接（neighbor-joining，NJ）法構(gòu)建分子進(jìn)化樹(shù)，并進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析。

1.3.5 菌種發(fā)酵特性試驗(yàn)

糖發(fā)酵試驗(yàn)參照顧春濤[19]的方法；產(chǎn)氨、產(chǎn)酸、產(chǎn)膜、產(chǎn)黏試驗(yàn)參照蔡炯等[20]的方法。

1.3.6 回接驗(yàn)證試驗(yàn)

為進(jìn)一步確認(rèn)引起糟辣椒“生花”的主要微生物，將已發(fā)酵成熟的未“生花”糟辣椒采用無(wú)菌離心管密封包裝后采用60Co-γ射線(xiàn)輻照滅菌處理，3 kGy劑量γ輻照樣品重復(fù)3次，方法參照文獻(xiàn)[21]。用上述分離純化獲得的菌株擴(kuò)大培養(yǎng)[22]，分別接入裝有50 mL相應(yīng)液體培養(yǎng)基的錐形瓶中，在30 ℃、160 r/min的條件下恒溫振蕩培養(yǎng)，至對(duì)數(shù)期取出，然后在4 ℃條件下，11 000 r/min離心15 min，棄去上清液，加無(wú)菌生理鹽水進(jìn)行重懸，反復(fù)吹打液體，重復(fù)3次以上操作，最后將菌種濃度調(diào)至108CFU/mL的數(shù)量級(jí)，4 ℃條件下保存?zhèn)溆?。以接種量2%（V/V）轉(zhuǎn)接量轉(zhuǎn)接至糟辣椒中，以接種菌的糟辣椒為試驗(yàn)組，以不接菌的糟辣椒為空白組（CK），每組3個(gè)平行，于28 ℃恒溫培養(yǎng)30 d，每天觀察是否“生花”，以驗(yàn)證其致“生花”性。

2 結(jié)果與分析

2.1 樣品中微生物Alpha多樣性分析

在97%相似性水平條件下采集OTU信息，進(jìn)行“生花”糟辣椒樣品中微生物菌群Alpha多樣性分析，獲得Shannon、Simpson、ACE、Chao1指數(shù)及Coverage，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 “生花”糟辣椒樣品微生物菌群Alpha多樣性分析結(jié)果Table1 Results of Alpha diversity analysis of microbial flora in "Shenghua" fermented pepper samples

在Alpha多樣性分析中，Chao1和ACE指數(shù)用于衡量物種豐度，值越高表明群落物種的豐富度越高，Shannon和Simpson指數(shù)用于衡量物種多樣性，Shannon指數(shù)越高、Simpson指數(shù)越低，表明群落物種的多樣性越高[23]。由表1可知，獲得細(xì)菌和真菌的有效序列數(shù)分別為97 306條、288 570條，4個(gè)樣品的OTU覆蓋率（Coverage）均為99.9%以上，表明絕大部分物種均能檢出，本次實(shí)驗(yàn)建立的文庫(kù)能真實(shí)有效的反應(yīng)樣品細(xì)菌和真菌的多樣性，所有樣品中細(xì)菌和真菌OTU數(shù)量最多的是GY樣品，細(xì)菌、真菌OTU數(shù)分別為257條、7條，DF樣品中細(xì)菌OTU數(shù)量最少（26條），ZY樣品中真菌OTU數(shù)量最少（3條），表明GY樣品中微生物種類(lèi)和數(shù)量較多，其余3個(gè)樣品OUT數(shù)量差異不大。4個(gè)樣品中，GY樣品的細(xì)菌和真菌Chao1和ACE指數(shù)最高，細(xì)菌分別為257.097、257.771，真菌分別為8.000、10.667，說(shuō)明GY樣品物種豐度最高。物種多樣性方面，GY樣品中細(xì)菌的Shannon指數(shù)最高（2.477），LL樣品最低（0.620），說(shuō)明GY樣品不僅物種豐度高，多樣性也高；DF樣品中真菌的Shannon指數(shù)最高，Simpson指數(shù)最低，表明DF樣品的真菌物種多樣性高。綜上所述，貴州不同區(qū)域的“生花”糟辣椒微生物物種差異性較大。在收集的樣品中，GY樣品中細(xì)菌和真菌物種豐度相對(duì)最高，細(xì)菌的物種多樣性最復(fù)雜，DF樣品中真菌的物種多樣性最高。

2.2 基于門(mén)、屬分類(lèi)學(xué)地位的菌群結(jié)構(gòu)分析

2.2.1 基于門(mén)水平樣品菌群結(jié)構(gòu)分析

本研究將平均相對(duì)含量＞1.00%的真菌門(mén)或?qū)俣x為優(yōu)勢(shì)門(mén)或?qū)?，將不能鑒定到門(mén)或者屬水平的序列歸并為“unclassified”，將其他＜1.00%的門(mén)或?qū)偾蠛秃髿w并為“others”。基于門(mén)水平的貴州不同地區(qū)“生花”糟辣椒樣品細(xì)菌和真菌菌群組成見(jiàn)圖1。

圖1 基于門(mén)水平的4個(gè)樣品的細(xì)菌（a）和真菌（b）組成Fig.1 Composition of bacteria (a) and fungi (b) in 4 samples based on phylum level

由圖1可知，4個(gè)樣品共檢測(cè)出4個(gè)主要細(xì)菌門(mén)和1個(gè)真菌門(mén)，細(xì)菌門(mén)分別是分別為厚壁菌門(mén)（Firmicutes）、變形桿菌門(mén)（Proteobacteria）、放線(xiàn)菌門(mén)（Actinobacteria）、擬桿菌門(mén)（Bacteroides），真菌門(mén)為子囊菌門(mén)（Ascomyctoa），該結(jié)果與寧明等[24]檢測(cè)的發(fā)酵辣椒中在門(mén)水平上細(xì)菌結(jié)果相似。由圖1a可知，4個(gè)樣品均檢測(cè)到厚壁菌門(mén)、變形桿菌門(mén)、放線(xiàn)菌門(mén)，但是相對(duì)豐度差異較大，其中GY樣品的微生物組成與其他樣品差異較大，變形桿菌門(mén)（61.29%）是GY樣品中的優(yōu)勢(shì)菌門(mén)，但是其余3個(gè)樣品中該菌門(mén)占比低，其在DF、LL、ZY樣品中占比分別為0.001%、0.06%、0.64%；厚壁菌門(mén)為DF（99.79%）、LL（99.91%）、ZY（99.32%）樣品中主要優(yōu)勢(shì)菌門(mén)，其余的細(xì)菌門(mén)組成仍有一定差異，DF、ZY樣品中未檢測(cè)到擬桿菌門(mén)。由圖1b可知，門(mén)水平上，4個(gè)樣品真菌組成中只有一個(gè)子囊菌門(mén)，真菌豐度無(wú)差異。由此可知，在門(mén)水平上，貴州不同地區(qū)“生花”糟辣椒的細(xì)菌組成存在差異，GY樣品的細(xì)菌相對(duì)豐度高，變形桿菌門(mén)、厚壁菌門(mén)占優(yōu)勢(shì)，微生物種類(lèi)比其余3個(gè)樣品更為豐富。

2.2.2 基于屬水平樣品中細(xì)菌菌群結(jié)構(gòu)分析

基于屬水平樣品中細(xì)菌的組成及相對(duì)含量見(jiàn)表2。

表2 基于屬水平樣品中細(xì)菌菌群組成及相對(duì)含量Table2 Composition and relative contents of bacterial flora in samples based on genus level

由表2可知，4個(gè)樣品由于發(fā)酵條件、貯藏環(huán)境不同，細(xì)菌菌落組成和比例均不同，共檢測(cè)出13個(gè)主要細(xì)菌屬，位于前5為的菌屬為乳桿菌屬（Lactobacillus）、海洋桿菌屬（Oceanobacillus）、葡萄球菌屬（Staphylococcus）、阿菲彼亞桿菌屬（Afipia），與前期的研究結(jié)果一致，乳桿菌屬、海洋桿菌屬、紅球菌屬均為發(fā)酵的優(yōu)勢(shì)菌屬[25-27]。GY樣品中的細(xì)菌多樣性比其余3個(gè)樣品的豐富，主要優(yōu)勢(shì)菌屬為阿菲彼亞桿菌屬（Afipia）（48.18%）、魏斯氏菌屬（Weissella）（11.74%）、Lactobacillus（9.96%）、其他細(xì)菌屬（12.43%），在其余3個(gè)樣品中相對(duì)含量較低（0.05%～0.46%），DF樣品中未檢測(cè)出；DF樣品的主要優(yōu)勢(shì)菌屬為Oceanobacillus（51.12%）、Staphylococcus（26.61%），但其余3個(gè)樣品中Oceanobacillus的相對(duì)含量為0.03%～1.76%，Staphylococcus相對(duì)含量為0.03%～0.68%，與DF樣品差異大；LL、ZY樣品的細(xì)菌屬相較為單一，優(yōu)勢(shì)菌屬為L(zhǎng)actobacillus，相對(duì)含量分別為99.74%、98.39%；乳桿菌屬是一類(lèi)厭氧菌，在發(fā)酵過(guò)程中可改善風(fēng)味，產(chǎn)生有機(jī)酸和蛋白酶等[28-31]。由此可知，貴州不同地區(qū)的“生花”糟辣椒細(xì)菌屬構(gòu)成差異性大，由于糟辣椒制作完成后放置于發(fā)酵壇中，食用時(shí)開(kāi)蓋取出，導(dǎo)致不同的貯藏環(huán)境和條件導(dǎo)致樣品接觸到的微生物種類(lèi)不一，并且采集樣品時(shí)，LL、ZY樣品均已發(fā)生“生花”，由于優(yōu)勢(shì)菌屬為乳桿菌屬，表明占比較低的其他細(xì)菌或真菌屬是導(dǎo)致糟辣椒出現(xiàn)白色璞膜的主要微生物。

2.2.3 基于屬水平樣品中真菌菌群結(jié)構(gòu)分析

4個(gè)糟辣椒樣品真菌在屬水平上的組成及相對(duì)含量見(jiàn)表3。

表3 基于屬水平樣品中真菌菌群組成及相對(duì)豐度Table3 Composition and relative content of fungi flora in samples based on genus level

由表3可知，4個(gè)樣品中真菌屬的菌群結(jié)構(gòu)和各有差異，共檢測(cè)到3個(gè)主要真菌屬和1個(gè)其他未分類(lèi)的菌屬，分別為漢斯德巴氏酵母菌屬（Debaryomyces）、異常威克漢姆酵母屬（Wickerhamomyces）、畢赤酵母屬（Pichia）、伊薩酵母屬（Issatchenkia）。DF樣品的真菌多樣性相對(duì)其余3個(gè)樣品豐富，優(yōu)勢(shì)真菌屬為異常威克漢姆酵母屬（Wickerhamomyces）（85.41%），其余3個(gè)樣品中僅有GY樣品檢測(cè)出（1.88%），LL和ZY樣品均未檢出該菌屬，德巴利氏酵母屬（Debaryomyces）（14.11%）是DF樣品中第二位優(yōu)勢(shì)菌屬，但在其余樣品中未檢出，表明DF樣品與其他樣品差異性最大；GY樣品中檢測(cè)出的真菌屬有3個(gè)，分別為伊薩酵母屬（Issatchenkia）（95.15%）、畢赤酵母屬（Pichia）（2.97%）、異常威克漢姆酵母屬（Wickerhamomyces）（1.88%）；LL、ZY樣品真菌組成較為單一，但其優(yōu)勢(shì)真菌屬不同，LL樣品的優(yōu)勢(shì)菌屬為Pichia（99.97%）；ZY樣品的優(yōu)勢(shì)菌屬為伊薩酵母屬（Issatchenkia）（99.99%）。綜上可知，貴州不同地區(qū)收集的“生花”糟辣椒樣品真菌組成差異性大，其中DF樣品真菌多樣性豐富，LL、ZY樣品真菌組成較為單一，由于樣品已“生花”，初步認(rèn)為菌屬I(mǎi)ssatchenkia、Pichia、Wickerhamomyces、Debaryomyces與糟辣椒產(chǎn)生異味、“生花”等現(xiàn)象有一定的關(guān)聯(lián)。

2.3 樣品中微生物的鑒定

2.3.1 真菌的分子生物學(xué)鑒定

由圖2可知，以真菌基因組DNA為模板，引物為ITS1及ITS4，通過(guò)真菌的特異性PCR反應(yīng)擴(kuò)增，用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)均擴(kuò)增產(chǎn)生了單一的DNA片段條帶，與DNA Marker對(duì)比顯示，堿基片段在500～750 bp之間。菌株LJS1-LJS12序列長(zhǎng)度分別為537 bp、576 bp、605 bp、630 bp、624 bp、632 bp、672 bp、705 bp、712 bp、678 bp、681 bp、692 bp，均符合真菌ITS序列長(zhǎng)度。

圖2 樣品中篩選真菌的ITS序列PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖Fig.2 Electrophoresis of PCR amplification products of ITS sequence of screened fungi from samples

基于ITS序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)見(jiàn)圖3。由圖3可知，菌株LJS1、LJS2、LJS3與數(shù)據(jù)庫(kù)中Pichia kudriavzevii（GenBank號(hào)LC389035.1）同源性最高（100%），聚于相同分支，親緣關(guān)系最近，菌株LJS1、LJS2、LJS3被鑒定為庫(kù)德里阿茲威氏畢赤酵母（Pichia kudriavzevii）；該三菌株來(lái)自ZY樣品，與菌落形態(tài)判定的結(jié)果相符。菌株LJS4、LJS5、LJS6、LJS7與數(shù)據(jù)庫(kù)中的Pichia membranifaciens（GenBank序列號(hào)AY349435.1）同源性最高（100%），4株菌被鑒定為膜璞畢赤酵母（Pichia membranifaciens）。菌株LJS10與數(shù)據(jù)庫(kù)中的Debaryomyces hansenii（GenBank序列號(hào)KY105881.1）同源性最高（100%），菌株LJS10鑒定為漢遜德巴利酵母（Debaryomyces hansenii），來(lái)源于DF樣品；菌株LJS8、LJS9、LJS11、LJS12同數(shù)據(jù)庫(kù)中的Wickerhamomyces anomalus（GenBank序列號(hào)KP132887.1）同源性最高（100%），鑒定為異常威克漢姆酵母（Wickerhamomyces anomalus）。

圖3 基于ITS序列樣品中篩選真菌的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.3 Phylogenetic tree of screened fungi in samples based on ITS sequence

2.3.2 細(xì)菌分子生物學(xué)鑒定

由圖4可知，電泳檢測(cè)結(jié)果顯示糟辣椒分離細(xì)菌在約1500bp處有目的條帶。菌株XY1～XY3序列長(zhǎng)度在1435bp、1 443 bp、1 421 bp，均符合細(xì)菌16S rDNA序列長(zhǎng)度。

圖4 篩選細(xì)菌16S rDNA序列PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖Fig.4 Electrophoresis of PCR amplification products of 16S rDNA sequence of screened bacteria

將16S rDNA序列通過(guò)BLAST比對(duì)，并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，見(jiàn)圖5。由圖5可知，細(xì)菌XY1、XY2的基因序列與數(shù)據(jù)庫(kù)中的布氏假單胞菌（Pseudomonas brenneri）（GenBank號(hào)JX417436.1）同源性最高，從進(jìn)化樹(shù)分支可以看出XY1、XY2菌株同Pseudomonas brenneri處于同一分支上，親緣關(guān)系最近，根據(jù)形態(tài)特征及16S rDNA序列進(jìn)化分析鑒定，可以確認(rèn)XY1、XY2屬于布氏假單胞菌，分離于GY、DF樣品。細(xì)菌XY3序列與數(shù)據(jù)庫(kù)中的雅馬納假單胞菌（Pseudomonas yamanorum）（GenBank號(hào)MG269619.1）同源性最高，從進(jìn)化樹(shù)分支上看，XY3同Pseudomonas yamanorum在一個(gè)分支上，親緣關(guān)系最近，根據(jù)形態(tài)特征及16S rDNA序列進(jìn)化分析鑒定，可以確認(rèn)XY3屬于雅馬納假單胞菌，從GY樣品中分離。

圖5 基于16S rDNA序列篩選細(xì)菌的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.5 Phylogenetic tree of screened bacteria based on 16S rDNA sequence

2.4 篩選菌株發(fā)酵特性試驗(yàn)

選取上述篩選到不同種的菌株進(jìn)行發(fā)酵特性試驗(yàn)，包含糖發(fā)酵試驗(yàn)和腐敗試驗(yàn)，糖發(fā)酵試驗(yàn)主要用于研究酵母菌對(duì)糖的利用能力，酵母菌在無(wú)氧氣條件下能分解糖類(lèi)，產(chǎn)生各種有機(jī)酸、氣體和其他產(chǎn)物[32]。

由表4可知，菌株LJS10對(duì)所有糖類(lèi)有較好分解能力；菌株LJS1、LJS4結(jié)果一致，能利用果糖、乳糖、半乳糖、蔗糖、海藻糖、葡萄糖，不能利用木糖和麥芽糖；菌株LJS11只能利用果糖、木糖、葡萄糖、麥芽糖，其余4種糖不能利用；兩株細(xì)菌XY1、XY3的糖發(fā)酵試驗(yàn)結(jié)果相同，對(duì)木糖、乳糖、半乳糖、麥芽糖不能利用。腐敗試驗(yàn)結(jié)果表明，2株細(xì)菌均呈陰性，4株酵母菌皆產(chǎn)酸、產(chǎn)黏，可能是導(dǎo)致糟辣椒液黏稠的腐敗菌，除菌株LJS11不產(chǎn)膜外，其余3株酵母菌皆具有一定的產(chǎn)膜能力，可能是引起糟辣椒產(chǎn)生“生花”現(xiàn)象的真菌。菌株LJS10、LJS11在產(chǎn)氨試驗(yàn)表現(xiàn)為陽(yáng)性，表明有可能同糟辣椒異味的形成有關(guān)，菌株LJS1、LJS4為陰性，結(jié)果與王斌[33]的研究結(jié)果相符。產(chǎn)酸菌株導(dǎo)致糟辣椒酸化，產(chǎn)氨的菌株會(huì)產(chǎn)生異味，產(chǎn)膜、產(chǎn)黏的菌株導(dǎo)致糟辣椒“生花”產(chǎn)膜，降低糟辣椒的品質(zhì)。

表4 篩選菌株發(fā)酵特性試驗(yàn)結(jié)果Table4 Experimental results of fermentation characteristics of screened strains

2.5 回接試驗(yàn)驗(yàn)證

為進(jìn)一步確認(rèn)引起糟辣椒“生花”的主要微生物，采用60Co-γ射線(xiàn)3 kGy劑量γ輻照對(duì)糟辣椒進(jìn)行殺菌后，無(wú)菌條件下接入以上4種菌，28 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)一段時(shí)間，辣椒腐敗現(xiàn)象見(jiàn)表5。

表5 糟辣椒“生花”腐敗現(xiàn)象Table5 Spoilage phenomenon of "Shenghua" fermented pepper

由表5可知，糟辣椒接菌培養(yǎng)72 h后，4種糟辣椒均有產(chǎn)氣現(xiàn)象，其中接種菌株LJS1、LJS10、LJS4的糟辣椒，發(fā)酵產(chǎn)氣速度明顯優(yōu)于其他菌株。繼續(xù)培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)，接種菌株LJS1、LJS10、LJS4的糟辣椒分別于第10 天、第12天、第14天有璞膜“生花”現(xiàn)象產(chǎn)生，并伴有異味，其中接種菌株LJS1的糟辣椒表現(xiàn)出較快地“生花”；細(xì)菌組XY1、XY3有輕微的產(chǎn)氣現(xiàn)象出現(xiàn)，氣味、形態(tài)無(wú)明顯變化；CK組樣品在第12天形態(tài)正常，其他無(wú)明顯變化。通過(guò)回接試驗(yàn)的結(jié)果可驗(yàn)證分離獲得的4株酵母菌均是導(dǎo)致糟辣椒貯藏過(guò)程中發(fā)生“生花”現(xiàn)象的主要菌株。

3 結(jié)論

采用Miseq高通量測(cè)序技術(shù)、傳統(tǒng)培養(yǎng)分離法結(jié)合引物內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（internal transcribed spacer，ITS）序列分析技術(shù)對(duì)貴州4個(gè)地區(qū)的“生花”糟辣椒中微生物進(jìn)行多樣性分析和菌種分離鑒定，并對(duì)分離菌株進(jìn)行特性試驗(yàn)及回接試驗(yàn)，確定引起糟辣椒“生花”現(xiàn)象的主要微生物。結(jié)果表明，獲得細(xì)菌和真菌的有效序列分別為973 06條、288 570條，OTU覆蓋率在99.9%以上。在門(mén)水平上，4個(gè)樣品共檢測(cè)出4個(gè)主要細(xì)菌門(mén)和1個(gè)真菌門(mén)；在屬水平上，4個(gè)樣品共檢測(cè)出13個(gè)主要細(xì)菌屬及3個(gè)主要真菌屬。引起糟辣椒出現(xiàn)“生花”現(xiàn)象的4株酵母菌分別為：庫(kù)德里阿茲威氏畢赤酵母（Pichia kudriavzevi）、膜璞畢赤酵母（Pichia membranifaciens）、漢遜德巴利酵母（Debaryomyces hansenii）、異常威克漢姆酵母（Wickerhamomyces anomalus）。本實(shí)驗(yàn)可為后期研究提供試驗(yàn)基礎(chǔ)及供試菌株，為糟辣椒綠色、安全的保鮮技術(shù)的開(kāi)發(fā)提供有力的保障。應(yīng)該提出防控“生花”現(xiàn)象的建議措施。