高加索乳桿菌功能活性研究進(jìn)展

王曉萌，高 潔，韓張鵬，張 卓，劉 軒，宋新宇

（河北農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科技學(xué)院，河北 保定 071000）

開菲爾是原產(chǎn)自高加索地區(qū)的一種傳統(tǒng)含酒精發(fā)酵乳飲料，且風(fēng)味和口感獨(dú)特，有“發(fā)酵乳制品中之香檳”的美譽(yù)[1]，因而深受廣大國家和地區(qū)消費(fèi)者的喜愛。高加索乳桿菌（Lactobacillus kefiri）是開菲爾發(fā)酵乳中的主要組成成分之一[2]，也是公認(rèn)安全的乳桿菌[3]，具有悠久的食用歷史，在益生菌的臨床使用上起到指導(dǎo)作用[3]。近年來，對(duì)L.kefiri功能活性研究較多，特別是抗氧化活性、免疫調(diào)節(jié)活性、降低膽固醇和調(diào)節(jié)腸道菌群活性等?；谝延醒芯?，本文綜述了L.kefiri主要功能活性研究進(jìn)展，并從作用途徑或物質(zhì)基礎(chǔ)的角度進(jìn)行歸納總結(jié)，以期為L.kefiri的進(jìn)一步開發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1 抗氧化活性

乳桿菌的抗氧化性已被諸多體內(nèi)外試驗(yàn)證實(shí)，抗氧化活性也是多種功能活性的作用的基礎(chǔ)機(jī)制。不同的乳桿菌具抗氧化性強(qiáng)弱不同[4]，具有抗氧化活性的乳桿菌將有潛力開發(fā)為益生菌資源。研究表明，L.kefiri具有顯著的抗氧化活性。

1.1 體內(nèi)抗氧化研究

體內(nèi)抗氧化研究實(shí)驗(yàn)通常以小鼠作為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，使小鼠口服L.kefiri作為干預(yù)物展開實(shí)驗(yàn)，最終檢測小鼠相關(guān)代謝指標(biāo)或身體機(jī)能指標(biāo)作為判斷抗氧化能力的依據(jù)。GHONEUM M等[5]以32只來自埃及亞歷山大大學(xué)醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室的小鼠口服一種主要由L.kefiri組成的天然混合物（一種新型開菲爾制品）（probioticsfermentation technology，PFT），測定了小鼠肝臟、大腦和血清部位的總抗氧化能力（total antioxidant capacity，TAC）和抗羥基自由基（anti-hydroxyl radical，AHR）等指標(biāo)，研究結(jié)果表明，PFT影響小鼠的氧化還原穩(wěn)態(tài)，逆轉(zhuǎn)了TAC和AHR含量的下降，膳食中添加PFT可有效調(diào)節(jié)小鼠的年齡相關(guān)氧化應(yīng)激并增強(qiáng)小鼠抗氧化水平。ERDOGAN F S等[6]以BALB/c小鼠作為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物測定L.kefiri的抗氧化性能，測定結(jié)果表明，血清總抗氧化狀態(tài)（total antioxidant status，TAS）增高、總氧化狀態(tài)（total oxidant status，TOS）降低、丙二醛（malondialdehyde，MDA）降低和髓體過氧化物酶（myelo-peroxidase，MPO）降低，L.kefiri體現(xiàn)了一定的抗氧化能力。

1.2 體外抗氧化研究

體外抗氧化研究試驗(yàn)主要是通過測定自由基清除率前后變化等重要試驗(yàn)指標(biāo)，評(píng)估L.kefiri的抗氧化能力大小，可實(shí)現(xiàn)更簡單、更方便和更詳細(xì)的分析，但由體外實(shí)驗(yàn)研究的結(jié)果推知到完整生物體的扔具有挑戰(zhàn)性[7]。AYRANC U G等[8]采用L.kefiri蛋白酶水解消化酪蛋白、面筋和大豆蛋白，這些大的蛋白質(zhì)可能被水解成更短的肽或氨基酸，其抗氧化活性是通過產(chǎn)酶和食品發(fā)酵的過程來實(shí)現(xiàn)的。實(shí)驗(yàn)表明，L.kefiri發(fā)酵能顯著促進(jìn)酪蛋白的水解并提高1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基的清除和還原力，從而提高食物蛋白抗氧化能力。趙彤等[4]對(duì)L.kefiriKL22進(jìn)行自由基清除實(shí)驗(yàn)，同時(shí)測定滅活菌體和活性菌體，當(dāng)菌體濃度為107CFU/mL時(shí)，菌株KL22對(duì)DPPH·、O2-·、·OH均有不同程度的清除作用，其中菌株KL22對(duì)的DPPH自由基清除率最高，活菌組可達(dá)到70.34%，由此可見L.kefiriKL22具有較強(qiáng)的抗氧化能力。

2 免疫調(diào)節(jié)活性

免疫調(diào)節(jié)能力是乳桿菌常見的功能活性，乳桿菌對(duì)機(jī)體免疫具有雙向調(diào)節(jié)活性，既能夠上調(diào)增強(qiáng)免疫力，也能夠下調(diào)抑制過度免疫[9]?；谝延醒芯?，L.kefiri已經(jīng)被證實(shí)具有良好的免疫調(diào)節(jié)能力，L.kefiri菌體和活性代謝產(chǎn)物免疫調(diào)節(jié)研究的研究對(duì)象、實(shí)驗(yàn)方法及相關(guān)結(jié)論見表1。

表1 高加索乳桿菌菌體和活性代謝產(chǎn)物免疫調(diào)節(jié)能力研究進(jìn)展Table1 Research progress on immunomodulatory ability of Lactobacillus kefiri and active metabolites

2.1 菌體免疫調(diào)節(jié)能力

L.kefiri可以通過自身菌體調(diào)節(jié)免疫，L.kefiri在抗過敏和免疫調(diào)節(jié)及保護(hù)方面有著重要作用，HONG S W等[10]研究表明，使雌性BALB/c小鼠口服分離自開菲爾顆粒的熱滅活的馬乳酒樣乳桿菌（Lactobacillus kefiranofaciens）和L.kefiri，可使輔助性Th1細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞因子的水平升高，Th2細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞因子的水平降低，Th1/Th2平衡向Th1主導(dǎo)地位傾斜，并通過減少活化CD19+B細(xì)胞，補(bǔ)體系統(tǒng)和成分的下調(diào)等作用有效抑制機(jī)體對(duì)卵清蛋白（ovalbumin，OVA）的免疫球蛋白IgE的產(chǎn)生，說明L.kefiri在抗Ι型過敏活性中發(fā)揮著重要作用。肖雪筠等[11]的研究通過擴(kuò)大培養(yǎng)和活力測定，發(fā)現(xiàn)L.kefiri能夠部分緩解環(huán)磷酰胺對(duì)小鼠免疫抑制作用，調(diào)節(jié)Th1/Th2平衡，從而調(diào)節(jié)體液免疫和細(xì)胞免疫平衡。GHONEUM M等[12]提及L.kefiri可選擇性的誘導(dǎo)人胃腺癌細(xì)胞系（gastric cancer cells，AGS）和小鼠乳腺癌細(xì)胞系（breast cancer cells）4T1凋亡，即L.kefiri通過膜穿孔機(jī)制誘導(dǎo)癌細(xì)胞發(fā)揮凋亡作用，可達(dá)到凋亡率66.3%的峰值，L.kefiri可以誘導(dǎo)人多藥耐藥（multidrugresistant，MDR）髓系白血?。╩yeloidleukemia）細(xì)胞HL60/AR凋亡，凋亡率可達(dá)67.5%[13]，從而起到免疫調(diào)節(jié)和保護(hù)作用。

2.2 活性代謝產(chǎn)物免疫調(diào)節(jié)能力

菌體細(xì)胞的活性代謝產(chǎn)物能夠刺激機(jī)體產(chǎn)生各類與免疫相關(guān)的細(xì)胞因子，發(fā)揮調(diào)節(jié)免疫的作用[14]，L.kefiri作為乳桿菌的重要組成成分，并有成為益生菌的潛力，其活性代謝產(chǎn)物是L.kefiri形成免疫機(jī)制的重要方式之一。

2.2.1 S層蛋白的免疫調(diào)節(jié)能力

L.kefiri可以通過S層蛋白（S-layer protein，SLP）來調(diào)節(jié)免疫，SLP是一種由亞基組成的（糖）蛋白包膜，亞基自組裝形成一個(gè)二維晶格，覆蓋在不同種類的細(xì)菌和古細(xì)菌的表面[15]，乳桿菌SLP具有誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞活化應(yīng)答、影響菌體表面性質(zhì)、參與菌體黏附腸道過程和抑制病原菌對(duì)腸道入侵等作用[16]。MALAMUDM等[17]實(shí)驗(yàn)中在Ca2+作用下與只有脂多糖處理的巨噬細(xì)胞相比，脂多糖和SLP孵育的巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的IL-6、CD40和CD86水平更高，這說明SLP上存在的末端聚糖可協(xié)同脂多糖誘導(dǎo)成熟巨噬細(xì)胞的免疫刺激活性，進(jìn)一步證明L.kefiri的S層糖蛋白以Ca2+依賴的方式增強(qiáng)了脂多糖誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞應(yīng)答。此外，SLP能夠通過巨噬細(xì)胞誘導(dǎo)的C型凝集素受體對(duì)聚糖部分識(shí)別并觸發(fā)抗原呈遞細(xì)胞的成熟來增強(qiáng)OVA的特異性免疫應(yīng)答。GOLOWCZYC M A等[18]研究SLP對(duì)L.kefiri和解脂酵母（Saccharomyces lipolytica）間的共聚作用的影響，發(fā)現(xiàn)氯化鋰處理去除SLP后，二者間的共聚率明顯下降，說明SLP在一定程度上決定了菌體黏附力的大小，間接調(diào)控免疫調(diào)節(jié)作用的強(qiáng)弱。MALAMUD M等[19]利用野生型和C57BL/6-Tg（TcraTcrb）425Cbn/J（OT-II）小鼠巨噬細(xì)胞RAW 264.7模型表明不同L.kefiri菌株的糖基化SLP可以通過識(shí)別其多糖誘導(dǎo)抗原呈遞細(xì)胞的活化。GOLOWCZYC M A等[20]經(jīng)驗(yàn)證，沙門氏菌（Salmonella enterica）與可凝集酸乳桿菌共孵育顯著降低了其對(duì)Caco-2/TC-7細(xì)胞的侵襲能力，而非凝集酸乳桿菌菌株則沒有此現(xiàn)象，經(jīng)L.kefiriSLP預(yù)處理的凝集菌和非凝集菌均不能侵入Caco-2/TC-7細(xì)胞，表明L.kefiri的分泌物及SLP能夠阻擋腸炎沙門氏菌的侵襲。

2.2.2 胞外多糖的免疫調(diào)節(jié)能力

L.kefiri可以通過胞外多糖（extracellular polysaccharide，EPS）來調(diào)節(jié)免疫，EPS在其益生作用中起重要作用，L.kefiri胞外多糖的膠黏性可增強(qiáng)機(jī)體的免疫保護(hù)作用、免疫刺激活性和抗腫瘤機(jī)制。XIU L X等[21]對(duì)L.kefiriWXD029的EPS進(jìn)行體外實(shí)驗(yàn)表明，EPS可顯著增強(qiáng)RAW264.7細(xì)胞的增殖和吞噬活性，誘導(dǎo)IL-6等細(xì)胞因子的產(chǎn)生。在體內(nèi)，EPS佐劑不僅能提高金黃色葡萄球菌抗體滴度，顯著增強(qiáng)T細(xì)胞增殖，還能誘導(dǎo)較強(qiáng)的Th1、Th2和Th17細(xì)胞混合反應(yīng)。RAJOKA M S R等[22]對(duì)L.kefiriMSR101進(jìn)行細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)等體外抗腫瘤實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)其對(duì)HT29結(jié)腸癌細(xì)胞生長具有抑制能力，并可上調(diào)細(xì)胞凋亡蛋白酶的表達(dá)，未來可開發(fā)L.kefiriMSR101的EPS作為一種治療結(jié)腸癌并提高免疫力的外用藥物。

因此認(rèn)為SLP具有菌體黏附和誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞活化等作用[23]，EPS的膠黏性及抗腫瘤等作用對(duì)于微生物免疫調(diào)節(jié)發(fā)揮著重要作用[24]，可以進(jìn)一步運(yùn)用分子技術(shù)從基因?qū)用嫒嫜芯縇.kefiri的SLP和EPS，揭示SLP和EPS的作用機(jī)制。

3 降低膽固醇活性

肥胖在大多數(shù)國家已成為地方病，目前被認(rèn)為是代謝綜合征的重要危險(xiǎn)因素，降低膽固醇是抗肥胖的重要途徑之一，迄今為止，研究人員認(rèn)為益生菌抗肥胖作用更易為大眾所接受。L.kefiri具有較強(qiáng)降低膽固醇能力。L.kefiri是可以高效、高對(duì)映選擇性地合成6-氯代-（3R，5S）-二羥基己酸叔丁酯的微生物菌株，該物質(zhì)是醫(yī)藥工業(yè)生產(chǎn)抗膽固醇藥物3-羥基-3-甲基戊二酸單酰輔酶A（3-hydroxy-3-methyl glutaryl coenzyme A，HMG-CoA）還原酶抑制劑的重要手性結(jié)構(gòu)單元[25]。KIM D H等[26]以L.kefiriDH5為實(shí)驗(yàn)材料，采用人工胃腸環(huán)境等方法對(duì)13株開菲爾實(shí)驗(yàn)室分離菌株進(jìn)行生存試驗(yàn)，結(jié)果表明L.kefiriDH5上調(diào)了附屬脂肪組織中過氧化物酶體增殖物激活受體α（peroxisome proliferators-activated receptors α，PPARα）、脂肪酸結(jié)合蛋白4（fatty acid-binding protein 4，F(xiàn)ABP4）和肉堿脂酰轉(zhuǎn)移酶1（carnitine palmitoyl transferase 1，CPT1）的表達(dá)（分別為2.29-、1.77-和2.05倍），并降低了51.6%的膽固醇，作用十分顯著。趙彤等[27]將L.kefiriKL22接種于膽固醇的改良MRS培養(yǎng)基中，滅活狀態(tài)作用48 h后膽固醇降解率為35.79%。經(jīng)文獻(xiàn)檢索后發(fā)現(xiàn)，膽固醇降解率達(dá)到40%以上的菌株寥寥無幾，由此可知L.kefiri的膽固醇降解能力較強(qiáng)[28]。

4 調(diào)節(jié)腸道菌群功能

腸道菌群調(diào)節(jié)功能是乳桿菌最常見的功能活性，通過外源性的補(bǔ)充乳桿菌，可以調(diào)節(jié)和修復(fù)腸道菌群，保持平衡的腸道微環(huán)境[29]。L.kefiri也擁有較強(qiáng)的調(diào)節(jié)腸道菌群組成的能力。KIM D H等[26]通過給雄性C57BL/6小鼠口服L.kefiriDH5一個(gè)月后，觀察到受試者腸道菌群結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，在細(xì)菌總數(shù)無明顯差異的情況下，高脂飲食（high fat diet，HFD）喂養(yǎng)組的擬桿菌門（Bacteroides）、變形菌門（Proteobacteria）和腸桿菌門（Enterobacteriaceae）的數(shù)量顯著增加，HFD-DH5組在HFD喂養(yǎng)組中表現(xiàn)出明顯較低的Bacteroides、Proteobacteria和Enterobacteriaceae，有益菌增加，表明L.kefiriDH5能夠顯著正向調(diào)節(jié)HFD喂養(yǎng)小鼠的腸道微生態(tài)。

5 其他功能活性

L.kefiri還具有抗生素敏感性[30]、黏附性[31]、自凝聚性[32]等功能特性，NEISH A S等[33]研究發(fā)現(xiàn)，在抗生素敏感性研究中，從乳制品中分離出的一株L.kefiri對(duì)卡那霉素和四環(huán)素耐藥，但對(duì)其他抗生素敏感，并且能夠抑制病原菌的生長，將在益生菌的臨床使用上起到指導(dǎo)作用。菌體表面疏水性能力的大小反映菌體體內(nèi)定植的能力強(qiáng)弱的大小[34]，L.kefiriKL22對(duì)三種有機(jī)溶劑中三氯甲烷的吸附能力最強(qiáng)，高達(dá)98.5%，表明KL22具有較高的疏水性。趙彤等[27]對(duì)KL22的自凝聚能力分析，研究表明菌液自凝集率的上升趨勢(shì)并雖不一條直線，但具有明顯趨勢(shì)，在1 h內(nèi)自凝聚率17.18%，5 h后自凝聚率達(dá)到21.17%，有研究乳桿菌自凝聚能力實(shí)驗(yàn)表明接種4 h后的自凝聚率范圍為7.2%～28.1%[35]，由此表明L.kefiri具有較好的自凝聚能力。

6 結(jié)論與展望

該文主要探討了L.kefiri的抗氧化活性、免疫調(diào)節(jié)活性、降脂活性、調(diào)節(jié)腸道菌群活性和其他功能活性，綜述分析表明其具備諸多良好的功能特性，具有較好的益生功能。L.kefiri分離自傳統(tǒng)發(fā)酵乳制品中，來源可靠、安全性高，在發(fā)酵菌種、益生菌種資源開發(fā)中有可挖掘的潛力，有待于進(jìn)一步研究，以期應(yīng)用于高活菌數(shù)發(fā)酵乳及功能性食品等的制備。