精子DNA碎片率與男性不育及其配偶早期復(fù)發(fā)性流產(chǎn)的關(guān)系

羅英 徐楗熒 林小民 金瀧 曲仕浩

珠海市婦幼保健院1生殖醫(yī)學(xué)中心，2男性生殖健康科（廣東珠海519000）

目前，由于受到生活方式、飲食習(xí)慣，環(huán)境及壓力等因素影響，尤其空氣污染與男性DNA 損傷、精子形態(tài)異常及精子性能下降有關(guān)，導(dǎo)致男性不育的發(fā)病率呈上升趨勢(shì)，且已經(jīng)成為臨床上亟待解決的問題［1-2］。但是，男性的生育指標(biāo)檢測(cè)方法貧乏，臨床主要通過檢測(cè)精液參數(shù)來反映精子質(zhì)量，精子DCXR 蛋白表達(dá)和精子凋亡率作為男性不育癥診斷的實(shí)驗(yàn)室依據(jù)［3］。在臨床上15%左右的男性不育患者其精液參數(shù)檢查結(jié)果正常［4］。因此，通過精液參數(shù)檢查評(píng)估男性的生育能力存在一定不足之處。隨著生殖醫(yī)學(xué)研究的深入，學(xué)者們發(fā)現(xiàn)精子染色體結(jié)構(gòu)的完整性與男性不明原因不育及其配偶早期復(fù)發(fā)性流產(chǎn)存在密切關(guān)聯(lián)。精子DNA 碎片率（DNA fragmentation index，DFI）作為臨床上反映精子遺傳物質(zhì)完整性的重要指標(biāo)，影響男性的生育功能［5］。因此，本研究擬探討DFI與男性不育及其配偶早期復(fù)發(fā)性流產(chǎn)的關(guān)系。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象及分組 選取2018年12月至2020年12月在本中心進(jìn)行DFI 檢測(cè)的330 名男性，男方年齡≤45 歲，精子濃度＞15 × 106/mL；女方年齡≤40 歲。依據(jù)其配偶既往生育情況分為不育組（A組n=96）、配偶早期復(fù)發(fā)性流產(chǎn)組（B 組n=86）及正常生育組（C 組n= 148）。納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）B 組：配偶有2 次或2 次以上孕早期自然流產(chǎn)史，且病因不明確；（2）夫婦雙方在生殖系統(tǒng)上無異常；（3）女性在內(nèi)分泌、婦科等檢查中均無異常；（4）男方6 個(gè)月內(nèi)未服用影響檢測(cè)結(jié)果的藥物。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）存在生殖系統(tǒng)缺陷或發(fā)育不良；（2）化療或放療；（3）合并有心、肝、腎等嚴(yán)重原發(fā)性疾?。唬?）重度少、弱、畸形精子癥。

1.2 精子DFI檢測(cè)方法 受試者采取手淫的方法采取標(biāo)本，禁欲時(shí)間：2 ～7 d。精液常規(guī)：采用SAS-Ⅱ型精子質(zhì)量分析系統(tǒng)（賽司醫(yī)療科技北京有限公司）對(duì)精子濃度、精子的活力力及前向運(yùn)動(dòng)精子等參數(shù)進(jìn)行分析。精子形態(tài)采用Diff-Quik 染色，每位患者制備兩張形態(tài)染色片，1 000×油鏡下觀察兩張形態(tài)染色片，以最接近的整數(shù)報(bào)告平均正常形態(tài)精子百分率。精液檢測(cè)采用WHO 精液檢測(cè)第5 版的標(biāo)準(zhǔn)。精子DNA 完整性：本次檢測(cè)采用的是精子染色質(zhì)擴(kuò)散實(shí)驗(yàn)（Sperm Nucleus DNA Inetegrity Kit，SCD），深圳華康生物醫(yī)學(xué)工程有限公司提供試劑盒，具體操作參考說明書。

1.3 觀察結(jié)果及判斷 染色質(zhì)斷裂較多的精子，染色后僅能觀察到深染的精子頭部，或僅存在較少的核暈；而精子染色體結(jié)構(gòu)，保持相對(duì)完整的精子可以清晰看到染色較深的精子頭部，還具有明顯的核暈環(huán)。依據(jù)光暈與精子頭部核心直徑的比例，分析判斷精子DNA 損傷程度，若光暈直徑≥精子頭部核心的1/3 為正常精子，否則為異常精子。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 數(shù)據(jù)應(yīng)用SPSS 22.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間比較用t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以例（%）表示，組間比較用χ2檢驗(yàn)。檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)取雙側(cè)α = 0.05，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組精液常規(guī)比較 三組年齡比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；A 組和B 組患者精子濃度、精子活力及前向運(yùn)動(dòng)精子（PR）均低于C 組（P＜0.01），畸形率高于C組（P＜0.01，表1）。

表1 各組精液常規(guī)比較Tab.1 The comparison of sperm parametersin each group ±s

表1 各組精液常規(guī)比較Tab.1 The comparison of sperm parametersin each group ±s

注：與C 組比較，*P ＜0.01

A組B組C組例數(shù)96 86 148年齡（歲）35.27±7.62 33.50±5.80 33.99±4.62精子濃度（×106/mL）50.63±25.24*65.45±22.86*73.76±20.34精子活力（%）38.31±23.14*55.31±18.67*65.77±14.82前向運(yùn)動(dòng)精子（PR）25.83±19.57*39.58±15.28*49.11±13.81畸形精子（%）96.63±2.22*96.18±1.84*90.34±5.41

2.2 各組DFI 情況比較 A 組、B 組和C 組DFI ≥30%分別為52.1%、46.5%和6.8%；A 和B 組與C 組比較，DFI 顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01，表2）。

表2 各組DFI 情況比較Tab.2 The comparison of DFI in each group 例（%）

3 討論

早期復(fù)發(fā)性流產(chǎn)是在女性孕12 周之前發(fā)生的兩次或兩次以上的自然流產(chǎn)，引起復(fù)發(fā)性流產(chǎn)的原因有很多，比如女性體內(nèi)激素水平因素、生殖道因素、染色體異常及母胎免疫平衡失控等［6-7］。目前在臨床中，主要是對(duì)女性的生殖指標(biāo)進(jìn)行篩查，而由于男性引起的早期復(fù)發(fā)性流產(chǎn)的檢測(cè)指標(biāo)貧乏，且現(xiàn)有的對(duì)于男性檢測(cè)的指標(biāo)對(duì)臨床治療指導(dǎo)意義有限。ROBINSON 等［8］研究表明，精子與卵子在形成受精卵的過程中，精子核內(nèi)具有遺傳編碼的染色體將進(jìn)入其中，將遺傳信息傳遞給子代以確保胚胎的正常發(fā)育，精子DNA 在胚胎發(fā)育的過程中具有重要的作用；當(dāng)精子DNA 受到損傷時(shí)，將會(huì)導(dǎo)致精子染色體結(jié)構(gòu)異常；一定程度上卵子對(duì)受損傷的精子DNA 具有修復(fù)能力，如果損傷程度超過8%，那么卵子的修復(fù)能力不能降低胚胎的流產(chǎn)率；當(dāng)DFI ＞30%早期自然流產(chǎn)率顯著增加，而且在人類輔助生殖技術(shù)中較高的DFI 損傷也會(huì)使臨床妊娠率下降及增加自然流產(chǎn)率。

目前，關(guān)于精子DNA 碎片化的發(fā)生機(jī)制仍不明確，精子的異常凋亡、體內(nèi)氧化應(yīng)激、精子發(fā)生過程中染色質(zhì)的異常組裝等的出現(xiàn)可能是其產(chǎn)生的原因。在精子DNA 損傷程度方面，許多研究發(fā)現(xiàn)，增加的DIF 會(huì)對(duì)受孕率產(chǎn)生不利影響，精子中的DNA 損傷會(huì)影響后代的健康和幸福［9-12］。精子濃度、活力、PR 級(jí)精子，精子存活率和正常形態(tài)精子是反映男性不育的常用指標(biāo)，DFI 是對(duì)精子常規(guī)分析的補(bǔ)充項(xiàng)目。研究顯示［13-16］，DFI 導(dǎo)致精子染色體完整性降低，這可能導(dǎo)致復(fù)發(fā)性流產(chǎn)的發(fā)生；一項(xiàng)對(duì)16 個(gè)研究對(duì)象（包含2 969 對(duì)夫妻）的Meta分析顯示，男性配偶DFI 水平高的婦女復(fù)發(fā)性流產(chǎn)率顯著高于其配偶精子DFI 數(shù)值較低者。而且，精子畸形率升高和精子DFI 升高也會(huì)導(dǎo)致男性不育，升高的DFI 將通過影響受精卵原核的形成導(dǎo)致胚胎質(zhì)量下降。本研究顯示，不育組和配偶早期復(fù)發(fā)性流產(chǎn)組與正常生育組年齡比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；不育組和配偶早期復(fù)發(fā)性流產(chǎn)組患者精子濃度、前向運(yùn)動(dòng)精子及精子活力均低于正常生育組（P＜0.01），畸形率高于正常生育組（P＜0.01）。不育組、配偶早期復(fù)發(fā)性流產(chǎn)組和正常生育組DFI ≥30%分別為52.1%、46.5%和6.8%；不育組和配偶早期復(fù)發(fā)性流產(chǎn)組與正常生育組比較，DFI 顯著升高（P＜0.01）。楊弘毅等［17］研究表明精子濃度、活力、PR 級(jí)精子和正常形態(tài)精子與精子DFI 呈負(fù)相關(guān)，研究結(jié)果與本研究結(jié)果相同。針對(duì)精子參數(shù)與精子DNA 完整性的相關(guān)性，對(duì)此許多學(xué)者進(jìn)行了深入的研究，影響精子參數(shù)，精子DFI 增高的因素多種多樣，馮播等［18］研究表明支原體感染可使男性精子質(zhì)量下降、精子DNA 碎片率增高。本研究由于病例數(shù)量?jī)H為330例，對(duì)此研究數(shù)據(jù)有待更多的研究證實(shí)。同時(shí)本研究觀測(cè)DFI 方法為SCD 法，SCD 方法雖然簡(jiǎn)潔、快速、在普通光學(xué)顯微鏡下即可判斷結(jié)果，不需添置昂貴的實(shí)驗(yàn)設(shè)備，但只能判斷精子DNA 完整性是否受損，沒有定量或定位指標(biāo)用于評(píng)估精子受損的程度。

綜上所述，精子DFI 與男性不育及其配偶早期復(fù)發(fā)性流產(chǎn)有關(guān)，但精子DFI 增高原因多種多樣，機(jī)制復(fù)雜，精子DFI 增高不利于正常受精、胚胎發(fā)育，因此，DFI 檢測(cè)可以用于男性不育的評(píng)估。精子DFI 增高可由睪丸內(nèi)發(fā)生的成熟缺陷和凋亡引起，也可由男性生殖道內(nèi)的OS 引起。它也可以由外部因素引起［19-21］，包括臨床疾病狀態(tài)（精索靜脈曲張、癌癥、糖尿病）、生活方式風(fēng)險(xiǎn)因素（吸煙、酗酒、肥胖）和環(huán)境暴露（空氣污染、殺蟲劑、工業(yè)化學(xué)品）。DFI 的檢測(cè)方法多種多樣；雖然一個(gè)特定的臨界值還沒有被一致確認(rèn)，但目前研究表明20%的閾值被認(rèn)為在有生育能力和不育的男性之間具有很好的區(qū)分準(zhǔn)確性。本研究提出了DFI 檢測(cè)方式及檢測(cè)結(jié)果，不僅在臨床工作中是最簡(jiǎn)便及可行的檢測(cè)方法，而且在輔助生殖過程中可用來評(píng)估種植的成功率，具有一定的臨床意義。多項(xiàng)研究表明對(duì)于包括不明原因和特發(fā)性不孕、RPL、精索靜脈曲張、以及有生活方式/環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)因素的DFI 增高的患者進(jìn)行多種治療干預(yù)措施，如抗氧化療法、改變生活方式、精索靜脈曲張切除術(shù)、以及使用先進(jìn)的精子選擇技術(shù)或睪丸精子進(jìn)行ICSI，減低患者DFI 用以提高其受孕的可能性，這可能也為解決不孕不育原因提供多種研究的方向。