基于生物信息數(shù)據(jù)庫分析含DEP結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)1在子宮內(nèi)膜癌中的表達(dá)和預(yù)后意義

趙車冬，王敏娟，周 萍，陳 葳

(西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院 檢驗科，陜西 西安 710061)

最新的癌癥統(tǒng)計數(shù)據(jù)顯示，子宮內(nèi)膜癌(Endometrial cancer，EC)在美國女性常見腫瘤發(fā)病率中排名第4，也是女性生殖系統(tǒng)最常見的一種上皮性惡性腫瘤，2021年預(yù)計新發(fā)病例達(dá)66 570例，死亡病例達(dá)12 940例[1]。子宮內(nèi)膜癌的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，微衛(wèi)星不穩(wěn)定增加，p53基因突變以及多種信號通路的異常均可影響子宮內(nèi)膜癌的進(jìn)展和預(yù)后。但是目前缺乏對其早期診斷和預(yù)后判斷的有效生物標(biāo)志物。因此篩選生物標(biāo)志物對預(yù)測EC的轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)，有效監(jiān)測EC患者的預(yù)后至關(guān)重要。

在前期的工作中，我們通過生物信息學(xué)方法篩選了子宮內(nèi)膜癌相關(guān)的生物標(biāo)志物，結(jié)果提示含DEP 結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)1 (DEP domain containing 1，DEPDC1) 可能是子宮內(nèi)膜癌的發(fā)生發(fā)展過程中一個關(guān)鍵基因，可以作為子宮內(nèi)膜癌新的生物標(biāo)志物和潛在治療靶點[2]。DEPDC1是一個新的腫瘤相關(guān)基因。Kanehira等首先發(fā)現(xiàn)DEPDC1在膀胱癌組織中高表達(dá)，利用siRNA敲低DEPDC1基因表達(dá)，可以抑制膀胱癌細(xì)胞的生長[3]。DEPDC1基因編碼的蛋白含有DEP結(jié)構(gòu)域，可能作為轉(zhuǎn)錄輔助抑制因子參與轉(zhuǎn)錄調(diào)控。近年來的研究表明，DEPDC1在包括肝癌[4]、乳腺癌[5]等多種腫瘤中呈現(xiàn)過表達(dá)狀態(tài)，可能成為這些惡性腫瘤分子靶向治療的新靶點。但是DEPDC1在子宮內(nèi)膜癌中的作用尚未明確。本研究基于多個生物信息數(shù)據(jù)庫探討DEPDC1基因在子宮內(nèi)膜癌中的表達(dá)和預(yù)后意義。

1 材料與方法

1.1 阿拉巴馬癌癥數(shù)據(jù)庫(University of alabama cancer,UALCAN)分析 UALCAN(http://ualcan.path.uab.edu)[6]是一個綜合的交互式的在線網(wǎng)絡(luò)資源，用于分析癌癥組學(xué)數(shù)據(jù)。輸入基因名稱“DEPDC1”，選擇“子宮內(nèi)膜癌”，UALCAN分析工具基于TCGA數(shù)據(jù)庫的數(shù)據(jù)，分析DEPDC1 mRNA在正常子宮內(nèi)膜組織和子宮內(nèi)膜癌中的差異表達(dá)，以及DEPDC1 mRNA表達(dá)與子宮內(nèi)膜癌臨床病理特征的相關(guān)性。同時，UALCAN分析工具還可以提供基于TP53突變狀態(tài)的基因和miRNA表達(dá)。TP53突變狀態(tài)是通過TCGA全外顯子組測序數(shù)據(jù)獲得的。

1.2 人類蛋白質(zhì)表達(dá)圖譜數(shù)據(jù)庫(The human protein atlas,HPA) HPA是基于RNA測序分析和免疫組化分析的大型轉(zhuǎn)錄組和蛋白組數(shù)據(jù)庫(https://www.proteinatlas.org)[7]，可用于正常組織和腫瘤組織蛋白差異表達(dá)分析。本研究利用HPA提供的免疫組化信息，在蛋白水平比較DEPDC1在子宮內(nèi)膜癌組織及正常子宮內(nèi)膜組織中的表達(dá)差異，分別從染色(Stain)、強(qiáng)度(Intensity)和數(shù)量(Quantity)3方面來比較。數(shù)據(jù)采用SPSS19.0進(jìn)行處理，組間比較采用Mann-WhitneyU檢驗。P<0.05表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

1.3 Kaplan-Meier Plotter生存分析 利用Kaplan-Meier Plotter(http://kmplot.com/analysis/)[8]分析DEPDC1基因表達(dá)與子宮內(nèi)膜癌患者的總體生存率(OS)和無進(jìn)展生存率(PFS)的相關(guān)性。選擇Kaplan Meier-plotter中的子宮內(nèi)膜癌數(shù)據(jù)集，該數(shù)據(jù)集來自TCGA數(shù)據(jù)庫，包含543例子宮內(nèi)膜癌患者的RNA測序數(shù)據(jù)和生存數(shù)據(jù)。P<0.05表示生存差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

1.4 蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)分析 STRING數(shù)據(jù)庫匯集了已證實的和預(yù)測的蛋白-蛋白相互作用(Protein-Protein Interaction,PPI)，DEPDC1蛋白相關(guān)的PPI網(wǎng)絡(luò)分析利用STRING(v 11.0)在線工具(https://string-db.org/)[9]進(jìn)行分析，蛋白名稱輸入“DEPDC1”，物種選擇“Homo sapiens”，默認(rèn)設(shè)置參數(shù)minimum required interaction score為中等(≥0.4)。

1.5 基因本體(Gene ontology，GO)和信號通路富集分析 利用Metascape在線分析工具(https://metascape.org/)[10]，對與DEPDC1相互作用蛋白的基因進(jìn)行功能注釋，包括生物過程(BP)、細(xì)胞組分(CC)和分子功能(MF)的GO分析以及KEGG信號通路富集分析，定義為P<0.05。

2 結(jié)果

2.1 DEPDC1 mRNA在正常子宮內(nèi)膜組織和子宮內(nèi)膜癌組織中的表達(dá) 我們首先在UALCAN數(shù)據(jù)庫中利用TCGA數(shù)據(jù)庫子宮內(nèi)膜癌組織的RNA測序數(shù)據(jù)來分析DEPDC1 mRNA在正常子宮內(nèi)膜組織(n=35)和子宮內(nèi)膜癌組織(n=546)中的表達(dá)，結(jié)果顯示，與正常子宮內(nèi)膜組織相比，DEPDC1 mRNA在EC中表達(dá)明顯升高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(見圖1)。

圖1 DEPDC1 mRNA在子宮內(nèi)膜癌組織和正常子宮內(nèi)膜組織中的表達(dá)

2.2 DEPDC1 mRNA表達(dá)與子宮內(nèi)膜癌臨床病理特征的相關(guān)性 利用UALCAN數(shù)據(jù)庫檢測DEPDC1 mRNA表達(dá)與EC臨床病理特征的相關(guān)性，結(jié)果顯示，DEPDC1的表達(dá)與種族相關(guān)(見圖2A)，相對高加索人群，黑人的DEPDC1 mRNA表達(dá)水平較高(P=1.73E-02)。DEPDC1 mRNA在各期別EC組織中的表達(dá)明顯高于正常組織(P<0.01)，但是不同分期EC組織的DEPDC1 mRNA表達(dá)無顯著差別(P>0.05，見圖2B)。DEPDC1 mRNA的表達(dá)與EC組織類型相關(guān)，在漿液性腺癌中的表達(dá)高于子宮內(nèi)膜樣腺癌，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，見圖2C)。此外，根據(jù)UALCAN數(shù)據(jù)庫提供的基于TP53突變狀態(tài)的基因表達(dá)，DEPDC1 mRNA在TP53基因突變的子宮內(nèi)膜癌組織中的表達(dá)高于TP53基因未發(fā)生突變的子宮內(nèi)膜癌組織(P<0.01，見圖2D)。

A:DEPDC1的表達(dá)與人種的關(guān)系；B:DEPDC1的表達(dá)與臨床分期的關(guān)系；C:DEPDC1的表達(dá)與組織類型的關(guān)系；D:DEPDC1的表達(dá)與TP53突變狀態(tài)的關(guān)系。圖2 DEPDC1與子宮內(nèi)膜癌臨床病理特征的相關(guān)性

2.3 DEPDC1蛋白在正常子宮內(nèi)膜組織和子宮內(nèi)膜癌組織中的表達(dá) 進(jìn)一步利用HPA數(shù)據(jù)庫分析DEPDC1蛋白在子宮內(nèi)膜癌組織及正常子宮內(nèi)膜組織中的表達(dá)差異。在6例正常子宮內(nèi)膜組織中，DEPDC1蛋白的表達(dá)均為陰性，在11例子宮內(nèi)膜癌組織中，DEPDC1蛋白呈低-中表達(dá)(見表1，圖3)。進(jìn)一步證實，DEPDC1蛋白在子宮內(nèi)膜癌組織中的表達(dá)較正常子宮內(nèi)膜組織升高。

免疫組織化學(xué)染色圖片下載于the Human Protein Atlas數(shù)據(jù)庫(https://www.proteinatlas.org)；A：Normal;B:EC。圖3 DEPDC1蛋白在正常子宮內(nèi)膜組織和EC中的表達(dá)

表1 HPA數(shù)據(jù)庫中DEPDC1蛋白在正常子宮內(nèi)膜組織和EC組織中的免疫組化染色統(tǒng)計

2.4 DEPDC1 mRNA表達(dá)與子宮內(nèi)膜癌患者生存率的關(guān)系 根據(jù)DEPDC1表達(dá)水平高低，利用Kaplan-Meier Plotter數(shù)據(jù)庫在線分析子宮內(nèi)膜癌患者生存率與DEPDC1表達(dá)水平的相關(guān)性，結(jié)果顯示，高表達(dá)DEPDC1的EC患者的總體生存率和無進(jìn)展生存率明顯降低(見圖4A、B)，提示DEPDC1高表達(dá)與EC患者不良預(yù)后有關(guān)。

A：總體生存率；B：無進(jìn)展生存率。圖4 DEPDC1表達(dá)與EC預(yù)后的關(guān)系

2.5 DEPDC1相互作用蛋白網(wǎng)絡(luò)及GO分析 將DEPDC1按前述條件輸人STRING數(shù)據(jù)庫，PPI結(jié)果如圖5A所示。PPI富集節(jié)點為11個，P< 1.0 e-16。與DEPDC1相互作用的蛋白分子包括DLGAP5、TOP2A、KIF11、CENPF、BUB1B、ASPM、ARHGAP11A、KIF20A、CEP55(Score>0.4)，主要參與的生物過程有有絲分裂核分裂、姐妹染色單體分離、染色體定位、減數(shù)分裂核分裂、基于微管的運(yùn)動等(見表2，圖5B)。

表2 與DEPDC1相互作用的蛋白分子的GO分析

A:DEPDC1相互作用蛋白網(wǎng)絡(luò)；B:DEPDC1相互作用蛋白的GO分析。圖5 DEPDC1相互作用蛋白網(wǎng)絡(luò)及GO分析

3 討論

盡管治療手段不斷進(jìn)步，晚期子宮內(nèi)膜癌的預(yù)后仍然較差，在全球，2018年預(yù)計有38萬新發(fā)病例，而有8.9萬人死于子宮內(nèi)膜癌[11]。DEP 結(jié)構(gòu)域是以Dishevelld、EGL-10 和Pleckstrin 3種蛋白的首字母命名的，因為它首先在這3種蛋白中被發(fā)現(xiàn)。含DEP結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)與包括細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、極性確定和細(xì)胞膜錨定等多種生理功能有關(guān)[12]。DEPDC1 是一個含有DEP 結(jié)構(gòu)域的癌蛋白，正常情況下，在除了睪丸以外的組織中低表達(dá)或不表達(dá)[13]。為了探究DEPDC1與子宮內(nèi)膜癌的關(guān)系，本研究通過全面的生物信息學(xué)數(shù)據(jù)挖掘?qū)EPDC1在子宮內(nèi)膜癌中的表達(dá)、臨床意義及潛在功能進(jìn)行分析。

TCGA數(shù)據(jù)庫包含了30多種癌癥的基因組、轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)以及臨床病理信息。HPA數(shù)據(jù)庫提供人類蛋白質(zhì)在組織和細(xì)胞的分布。利用這兩個數(shù)據(jù)庫，本研究首先分析了DEPDC1 mRNA和蛋白在正常子宮內(nèi)膜組織和子宮內(nèi)膜癌中的表達(dá)。結(jié)果表明，DEPDC1 mRNA和蛋白在子宮內(nèi)膜癌組織中均表達(dá)升高。隨后，利用TCGA中子宮內(nèi)膜癌相關(guān)數(shù)據(jù)分析DEPDC1與EC臨床病理參數(shù)及預(yù)后的關(guān)系，結(jié)果表明DEPDC1的表達(dá)與人種、EC組織類型相關(guān)，并且在TP53突變型EC中的表達(dá)高于TP53野生型EC。根據(jù)Kaplan-Meier Plotter數(shù)據(jù)庫的分析結(jié)果，DEPDC1在子宮內(nèi)膜癌中的高表達(dá)與患者不良預(yù)后相關(guān)，提示DEPDC1可能參與了子宮內(nèi)膜癌的惡性表型和進(jìn)展，但仍需要臨床資料和實驗驗證。

隨著分子診斷技術(shù)的發(fā)展，也逐漸認(rèn)識到傳統(tǒng)病理分型對于EC的局限性。根據(jù)全基因組、轉(zhuǎn)錄組的測序數(shù)據(jù)、DNA甲基化分析及微衛(wèi)星不穩(wěn)定性(MSI)分析，TCGA[14]將EC分為POLE 超突變型、MSI高突變型、低拷貝數(shù)(Copy number low，CN-L) 型和高拷貝數(shù)(Copy number high，CN-H) 型四個亞型。其中CN-H型是異質(zhì)性最高，預(yù)后最差的一種亞型，主要特征為廣泛的體細(xì)胞拷貝數(shù)變異和TP53 (高達(dá)92%)、PPP2R1A(22%)、PIK3CA(47%)的突變[15]。在本研究中，利用UALCAN數(shù)據(jù)庫的TP53突變數(shù)據(jù)，將子宮內(nèi)膜癌分為TP53突變型和TP53野生型，分析結(jié)果顯示，DEPDC1在TP53突變型EC中的表達(dá)高于TP53野生型EC，提示TP53突變可能參與DEPDC1基因的表達(dá)調(diào)控，DEPDC1可能與EC的組織分子亞型有關(guān)，可能成為EC分子靶向治療的新靶點。

目前對DEPDC1基因在腫瘤中的作用機(jī)制研究尚未完全明確。研究表明DEPDC1A-ZNF224復(fù)合物可能通過抑制A20基因的轉(zhuǎn)錄，導(dǎo)致NF-KB蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞核，從而抑制膀胱癌細(xì)胞的凋亡，在膀胱癌中發(fā)揮重要作用[16]。另有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，在子宮內(nèi)膜癌中，DEPDC1基因可能作為原鈣粘蛋白10的下游分子參與子宮內(nèi)膜癌的發(fā)生發(fā)展[17]。但是DEPDC1基因在子宮內(nèi)膜癌中的功能及作用機(jī)制仍不明確。本研究利用STRING數(shù)據(jù)庫對DEPDC1相互作用蛋白進(jìn)行分析，并進(jìn)行功能富集分析，分析結(jié)果提示富集于有絲分裂的核分裂、染色體分離以及微管相關(guān)運(yùn)動，為DEPDC1后續(xù)的功能研究可以提供分析的方向，但后續(xù)研究仍需要在細(xì)胞、動物模型和組織中進(jìn)行驗證。

DEPDC1是否可作為診斷標(biāo)志物和預(yù)后預(yù)測指標(biāo)以廣泛應(yīng)用于其他癌癥仍有待研究，而且其臨床應(yīng)用價值尚有待檢驗?？傊?，關(guān)于DEPDC1 在癌癥中的作用還需廣泛深入的研究，將可能為相關(guān)癌癥的診斷和治療提供一種新的選擇，進(jìn)而提高相關(guān)癌癥患者的生存質(zhì)量。