Collagen III和Smad2在犬裁剪去粘膜回腸輸尿管中的表達

謝輝輝，楊登浩，付榮波，趙澤駒

(遵義醫(yī)科大學附屬醫(yī)院 泌尿外科， 貴州 遵義 563099)

輸尿管長段或全段缺損的替代治療主要采用回腸，術后并發(fā)癥多而呈現(xiàn)多種改良，但始終未能顯著降低并發(fā)癥發(fā)生率[1]。裁剪去粘膜回腸輸尿管短期實驗研究顯示效果較好，并發(fā)癥顯著降低，但其管壁損傷、感染和尿液刺激勢必誘發(fā)炎癥反應，術后管壁纖維化可能性較大，遠期效果如何尚且不知[2]。Collagen III和Smad2是公認的組織損傷、炎癥至纖維化的關鍵因子，檢測其在1年期模型犬回腸輸尿管中的表達，結(jié)合形態(tài)結(jié)構(gòu)變化，可以評估裁剪去粘膜回腸輸尿管穩(wěn)定性和遠期效果。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物 實驗用比格犬5只，1～2歲齡，12～13 kg/只，購買于陸軍醫(yī)科大學實驗動物中心(倫理審查編號：KLLY(A)-2019-033)，飼養(yǎng)于遵義醫(yī)科大學動物實驗中心(SP級)，飼養(yǎng)2周后實施手術。

1.1.2 主要試劑 RNA Trizol Reagent(批號vs18061730)，購自合肥博美生物科技有限公司生產(chǎn)； TBGreen TM Premix Ex TaqTM Ⅱ(貨號RR820A)，RT-PCR：PrimeScript RT reagent Kit(貨號RR047A)，購自寶日醫(yī)生物技術有限公司；抗體 Collagen III抗體，兔克隆抗體(貨號：22734-1-ap)，購自Proteintech公司；Smad2抗體，兔克隆抗體(貨號：a7699)，購自ABClone公司；β-actin抗體，鼠克隆抗體，(貨號：T0022)，購自Affinity公司；生物素化山羊抗鼠抗兔IgG(H+L)，(貨號：ab6789、貨號：ab6721)，購自英國Abcam--艾博抗(上海)貿(mào)易有限公司；目的基因一抗： Collagen Ⅲ，兔多克隆抗體(貨號：bs-0549)，購自北京博奧森生物技術有限公司；Smad2，兔多克隆抗體，(貨號BA0412)，購自BOSTER公司；生物素二抗：山羊抗兔工作液，(貨號SP-9001)，購自北京中杉金橋生物有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 模型建立與取樣 實驗用5只比格犬，雌雄比為2∶3，參照前期實驗方法建立動物模型[3]，術前禁食 12 h，采用戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉后、取仰臥位、備皮，消毒鋪巾后、取腹正中線開腹、探查，分離、顯露、切除左腎及輸尿管，結(jié)扎并縫扎腎蒂及輸尿管遠端；顯露膀胱、找到右側(cè)輸尿管，充分游離至右腎門，于腎盂輸尿管連接部及膀胱輸尿管連接部切除整段右側(cè)輸尿管，并縫扎膀胱輸尿管連接部斷端；距回盲部約10 cm處取帶蒂回腸段約13～15 cm,原回腸于系膜前端端吻合,恢復連續(xù)性,間斷縫合關閉系膜裂口。帶蒂回腸段用0.05%碘伏沖洗致無渣,鉗夾固定對系膜側(cè)1/2腸壁,縱向裁剪切除;系膜側(cè)腸片粘膜剝脫，包裹F10號橡膠導尿管，3-0可吸收線連續(xù)鎖邊縫合成管狀，用F5號雙“J”管替換導尿管，近端與右腎盂、遠端與膀胱吻合; 檢查代輸尿管無尿瘺及缺血，腹腔無出血及腸扭轉(zhuǎn),術區(qū)噴灑甲硝唑，關腹，術后觀察犬存活狀態(tài),常規(guī)使用頭孢3～5 d，做好飼養(yǎng)記錄，觀察進食、排便和排尿、活動情況，期間因腸梗阻死亡一只(雄性)，存活4只。術后4周拔出雙“J”管，1年后取樣，取樣前于麻醉下實施靜脈腎盂造影(IVU)后，解剖觀察腹腔、回腸輸尿管在體狀態(tài),切取回腸代輸尿管4條，同時切取回腸遠段約3.0 cm腸段做對照；樣本組織各取1份儲存于﹣80℃冰箱，另1份用10%福爾馬林固定。

1.2.2 HE與Masson染色 固定24 h樣本，按常規(guī)HE和Masson制作方法，制備石蠟切片并染色，封片后采集圖像及分析。

1.2.3 免疫組化 參照試劑盒說明，用SP法檢測Collagen III和Smad2的表達。切片脫蠟、水化、抗原修復、封閉后，滴加一抗后4 ℃孵育過夜，次日，滴加生物素化二抗室溫孵育30 min，后進行DAB顯色，鏡下控制反映時間、蒸餾水洗滌、蘇木素染色、脫水透明后，中性樹膠封片，鏡下觀察Collagen III和Smad2的表達，陽性結(jié)果呈黃色或棕黃色，并用Image-Pro Plus 6.0分析計算平均光密度。

1.2.4 Western blot 分別取各組織樣本，加RIPA裂解液，冰上裂解、離心取上清液；提取蛋白后，用BCA蛋白定量法測定濃度，制備標準蛋白樣品。根據(jù)試劑盒說明配膠，加樣，電泳1.5 h，半干法轉(zhuǎn)膜1～2 h，再用脫脂牛奶2 h封閉，洗膜；將PVDF膜放入一抗中，(一抗?jié)舛龋篊ollagen III1：1 000；Smad2 1∶1 000；β-actin 1∶5 000)，搖床上輕搖，4 ℃孵育過夜；洗膜；再將PVDF膜放入相應二抗中(生物素化山羊抗兔抗鼠IgG(H+L)1∶5 000)，搖床輕搖，室溫孵育2～3 h；洗膜。用ECL顯影，應用凝膠成像系統(tǒng)獲取曝光圖像并測定分析目的蛋白相對光密度積分值。

1.2.5 Real-time PCR檢測 按照動物組織RNA提取試劑盒說明書采用Trizol法提取總RNA、檢測濃度并配置標準RNA樣品。引物設計Collagen III：上游GACCTGGTTGCTTCTCGCTCTG，下游ATTTGGCACGGTTCTGGCTTCc；Smad-2：上游TGCTGCTCTCCTGGCTCAGTC，下游GTGCTCGTTACCGTCTGCCTTC；按照試劑盒說明，進行逆轉(zhuǎn)錄反應，擴增(條件：先95 ℃預變性30 s，后95 ℃變性5 s，然后55 ℃退火30 s，再72 ℃充分延伸30 s，循環(huán)45次)；以β-actin為對照，根據(jù)檢測結(jié)果，采用2- △△CT值方法對目的基因表達量進行相對定量分析。

2 結(jié)果

2.1 形態(tài)結(jié)構(gòu)與組織病理 模型犬術后1年時存活4只，1只腸梗阻死亡。IVU：腎、輸尿管顯影，輸尿管蠕動存在、排尿通暢，管腔無明顯狹窄(見圖1A)；在體觀察腹腔無明顯積液、積膿，回腸輸尿管周圍輕度粘連，未觸及疤痕疙瘩，分離后見其外形完整，蠕動存在；剖開見管壁厚薄均勻，無局部增厚與變薄，管腔光滑，無明顯狹窄，管壁柔軟(見圖1B、C)。實驗與對照組回腸壁結(jié)構(gòu)完整，HE和Masson染色由內(nèi)向外可見粘膜層、粘膜下層、肌肉及漿膜層，各層界限清楚、無明顯炎細胞浸潤，膠原層無顯著增厚(見圖2、3)。

A：IVU腎輸尿管顯影；B和C：CMSPI無擴張、管腔通暢、管壁均勻、腔面光滑。圖1 裁剪去粘膜回腸輸尿管(CMSPI)造影及肉眼觀

A：正常回腸；B： CMSPI四層結(jié)構(gòu)；HE×40。圖2 正?；啬c與裁剪去粘膜回腸輸尿管CMSPI粘膜結(jié)構(gòu)HE染色對比

2.2 免疫組化 Collagen III在細胞質(zhì)及細胞間質(zhì)、Smad2在細胞核、細胞質(zhì)及細胞間質(zhì)中見棕黃色顆粒，即陽性表達，未見棕黃色顆粒，即陰性表達(見圖4)。對照組組織中未見棕黃色顆粒，實驗組偶見淡黃色顆粒，Collagen III兩組IOD值比較無顯著性差異(P>0.05)，Smad2實驗組較對照組明顯降低(P<0.05)。

2.3 Western blot 正常回腸及正常輸尿管與CMSPI中Collagen III和Smad2表達量比較無統(tǒng)計學差異(P>0.05)；不具有統(tǒng)計學意義(見圖5)。

A：正常回腸；B :CMSPI四層結(jié)構(gòu)；Masson×40。圖3 正?；啬c與裁剪去粘膜回腸輸尿管(CMSPI)粘膜結(jié)構(gòu)Masson染色對比

A、B：正?；啬c與CMSPI中Collagen III表達檢測(SP×400)，僅CMSPI有少量表達；C、D：正?；啬c與CMSPI中Smad2表達檢測(SP×400)，兩組均少量表達；黃色箭頭為陽性表達。圖4 正?；啬c與裁剪去粘膜回腸輸尿管(CMSPI)免疫組化結(jié)果對比

A：Western blotting檢測Collagen III和Smad2表達量條帶；B：Collagen III表達水平的統(tǒng)計分析；C ：Smad2表達水平的統(tǒng)計分析；采用單因素方差分析檢驗統(tǒng)計學差異性，結(jié)果正?；啬c與CMSPI兩者P>0.05；(ILEUM：正?；啬c；Ureter：正常輸尿管；1CMSPI：裁剪去粘膜回腸輸尿管上段、2CMSPI：裁剪去粘膜回腸輸尿管中段、3CMSPI：裁剪去粘膜回腸輸尿管下段)。圖5 Western blotting檢測正?；啬c、正常輸尿管、裁剪去粘膜回腸輸尿管(CMSPI)中Collagen III，Smad2表達水平

2.4 Real-time PCR CMSPI與正?；啬cCollagen III及Smad2表達量比較無顯著差異(P>0.05，見圖6)。

A： Collagen III相對表達量統(tǒng)計； B： Smad2相對表達量統(tǒng)計；*：與ILEUM相比P<0.05；(ILEUM：正常回腸；1CMSPI：裁剪去粘膜回腸輸尿管上段、2CMSPI：裁剪去粘膜回腸輸尿管中段、3CMSPI：裁剪去粘膜回腸輸尿管下段)。圖6 RT-PCR檢測正?；啬c、裁剪去粘膜回腸(CMSPI)Collagen III和Smad2基因表達水平

3 討論

臨床上超過15cm以上輸尿管缺損較為少見，主要是醫(yī)源性因素所致，多采用回腸代輸尿管治療[4]。該方法術后感染、梗阻、返流和尿中廢物重吸收等并發(fā)癥較為常見，其它方法雖多，皆因代輸尿管形態(tài)結(jié)構(gòu)與功能、并發(fā)癥發(fā)生率缺乏顯著優(yōu)勢而應用較少[4]。裁剪去粘膜回腸代輸尿管實驗研究表明其優(yōu)勢明顯[3,5]。但回腸裁剪、粘膜剝脫、尿液刺激和粘膜下層暴露等均可誘導腸壁炎癥纖維化，代輸尿管隨時間延長是否纖維化存在諸多不確定性。需要延長模型犬飼養(yǎng)時間，動態(tài)監(jiān)測其組織形態(tài)結(jié)構(gòu)與功能變化，監(jiān)測與組織纖維化密切相關的指標予以論證，方能評價其穩(wěn)定性和長期效果。

本實驗采用的回腸裁剪及粘膜剝脫法主要損傷位點在腸上皮細胞粘膜層與粘膜下層之間，而腸壁嚴重挫傷、慢性炎癥性腸病、潰瘍性結(jié)腸炎和腸結(jié)核常至腸壁纖維增生、僵硬、管腔狹窄和功能喪失，其因是激活了以TGF-β/Smad為主的組織炎癥纖維化通路，形成大量肌成纖維細胞，分泌膠原致細胞外過度沉積、纖維增生疤痕形成[6-9]。Collagen III和Smad2在其中發(fā)揮了重要作用[10]。Collagen III是內(nèi)皮細胞間質(zhì)化為肌成纖維細胞細胞的主要產(chǎn)物之一，主要由肌成纖維細胞產(chǎn)生，當炎癥和損傷發(fā)生時、在炎性腸病腸組織纖維化以及肝纖維中是主要增生纖維成分之一。Smad2是促進TGF-β1介導的組織纖維化的主要下游調(diào)控因子，與Smad3耦合磷酸化后TGF-β1介導的纖維化通路信號才能得以下傳，而后促進組織纖維化[11]。因此Collagen III和 Smad2過度或強陽性表達標志著組織纖維化，檢測其在對照與實驗組中的表達差異可以論證炎癥纖維化通路是否激活，是否存在纖維化。本實驗組中裁剪去粘膜回腸輸尿管1年期造影顯示形態(tài)結(jié)構(gòu)與功能較好，與術后短期間無明顯差異，動力存在，排尿通暢；粘膜下層及肌層未見大量膠原沉積和管壁增厚；回腸代膀胱和回腸代輸尿管術后未見腸壁纖維化報道，裁剪去粘膜回腸代輸尿管實驗中亦未見腸纖維化現(xiàn)象，回腸經(jīng)歷的這些損傷與刺激視乎不足以誘導或激活組織纖維化通路[12-13]。實驗與對照組回腸壁組織細胞中Collagen III和Smad2在蛋白與分子水平的變化也無顯著差異，且免疫組化結(jié)果顯示Smad2實驗組比對照組反而下降，其中機理目前尚不清楚，推測主要原因為回腸即使經(jīng)歷裁剪、粘膜剝脫、輸尿管重建與尿液長期刺激，在缺乏細胞環(huán)境與微循環(huán)支撐的條件下不能激活TGF-β/Smad通路亦或是通路下傳受阻，完整的粘膜下層發(fā)揮了阻滯炎癥纖維化的重要作用，具體機制還有待于進一步研究。裁剪去粘膜回腸代輸尿管短期與1年期出現(xiàn)相同形態(tài)結(jié)構(gòu)與功能的基礎是腸壁未發(fā)生纖維化、功能相對穩(wěn)定。

原因可能與粘膜剝脫、粘膜下層完整有關。去粘膜雖然損傷腸壁，局部滲出增加，早期呈現(xiàn)炎癥水腫和細胞浸潤，但該層為細胞外基質(zhì)，缺乏微循環(huán)和細胞條件支撐，致炎因素刺激不能啟動細胞炎癥纖維化連鎖反應；粘膜下層完整阻斷了炎細胞向深層浸潤，防止了細胞性炎癥反應；粘膜下層大量活性細胞因子及纖維蛋白溶解酶激活了纖溶過程，對抗了早期分泌增加的纖維，維持了組織增生與降解平衡[14]。

綜上所述，裁剪去粘膜回腸代輸尿管未因時間延長管壁形態(tài)結(jié)構(gòu)和功能發(fā)生改變，Collagen III和Smad2未因腸壁結(jié)構(gòu)改造和尿液刺激出現(xiàn)過度表達，說明其管壁不存在纖維化問題，有助于長期穩(wěn)定。