一種改進(jìn)型麥克馬斯特蟲卵計(jì)數(shù)板的應(yīng)用效果研究

韓利方，鄒均平，謝月華，劉易揚(yáng)，閆文朝

（1河南科技大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，河南洛陽 471023；2廣西賀州市八步區(qū)農(nóng)業(yè)農(nóng)村局動(dòng)物衛(wèi)生監(jiān)督所，廣西賀州 542899）

0 引言

寄生蟲病危害動(dòng)物和人類的健康，大部分寄生蟲感染宿主后可通過宿主糞便排出蟲卵、或卵囊、或包囊等病原體，準(zhǔn)確、有效地檢測出這些病原體能為動(dòng)物和人的寄生蟲病防控提供重要的科學(xué)指導(dǎo)[1-3]。

糞便檢查方法中，直接涂片法、水洗沉淀法和飽和鹽水漂浮法等為定性檢測方法，不能準(zhǔn)確定量檢測[4]。經(jīng)典麥克馬斯特蟲卵計(jì)數(shù)板法(McMaster egg counting method)是最常用的寄生蟲蟲卵計(jì)數(shù)方法之一，能夠?qū)S便中蟲卵進(jìn)行定性和定量檢測[2-4]。經(jīng)典麥克馬斯特蟲卵計(jì)數(shù)板由于其計(jì)數(shù)室的底部表面沒有固定面積的刻度線，只能利用飽和鹽水將比重較輕的線蟲和絳蟲蟲卵、球蟲卵囊漂浮到計(jì)數(shù)室的頂部表面，和頂部固定面積的刻度線在同一個(gè)視野，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)蟲卵計(jì)數(shù)，但是不能對(duì)比重較重的吸蟲和棘頭蟲蟲卵、原蟲包囊進(jìn)行計(jì)數(shù)[5-7]。

鑒于經(jīng)典麥克馬斯特蟲卵計(jì)數(shù)板設(shè)計(jì)上存在的不足[8-10]，本實(shí)驗(yàn)室對(duì)經(jīng)典麥克馬斯特蟲卵計(jì)數(shù)板進(jìn)行改進(jìn)設(shè)計(jì)，并研制出一款改進(jìn)型麥克馬斯特蟲卵計(jì)數(shù)板，利用飽和鹽水、自來水或生理鹽水可實(shí)現(xiàn)對(duì)吸蟲、絳蟲、線蟲和棘頭蟲蟲卵、球蟲卵囊、原蟲包囊的計(jì)數(shù)。本研究將利用改進(jìn)型麥克馬斯特蟲卵計(jì)數(shù)板通過漂浮法和沉淀法對(duì)不同樣品進(jìn)行蟲卵計(jì)數(shù)和分析，評(píng)價(jià)改進(jìn)型麥克馬斯特蟲卵計(jì)數(shù)板的應(yīng)用效果，以期為臨床和實(shí)驗(yàn)室樣品中蟲卵定量分析提供更便捷有效的檢測工具。

1 材料與方法

1.1 蟲卵計(jì)數(shù)板

改進(jìn)型麥克馬斯特蟲卵計(jì)數(shù)板為河南科技大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院寄生蟲學(xué)實(shí)驗(yàn)室的授權(quán)專利產(chǎn)品（專利號(hào)：ZL201820602559.5），該改進(jìn)型麥克馬斯特蟲卵計(jì)數(shù)板是基于經(jīng)典麥克馬斯特蟲卵計(jì)數(shù)板進(jìn)行改進(jìn)設(shè)計(jì)和研制的升級(jí)產(chǎn)品。通過獨(dú)特設(shè)計(jì)，改進(jìn)型麥克馬斯特蟲卵計(jì)數(shù)板的計(jì)數(shù)室上、下壁均有1 cm2的正方形刻度，每個(gè)1 cm2的正方形被均分為64個(gè)小方格（如圖1），使其既可以通過漂浮法對(duì)比重較輕的線蟲和絳蟲蟲卵、球蟲卵囊進(jìn)行計(jì)數(shù)，又可以通過沉淀法對(duì)比重較重的吸蟲、棘頭蟲蟲卵和原蟲包囊進(jìn)行計(jì)數(shù)。

圖1 改進(jìn)型麥克馬斯特蟲卵計(jì)數(shù)板結(jié)構(gòu)示意圖（單位：mm）

經(jīng)典麥克馬斯特蟲卵計(jì)數(shù)板（上海潤友科技有限公司制造），是基于漂浮法對(duì)樣品中線蟲和絳蟲蟲卵、球蟲卵囊進(jìn)行計(jì)數(shù)，作為本實(shí)驗(yàn)的參考標(biāo)準(zhǔn)方法[10-11]。

1.2 樣品

45日齡斷奶幼兔的、鏡檢球蟲卵囊陽性的新鮮糞便樣品，用于評(píng)價(jià)改進(jìn)型麥克馬斯特蟲卵計(jì)數(shù)板基于沉淀法的定量檢測效果；經(jīng)產(chǎn)母兔的、鏡檢球蟲卵囊陽性的新鮮糞便樣品，用于評(píng)價(jià)改進(jìn)型麥克馬斯特蟲卵計(jì)數(shù)板基于漂浮法的定量分析效果[10,12]。

用2.5%重鉻酸鉀溶液保存的柔嫩艾美耳球蟲卵囊懸液，于4℃冰箱保存，用于評(píng)價(jià)改進(jìn)型麥克馬斯特蟲卵計(jì)數(shù)板對(duì)液體懸液樣品的計(jì)數(shù)效果。

1.3 對(duì)固體糞便樣品中球蟲卵囊的計(jì)數(shù)

1.3.1 基于漂浮法對(duì)固體糞便樣品中球蟲卵囊的計(jì)數(shù)參考有關(guān)方法[2]，用經(jīng)典麥克馬斯特蟲卵計(jì)數(shù)板對(duì)2 g母兔糞樣進(jìn)行球蟲卵囊計(jì)數(shù)3次，根據(jù)相關(guān)公式計(jì)算每克糞便卵囊數(shù)量，即OPG值。然后用改進(jìn)型麥克馬斯特蟲卵計(jì)數(shù)板分別對(duì)2、3、4、5、6、7 g母兔糞樣進(jìn)行球蟲卵囊計(jì)數(shù)3次。具體操作為：稱取(m)g糞樣，分次加入共(60-m)mL飽和氯化鈉溶液（400 g食鹽+1 L自來水，煮沸溶解放置室溫有鹽結(jié)晶析出即得），用玻璃棒搗碎混勻，100目篩網(wǎng)過濾，將濾液快速注滿改進(jìn)型麥克馬斯特蟲卵計(jì)數(shù)板的計(jì)數(shù)室，在顯微鏡載物臺(tái)上靜置5 min，移動(dòng)視野用手動(dòng)計(jì)數(shù)器查完64個(gè)方格內(nèi)卵囊的數(shù)量N，最后根據(jù)公式(1)計(jì)算各組的OPG值：

通過與經(jīng)典麥克馬斯特蟲卵計(jì)數(shù)板的計(jì)數(shù)結(jié)果比較，篩選改進(jìn)型麥克馬斯特蟲卵計(jì)數(shù)板基于漂浮法合適的糞樣克數(shù)，并評(píng)價(jià)其準(zhǔn)確度。

1.3.2 基于沉淀法對(duì)固體糞便樣品中球蟲卵囊的計(jì)數(shù) 用經(jīng)典麥克馬斯特蟲卵計(jì)數(shù)板對(duì)2 g斷奶幼兔糞樣進(jìn)行球蟲卵囊計(jì)數(shù)3次，根據(jù)相關(guān)公式計(jì)算OPG值[4]。然后用改進(jìn)型麥克馬斯特蟲卵計(jì)數(shù)板分別對(duì)0.1、0.3、0.5、0.7、0.9、1.1 g斷奶幼兔糞樣進(jìn)行球蟲卵囊計(jì)數(shù)3次，不同質(zhì)量的糞便樣品用自來水稀釋混勻，其他操作同1.3.1部分，最后計(jì)算得到各組的OPG值。通過與經(jīng)典麥克馬斯特蟲卵計(jì)數(shù)板的計(jì)數(shù)結(jié)果比較，篩選改進(jìn)型麥克馬斯特蟲卵計(jì)數(shù)板基于沉淀法合適的糞樣克數(shù)，并評(píng)價(jià)其準(zhǔn)確度。

1.4 對(duì)液體懸液樣品中球蟲卵囊的計(jì)數(shù)

用飽和氯化鈉溶液將柔嫩艾美耳球蟲卵囊懸液10倍稀釋后，注入改進(jìn)型麥克馬斯特蟲卵計(jì)數(shù)板的計(jì)數(shù)室內(nèi)，靜置5 min待卵囊上浮后，在10倍物鏡將視野調(diào)至計(jì)數(shù)室上壁表面并計(jì)數(shù)，分別查完64個(gè)方格內(nèi)的卵囊總數(shù)為A1，最后根據(jù)公式(2)[2]計(jì)算每毫升卵囊懸液中卵囊的數(shù)量：

用自來水將柔嫩艾美耳球蟲卵囊懸液10倍稀釋后，注入改進(jìn)型麥克馬斯特蟲卵計(jì)數(shù)板的計(jì)數(shù)室內(nèi)，靜置5 min沉淀后，在10倍物鏡將視野調(diào)至計(jì)數(shù)室下壁表面并計(jì)數(shù)，分別查完64個(gè)方格內(nèi)的卵囊總數(shù)為A2，最后根據(jù)公式(3)計(jì)算每毫升卵囊懸液中卵囊的數(shù)量

上述兩種方法各重復(fù)計(jì)數(shù)3次。將基于漂浮法和沉淀法計(jì)數(shù)得到的結(jié)果與經(jīng)典麥克馬斯特蟲卵計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)結(jié)果進(jìn)行比較分析，評(píng)價(jià)改進(jìn)型麥克馬斯特蟲卵計(jì)數(shù)板對(duì)液體懸浮樣品中球蟲卵囊計(jì)數(shù)結(jié)果的準(zhǔn)確性。

1.5 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)分析

用EXCEL軟件對(duì)各組數(shù)據(jù)進(jìn)行整理，用IBM SPSS Statistics 23軟件中成對(duì)樣品t檢驗(yàn)方法對(duì)各組間OPG值和卵囊密度進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，顯著性水平為0.05[10]。

2 結(jié)果與分析

2.1 固體糞便樣品中球蟲卵囊計(jì)數(shù)效果評(píng)價(jià)

基于漂浮法的計(jì)數(shù)結(jié)果顯示，改進(jìn)型麥克馬斯特蟲卵計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)2 g糞便的OPG值與A組經(jīng)典麥克馬斯特蟲卵計(jì)數(shù)板的計(jì)數(shù)結(jié)果差異不顯著(P>0.05)，二者符合率高達(dá)99.49%。改進(jìn)型麥克馬斯特蟲卵計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)3～5 g糞便的OPG值與經(jīng)典麥克馬斯特蟲卵計(jì)數(shù)板的計(jì)數(shù)結(jié)果差異也不顯著(P>0.05)，與A組符合率為95.59%～96.41%（如表1）。然而，當(dāng)糞便樣品重量大于5 g后，顯微鏡視野下渾濁度明顯增大，雜質(zhì)也變多，計(jì)數(shù)得到的OPG值明顯偏小(P<0.05)（如表1）。說明改進(jìn)型麥克馬斯特蟲卵計(jì)數(shù)板用漂浮法對(duì)2～5 g糞便樣品的計(jì)數(shù)結(jié)果是準(zhǔn)確的。

表1 基于漂浮法固體糞便樣品中球蟲卵囊計(jì)數(shù)結(jié)果

基于沉淀法的計(jì)數(shù)結(jié)果顯示，改進(jìn)型麥克馬斯特蟲卵計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)0.3～0.5 g糞便的OPG值與a組經(jīng)典麥克馬斯特蟲卵計(jì)數(shù)板的計(jì)數(shù)結(jié)果差異不顯著(P>0.05)，與a組符合率為96.48%～98.23%（如表2）。然而，當(dāng)糞便重量為0.1 g時(shí)，改進(jìn)型麥克馬斯特蟲卵計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)得到的OPG值明顯偏大；當(dāng)糞便樣品重量大于0.5 g時(shí)，視野中雜質(zhì)增多，渾濁度增大，干擾對(duì)卵囊的識(shí)別，明顯影響計(jì)數(shù)的準(zhǔn)確度，甚至無法計(jì)數(shù)（如表2）。說明改進(jìn)型麥克馬斯特蟲卵計(jì)數(shù)板用沉淀法對(duì)0.3～0.5 g糞便樣品的計(jì)數(shù)結(jié)果是準(zhǔn)確的。

表2 基于沉淀法固體糞便樣品中球蟲卵囊計(jì)數(shù)結(jié)果

2.2 液體懸液樣品中球蟲卵囊計(jì)數(shù)效果評(píng)價(jià)

用飽和氯化鈉溶液作為懸浮液的計(jì)數(shù)結(jié)果顯示，改進(jìn)型麥克馬斯特蟲卵計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)得到的每毫升懸液中卵囊數(shù)量與1組經(jīng)典麥克馬斯特蟲卵計(jì)數(shù)板的結(jié)果差異不顯著(P>0.05)，與1組的符合率為97.10%（如表3）。相對(duì)于飽和氯化鈉溶液，當(dāng)用自來水作為懸浮液計(jì)數(shù)時(shí)，視野中存在雜質(zhì)，但不影響對(duì)卵囊的識(shí)別，計(jì)數(shù)得到的每毫升懸液中卵囊數(shù)量與1組經(jīng)典麥克馬斯特蟲卵計(jì)數(shù)板的結(jié)果差異也不顯著(P>0.05)，與1組的符合率為96.83%（如表3）。說明不論是飽和氯化鈉溶液還是自來水，改進(jìn)型麥克馬斯特蟲卵計(jì)數(shù)板對(duì)液體懸液樣品中球蟲卵囊計(jì)數(shù)結(jié)果均是準(zhǔn)確的。

表3 液體懸液樣品中球蟲卵囊計(jì)數(shù)結(jié)果

3 討論

3.1 相對(duì)于已有蟲卵計(jì)數(shù)方法，改進(jìn)型麥克馬斯特蟲卵計(jì)數(shù)板的優(yōu)點(diǎn)

蟲卵計(jì)數(shù)方法主要有斯陶爾蟲卵計(jì)數(shù)法(Stoll egg counting method)[3,13]、改良加藤厚涂片法(Kato-Katz egg counting method)[14-15]、麥克馬斯特蟲卵計(jì)數(shù)板法(McMaster egg counting method)[16-18]和有限稀釋法(Limiting dilution method)[19]等方法，其中前兩種方法只用于臨床糞便中蟲卵的計(jì)數(shù)[2,15]，后兩種方法既可用于臨床糞便樣品也可用于實(shí)驗(yàn)室液體懸液樣品中蟲卵的計(jì)數(shù)[18-20]。斯陶爾蟲卵計(jì)數(shù)法、改良加藤厚涂片法和有限稀釋法由于存在需要不易購買到的特殊器材，或操作比較繁瑣，或雜質(zhì)較多干擾計(jì)數(shù)結(jié)果等不足，影響或限制了這些計(jì)數(shù)方法的推廣和應(yīng)用[14,17,19]。麥克馬斯特蟲卵計(jì)數(shù)法是最常用的寄生蟲糞便定量計(jì)數(shù)方法之一，被世界獸醫(yī)寄生蟲學(xué)協(xié)會(huì)推薦為反芻動(dòng)物抗蠕蟲藥物療效和耐藥性研究的標(biāo)準(zhǔn)評(píng)價(jià)方法[21-23]，中國也將該方法列為動(dòng)物球蟲病標(biāo)準(zhǔn)診斷技術(shù)之一[11]。但是經(jīng)典麥克馬斯特蟲卵計(jì)數(shù)板存在構(gòu)造設(shè)計(jì)上的局限，導(dǎo)致其只能定量計(jì)數(shù)比重較輕的線蟲、絳蟲蟲卵和球蟲卵囊，對(duì)比重較重的吸蟲、棘頭蟲蟲卵和原蟲包囊卻無能為力[24-25]。

鑒于現(xiàn)有蟲卵計(jì)數(shù)方法存在的問題[10,26-27]，本實(shí)驗(yàn)室基于經(jīng)典麥克馬斯特蟲卵計(jì)數(shù)板進(jìn)行結(jié)構(gòu)改進(jìn)，設(shè)計(jì)研制出一款改進(jìn)型麥克馬斯特蟲卵計(jì)數(shù)板，彌補(bǔ)經(jīng)典麥克馬斯特蟲卵計(jì)數(shù)板的不足。改進(jìn)型麥克馬斯特蟲卵計(jì)數(shù)板有左右兩個(gè)計(jì)數(shù)室，每個(gè)計(jì)數(shù)室底部和頂部的玻璃表面上均有1 cm2的正方形刻度區(qū)，每個(gè)1 cm2的正方形被均分為64個(gè)小方格，計(jì)數(shù)室的高度為1.5 mm，液體充滿計(jì)數(shù)室后，刻度區(qū)對(duì)應(yīng)的液體體積為0.15 mL。通過這種設(shè)計(jì)和試驗(yàn)條件優(yōu)化，使該改進(jìn)型麥克馬斯特蟲卵計(jì)數(shù)板既可以用飽和氯化鈉溶液等漂浮液對(duì)糞便樣品和液體懸液樣品中比重較輕的蟲卵進(jìn)行定量計(jì)數(shù)，也可以用自來水或生理鹽水對(duì)糞便樣品和液體懸液樣品中比重較重的蟲卵進(jìn)行定量計(jì)數(shù)。

3.2 基于漂浮法，改進(jìn)型麥克馬斯特蟲卵計(jì)數(shù)板能對(duì)固體糞便和懸液樣品中蟲卵和卵囊進(jìn)行準(zhǔn)確計(jì)數(shù)

飽和氯化鈉溶液作為漂浮液，經(jīng)典麥克馬斯特蟲卵計(jì)數(shù)板和改進(jìn)型麥克馬斯特蟲卵計(jì)數(shù)板利用漂浮原理對(duì)固體糞便樣品和液體卵囊懸液中球蟲卵囊均可進(jìn)行準(zhǔn)確計(jì)數(shù),糞便重量影響蟲卵計(jì)數(shù)的準(zhǔn)確性[28-29]。改進(jìn)型麥克馬斯特蟲卵計(jì)數(shù)板檢測固體糞便樣品時(shí),超過5 g糞便濾液渾濁度明顯增大，顯微鏡視野下雜質(zhì)增多，干擾對(duì)卵囊或蟲卵的識(shí)別，導(dǎo)致計(jì)數(shù)結(jié)果偏低；低于2 g時(shí)，其檢測的敏感度下降，若檢測感染強(qiáng)度較低的樣品時(shí)有可能出現(xiàn)假陰性結(jié)果。因此，選取適量的糞便重量對(duì)蟲卵計(jì)數(shù)板檢測結(jié)果至關(guān)重要，適宜重量為2～5 g，這與相關(guān)報(bào)道一致[10,30]。當(dāng)用改進(jìn)型麥克馬斯特蟲卵計(jì)數(shù)板對(duì)液體卵囊懸液中球蟲卵囊進(jìn)行計(jì)數(shù)時(shí)，如果計(jì)數(shù)視野中卵囊過多（每小格超過20個(gè)），可以考慮用自來水對(duì)原卵囊懸液進(jìn)行合適倍數(shù)稀釋后，再用飽和氯化鈉溶液進(jìn)行稀釋、計(jì)數(shù)，得到的計(jì)數(shù)結(jié)果更準(zhǔn)確可靠[29]。本研究用的飽和氯化鈉溶液作為漂浮液進(jìn)行計(jì)數(shù)，漂浮液可以擴(kuò)展到飽和硫酸鋅、硫代硫酸鈉、氯化鈣等其他溶液，用蟲卵計(jì)數(shù)板對(duì)糞便等樣品中蟲卵和球蟲卵囊進(jìn)行檢測和計(jì)數(shù)[2,23]。

3.3 基于沉淀法，改進(jìn)型麥克馬斯特蟲卵計(jì)數(shù)板能對(duì)固體糞便和懸液樣品中蟲卵和卵囊進(jìn)行準(zhǔn)確計(jì)數(shù)

自來水作為懸浮液，經(jīng)典麥克馬斯特蟲卵計(jì)數(shù)板無法對(duì)固體糞便樣品和液體懸液樣品中球蟲卵囊進(jìn)行計(jì)數(shù)[3,10]，改進(jìn)型麥克馬斯特蟲卵計(jì)數(shù)板卻可以實(shí)現(xiàn)對(duì)上述兩類樣品中球蟲卵囊進(jìn)行準(zhǔn)確檢測和計(jì)數(shù)。當(dāng)用改進(jìn)型麥克馬斯特蟲卵計(jì)數(shù)板對(duì)固體糞便中球蟲卵囊進(jìn)行計(jì)數(shù)時(shí)，需要控制好糞便重量在0.3～0.5 g，如果糞樣高于0.5 g，糞便中過多雜質(zhì)沉淀到計(jì)數(shù)室底部，會(huì)遮擋部分蟲卵或卵囊，同時(shí)濾液渾濁度增大，影響對(duì)蟲卵或卵囊的識(shí)別，導(dǎo)致計(jì)數(shù)結(jié)果偏低；如果糞樣太少，低于0.3 g時(shí)，會(huì)降低檢測的敏感度，導(dǎo)致計(jì)數(shù)結(jié)果誤差較大。相對(duì)漂浮法，由于該方法準(zhǔn)確計(jì)數(shù)所用糞便樣品較少，因此該方法適合感染強(qiáng)度較大的樣品。另外，分離收集的球蟲卵囊懸液中雜質(zhì)相對(duì)較少，用該方法計(jì)數(shù)時(shí)，雖然視野中也有少量雜質(zhì)，但是懸浮液渾濁度較低，不影響對(duì)球蟲卵囊的識(shí)別和計(jì)數(shù)結(jié)果的準(zhǔn)確性。沉淀法所用懸浮液由自來水可以擴(kuò)展到生理鹽水，利用改進(jìn)型麥克馬斯特蟲卵計(jì)數(shù)板實(shí)現(xiàn)對(duì)糞便樣品和液體懸液中所有蠕蟲蟲卵（包括比重較大的吸蟲和棘頭蟲蟲卵）、球蟲卵囊和體積較大的原蟲包囊進(jìn)行檢測和準(zhǔn)確計(jì)數(shù)，操作簡便、快捷[2,30]。

4 結(jié)論

本研究對(duì)一項(xiàng)授權(quán)專利產(chǎn)品—改進(jìn)型麥克馬斯特蟲卵計(jì)數(shù)板的應(yīng)用效果進(jìn)行評(píng)價(jià)研究發(fā)現(xiàn)，該改進(jìn)型麥克馬斯特蟲卵計(jì)數(shù)板利用飽和氯化鈉溶液或自來水均可實(shí)現(xiàn)對(duì)固體糞便樣品和液體卵囊懸液樣品中球蟲卵囊進(jìn)行準(zhǔn)確檢測和計(jì)數(shù)，比經(jīng)典麥克馬斯特蟲卵計(jì)數(shù)板功能更強(qiáng)大，為臨床寄生蟲病診斷和寄生蟲學(xué)研究提供更有效、更簡便快捷的工具。