能源甜菜BvHIPP24基因的特性及在酵母中的鎘耐受功能分析

高 卓，譚義雯，魏 多，王錦霞，汪 曼，周婉婷，劉大麗，魯振強

（1黑龍江大學(xué)省高校生化與分子生物學(xué)重點實驗室/生命科學(xué)學(xué)院，哈爾濱 150080；2黑龍江大學(xué)省高校甜菜遺傳育種重點實驗室/現(xiàn)代農(nóng)業(yè)與生態(tài)環(huán)境學(xué)院，哈爾濱 150080）

0 引言

金屬伴侶蛋白(Metallochaperones)是一個大規(guī)模的蛋白質(zhì)家族，它可以結(jié)合金屬離子，并保證將其安全地轉(zhuǎn)運到細胞內(nèi)，避免金屬離子與細胞其他組分發(fā)生有害反應(yīng)[1]。研究發(fā)現(xiàn)，金屬伴侶蛋白在動物、真菌和藻類等生物體中存在的種類較少，但在植物中卻有較多發(fā)現(xiàn)，大致形成了兩種蛋白質(zhì)家族：重金屬相關(guān)植物蛋白(Heavy metal-associated plant proteins，HPPs)和重金屬相關(guān)異戊二烯化植物蛋白(Heavy metalassociated isoprenylated plant proteins，HIPPs)[1-2]。HIPPs的主要特征是其存在一個或兩個重金屬結(jié)合域(HMA)和一個C端異戊二烯基化序列。HMA結(jié)構(gòu)域最初是在動物體中被發(fā)現(xiàn)，后來人們在植物和細菌中也發(fā)現(xiàn)了包含著兩個半胱氨酸核心序列(M/L/IxCxxC)的HMA結(jié)構(gòu)域，其中的核心序列是HMA結(jié)構(gòu)域發(fā)揮作用的關(guān)鍵，它通過與重金屬結(jié)合從而達到維持重金屬平衡的效果[3-4]。例如，在酵母、細菌、動物和植物蛋白中人們研究發(fā)現(xiàn)，大部分的HMA結(jié)構(gòu)域主要與Cu結(jié)合，除此之外，也有少部分的HMA會與Ni或Zn等其他重金屬相結(jié)合[5]。

異戊二烯化，又稱蛋白質(zhì)的法尼化，是一種翻譯后的蛋白質(zhì)修飾[1]。這種修飾作用過程是在蛋白質(zhì)合成后，在酶的催化下對前期蛋白的個別氨基酸殘基進行修飾，從而改變蛋白質(zhì)的功能和性質(zhì)[6]。雖然異戊二烯化和HMA結(jié)構(gòu)域在細菌、動物等許多生物體中都有被發(fā)現(xiàn)，但是兩者都存在于一種蛋白的情況還是只有在植物體中存在[5]。這種獨特的結(jié)構(gòu)使HIPPs在植物體中能夠參與多種生物反應(yīng)，包括維持重金屬穩(wěn)態(tài)和解毒，對干旱和寒冷等非生物脅迫的轉(zhuǎn)錄反應(yīng)以及植物與病原體之間的相互作用等[7-8]。

重金屬脅迫已成為全球各陸地生態(tài)系統(tǒng)關(guān)注的一大主要問題[9]。如今，大規(guī)模的工業(yè)化生產(chǎn)造成了重金屬積累，對土壤和作物生產(chǎn)影響極大[10]。鋅、銅、鉬、錳、鈷和鎳等重金屬對于植物關(guān)鍵的生物反應(yīng)和發(fā)育途徑是必不可少的[11-12]。一些例如砷、鉛、鎘和鉻等劇毒重金屬的過量積累則會在很大程度上影響作物的產(chǎn)量，當(dāng)其濃度超過最優(yōu)值時，這些有毒重金屬會使植物體內(nèi)代謝紊亂，導(dǎo)致植物減產(chǎn)[13-14]。這些異常也會生成活性氧(ROS)，致使細胞氧化還原穩(wěn)態(tài)不平衡，是造成植物體內(nèi)重金屬中毒的主要原因[15]。鎘被認為是植物中最具毒性的重金屬之一。由于易溶于水，它很易于被植物吸收，導(dǎo)致食物鏈?zhǔn)芪廴?，從而對人類健康造成嚴重危害[9]。Suzuki等[16]發(fā)現(xiàn)了一種鎘結(jié)合蛋白(CdI19)，它是在重金屬脅迫下產(chǎn)生的。CdI19的過表達使植物擁有鎘耐受性，這一現(xiàn)象表明了其在體內(nèi)重金屬平衡或解毒中有著重要作用[17]。迄今為止，只有少數(shù)HIPPs被挖掘和研究，在模式植物擬南芥上有著較為詳細的研究。在該物種中，已鑒定出45個HIPPs和 22個 HPPs，其中 AtATX1、AtCCH 和 AtCCS為HPPs[18]。

盡管已經(jīng)報道了一些HIPPs基因在植物體中金屬解毒方面有著不可或缺的功勞，但HIPPs基因在一些生物過程中所起到的作用機制的細節(jié)仍然是未知的。能源甜菜作為一種新興能源作物，它在生物能源開發(fā)以及耐非生物脅迫等方面有著巨大潛能[19]。HIPPs基因在關(guān)于鎘逆境脅迫下其作用機制的報道較為少見，因此，為了進一步了解該基因的特異調(diào)控機制，我們在初期研究了能源甜菜在鎘逆境脅迫下的轉(zhuǎn)錄組表達，并發(fā)現(xiàn)BvHIPP24基因有著明顯的差異表達，再通過進一步的qRT-PCR確定其與鎘耐受相關(guān)。本研究首先克隆了BvHIPP24基因，然后酵母表達載體構(gòu)建該基因，分析BvHIPP24基因在真核酵母細胞中的表達情況，從而更深入地探究該基因在重金屬逆境中解毒的作用機制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

甜菜種子品種為‘780016B/12優(yōu)’，由國家甜菜種質(zhì)資源中期庫（國家甜菜種質(zhì)資源平臺）提供。

1.2 實驗方法

1.2.1 生物信息學(xué)分析 NCBI在線平臺分析能源甜菜BvHIPP24基因的全長編碼框。使用BLASTp對序列進行同源性搜索；利用ExPASy網(wǎng)站上的在線工具ProtParam對能源甜菜BvHIPP24進行蛋白理化特性分析；利用TMHMM在線工具預(yù)測其蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)；通過Signal P4.1在線工具對其蛋白進行信號肽預(yù)測；分別利用SOPMA在線工具和SWISS-MODEL在線網(wǎng)站預(yù)測BvHIPP24蛋白二級結(jié)構(gòu)及三維結(jié)構(gòu)；采用DNAMAN對能源甜菜BvHIPPs家族蛋白進行多重序列對比并利用MEGA-X軟件對其構(gòu)建系統(tǒng)進化樹。

1.2.2 目的基因的克隆 根據(jù)甜菜Beta vulgaris heavy metal-associatedisoprenylatedplantprotein24(BvHIPP24，LOC102905684)基因的堿基序列以及酵母表達載體pYES2的多克隆位點設(shè)計引物：[Forward primer(5′-3′)：CGGGA TCC(BamHI)ATG GGA GTA CAA GGAACT TTG；Reverse primer(5′-3′)：CCGCTC GAG(XhoI)CTA CAT AAT ATAACAAGC ACC]。以First strand cDNA synthesis kit(TOYOBO)反轉(zhuǎn)錄的cDNA為模板，利用KOD-Plus Neo高保真酶(TOYOBO)PCR擴增目的基因全長。將PCR產(chǎn)物連接到克隆載體pEASY-T1(TransGen)上，并轉(zhuǎn)化到Trans1-T1感受態(tài)細胞中。提取陽性克隆質(zhì)粒，利用BamHI和XhoI對提取的重組質(zhì)粒進行限制性內(nèi)切酶酶切鑒定。所獲得的陽性重組質(zhì)粒進一步送往上海生工生物公司測序。

1.2.3 酵母表達載體的構(gòu)建 利用BamHI和XhoI分別雙酶切pEASY-T1-BvHIPP24和pYES2質(zhì)粒。經(jīng)過瓊脂糖凝膠電泳以及膠回收，利用T4 ligase(NEB)將膠回收載體和目的片段于16℃連接過夜。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到Trans1-T1大腸桿菌感受態(tài)細胞中，提取Amp抗性克隆質(zhì)粒DNA，通過BamHI和XhoI鑒定pYES2-BvHIPP24的正確性。重組酵母表達載體轉(zhuǎn)化到酵母InVSc1中備用。

1.2.4 鎘逆境下酵母菌生長曲線的測定 將轉(zhuǎn)入pYES2或pYES2-BvHIPP24的InVSc1菌株培養(yǎng)于SCU(6.7 g/L yeast nitrogen base、200 mg/L-Uracil DO supplement和2% glucose)培養(yǎng)基直到OD600=0.5。收集菌液并將其置于含有0.5 mmol/L CdCl2的YPGDR(1% yeast extract、2% peptone、1.94% galactose、0.06% glucose和1% raffinose)液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，30℃，每2 h測量1次OD值，測量10組數(shù)據(jù)，制作生長曲線。實驗總共重復(fù)3次。

2 結(jié)果與分析

2.1 能源甜菜BvHIPP24基因的生物信息學(xué)分析

能源甜菜BvHIPP24基因的全長編碼框為784 bp，起始密碼子和終止密碼子分別位于271和714個核苷酸的位置，CDS全長444 bp，編碼147個氨基酸（圖1）。利用NCBI網(wǎng)站上的BLASTp對能源甜菜BvHIPP24基因編碼蛋白的氨基酸序列的保守結(jié)構(gòu)域進行分析，預(yù)測到該蛋白含有銅伴侶CopZ和一個HMA結(jié)構(gòu)域（圖2）。

圖1 BvHIPP24基因序列信息

圖2 BvHIPP24蛋白保守結(jié)構(gòu)域分析

利用ExPASy網(wǎng)站上的Protparam線上工具對能源甜菜BvHIPP24基因的氨基酸序列進行理化性質(zhì)分析。結(jié)果顯示其編碼氨基酸數(shù)量為147，共包含19種氨基酸，其中較多的有賴氨酸Lys(15.6%)、纈氨酸Val(9.5%)以及蘇氨酸Thr和甲硫氨酸Met(7.5%)。BvHIPP24氨基酸序列的分子量為16377.34 Da；理論等電點為9.39；不穩(wěn)定系數(shù)為17.54，為穩(wěn)定蛋白；脂肪簇氨基酸指數(shù)為65.65；親水性平均指數(shù)為-0.416，推測該基因所編碼的蛋白為親水性蛋白。利用TMHMM在線工具和Signal P4.1在線工具對能源甜菜BvHIPP24蛋白進行跨膜結(jié)構(gòu)和信號肽預(yù)測，結(jié)果表示該蛋白不含有跨膜區(qū)，為非跨膜類蛋白，且并不含有信號肽。利用WOLF PSORT在線軟件對亞細胞定位預(yù)測，結(jié)果表明，BvHIPP24蛋白主要定位于葉綠體中。應(yīng)用SOPMA在線網(wǎng)站對能源甜菜BvHIPP24蛋白二級結(jié)構(gòu)進行預(yù)測，結(jié)果表明該蛋白α-螺旋占26.53%，β-轉(zhuǎn)角占4.76%，延伸主鏈占20.41%，無規(guī)則卷曲占48.30%。利用SWISS-MODEL在線網(wǎng)站對BvHIPP24蛋白進行三維預(yù)測（圖3），以超氧化物歧化酶銅伴侶的三維結(jié)構(gòu)為模板，其序列相似性為24.66%。

圖3 能源甜菜BvHIPP24蛋白的三級結(jié)構(gòu)預(yù)測

通過在NCBI數(shù)據(jù)庫中搜索獲得20個BvHIPPs基因編碼的蛋白質(zhì)，并利用DNAMAN進行氨基酸序列的比對（圖4），發(fā)現(xiàn)該家族中只在異戊二烯化基序和重金屬結(jié)合結(jié)構(gòu)域存在著一定的同源性，其中BvHIPP24存在一個HMA結(jié)構(gòu)域，C-端含有一個CaaX基序（法尼基轉(zhuǎn)移酶識別基序）。利用MEGA-X構(gòu)建進化樹發(fā)現(xiàn)，BvHIPPs家族蛋白分為兩簇，其中BvHIPP24蛋白與BvHIPP23蛋白具有較近的親緣關(guān)系（圖5）。

圖4 能源甜菜BvHIPPs蛋白多重序列比對

圖5 能源甜菜BvHIPPs家族蛋白的系統(tǒng)進化樹

2.2 能源甜菜BvHIPP24基因的克隆

根據(jù)Beta vulgaris heavy metal-associated isoprenylatedplantprotein24(BvHIPP24，LOC102905684)基因的堿基序列，設(shè)計該基因起始密碼子和終止密碼子帶有BamHI和XhoI酶切位點的特異引物，提取能源甜菜總RNA，擴增該目的基因。如圖6-A所示，經(jīng)過RT-PCR，利用高保真Taq酶擴增BvHIPP24基因，獲得的目的條帶位置在445 bp左右。得到的PCR產(chǎn)物與目標(biāo)片段大小一致。

構(gòu)建表達載體pEASY-T1-BvHIPP24。如圖6-B所示，經(jīng)過E.coli轉(zhuǎn)化后篩選出Amp抗性陽性克隆，提取質(zhì)粒并通過BamHI、XhoI限制性內(nèi)切酶酶切進行鑒定，實驗結(jié)果分別在3.929 kb和445 bp左右的位置上，獲得了載體pEASY-T1以及目的基因片段BvHIPP24的條帶。將陽性重組質(zhì)粒測序，通過Blast堿基序列比對，最終確定成功克隆了BvHIPP24的目的基因。

圖6 能源甜菜BvHIPP24基因的克隆

2.3 酵母pYES2-BvHIPP24表達載體的構(gòu)建

分別將提取到的pYES2和pEASY-T1-BvHIPP24質(zhì)粒進行BamHI和XhoI雙酶切，獲得了有特異性粘性末端的載體以及目的片段（圖7-A）。將獲得的目的條帶膠回收，通過T4連接酶過夜連接以及E.coli轉(zhuǎn)化，得到的Amp抗性克隆的質(zhì)粒DNA再經(jīng)過BamHI以及XhoI雙酶切鑒定，分別在5.9 kb和445 bp左右的位置獲得了相應(yīng)的目的條帶，從而得到正確的酵母重組質(zhì)粒pYES2-BvHIPP24（圖7-B）。將陽性克隆轉(zhuǎn)入酵母InVSc1中進一步檢測并對其進行功能分析。

圖7 pYES2-BvHIPP24重組質(zhì)粒的鑒定

2.4 鎘逆境脅迫下，甜菜BvHIPP24基因在酵母體內(nèi)的功能分析

通過對比誘導(dǎo)BvHIPP24基因表達的酵母菌和轉(zhuǎn)化pYES2空載體的酵母對照菌，分析BvHIPP24基因在鎘逆境下對酵母菌生長是否有重要影響。如圖8所示，在正常生長條件下，酵母在YPD抑制表達培養(yǎng)基和YPGDR誘導(dǎo)培養(yǎng)基的生長趨勢幾乎一致。與之相反，在含有0.5 mmol/L CdCl2的培養(yǎng)基中，無論是對照菌還是重組菌其生長狀態(tài)都受到了抑制，在中后期都呈現(xiàn)下滑的趨勢；然而在YPGDR誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，適量表達的BvHIPP24重組菌的生長狀態(tài)卻遠遠優(yōu)于對照菌。從此可以得出判斷，在酵母中能源甜菜BvHIPP24對于鎘逆境脅迫條件下的生長和耐受性發(fā)揮著重要作用。

圖8 鎘逆境脅迫下重組酵母菌的生長曲線

3 討論與結(jié)論

植物作為固著生物，在接觸重金屬以后會引發(fā)一系列生理和生化上的變化，植物必須采取多種機制來應(yīng)對重金屬毒性所產(chǎn)生的不良后果，并對這些外界的刺激做出反應(yīng)[20]。環(huán)境重金屬污染已成為一個重大的全球性威脅，不僅影響作物產(chǎn)量、土壤生物量和肥力，而且對食物鏈的生物積累也產(chǎn)生了嚴重的影響。這些重金屬主要通過采礦、冶煉、農(nóng)藥化肥使用以及農(nóng)業(yè)、污泥傾倒、工業(yè)排放、大氣沉積等人為因素造成它們不容易被破壞并長期存在于土壤中，對環(huán)境和人類健康構(gòu)成了嚴重的威脅[21]。

非必需重金屬鎘作為環(huán)境中的一種毒害污染物不能被自然降解，會導(dǎo)致蛋白酶失活并且阻斷重要代謝分子的功能基團，從而阻礙植物生長[22]。因此，植物進化出了一系列防御機制來控制這些毒害重金屬的吸收、積累和轉(zhuǎn)運，并通過從細胞質(zhì)中排除游離離子的形式來對其進行解毒[23]。金屬伴侶蛋白就是在安全運輸重金屬離子的過程中扮演著較為重要的角色，此外，金屬伴侶蛋白的不穩(wěn)定性可以促使離子之間的交換，通過蛋白與蛋白之間相互作用將金屬離子運輸?shù)教囟ǖ募毎稽c[17]。重金屬相關(guān)異戊二烯化植物蛋白擁有著在羧基末端的CaaX異戊二烯化蛋白基序和獨特的金屬結(jié)合域，因此在金屬伴侶蛋白家族中極其重要[5,18]。

在前期對鎘逆境脅迫下能源甜菜的轉(zhuǎn)錄組測序中發(fā)現(xiàn)，BvHIPP24基因的差異表達十分顯著。為了進一步分析和佐證BvHIPP24基因在鎘逆境脅迫下的應(yīng)答特性，本研究對能源甜菜BvHIPP24基因進行生物信息學(xué)分析，預(yù)測到該基因含有HMA結(jié)構(gòu)域以及CopZ，其中CopZ蛋白被確認參與Cu2+的運輸[24]，且HMA結(jié)構(gòu)域是金屬伴侶蛋白的重要特征，因此推測BvHIPP24基因與HIPPs家族具有相同功能。將該蛋白與BvHIPPs家族其余成員進行序列比對，發(fā)現(xiàn)其序列差異較大，但都存在HMA結(jié)構(gòu)域和法尼基轉(zhuǎn)移酶識別基序。分析系統(tǒng)進化樹發(fā)現(xiàn)，BvHIPP24蛋白與BvHIPP23親緣關(guān)系較近，同源性較高。利用RT-PCR技術(shù)克隆了該基因的全長序列，構(gòu)建重組質(zhì)粒并將其誘導(dǎo)表達于酵母中。BvHIPP24基因在半乳糖和葡萄糖的適量誘導(dǎo)下表達并對其進行鎘逆境處理，發(fā)現(xiàn)該基因在一定程度上可以提高酵母菌對鎘離子的耐受性。類似的，在Tehseen的研究中報道了擬南芥HIPP20、HIPP22、HIPP26和HIPP27在ycf1酵母突變體中表達增強了酵母細胞對Cd的耐受性[2]。擬南芥CdI19基因在酵母體內(nèi)表達可以提高細胞的鎘耐受性。在小麥TaHIPP1基因的相關(guān)報道中得知，TaHIPP1基因在防御響應(yīng)中扮演著重要角色；在重金屬和高鹽脅迫下，相較于對照組，酵母中的TaHIPP1過表達顯著提高了細胞生長速率，增強了酵母細胞在重金屬和高鹽脅迫下的耐受性[17]。AtCdI19作為一種金屬結(jié)合蛋白，受Cd、Hg、Fe和Cu脅迫誘導(dǎo)，CdI19的過表達賦予轉(zhuǎn)基因擬南芥Cd耐受性[16]。Gao等[25]研究表明HIPP26蛋白能夠與擬南芥中Cd2+、Cu2+、Pb2+結(jié)合，使AtHIPP26過量表達，從而增強擬南芥對Cd2+的耐受性。這些結(jié)果揭示了HIPPs家族具有結(jié)合Cd2+的能力，在鎘逆境解毒機制中發(fā)揮作用。

本文對能源甜菜BvHIPP24基因應(yīng)答鎘脅迫展開研究，利用生物信息學(xué)分析預(yù)測BvHIPP24含有HMA結(jié)構(gòu)域，屬于金屬伴侶蛋白，且與BvHIPP23有著較近的親緣關(guān)系。通過RT-PCR技術(shù)克隆了BvHIPP24基因，利用酵母表達載體構(gòu)建重組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化到真核酵母細胞中誘導(dǎo)其表達，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在鎘逆境脅迫下適量表達BvHIPP24基因的酵母表現(xiàn)出優(yōu)于對照pYES2酵母菌的生長狀態(tài)，表明能源甜菜BvHIPP24基因可以提高酵母菌在鎘脅迫下的耐受性?？傊?，通過本研究及以往的報道可以得出結(jié)論，能源甜菜BvHIPP24基因與鎘逆境脅迫之間存在著一定的應(yīng)答關(guān)系，該基因能夠與Cd2+在體內(nèi)結(jié)合，在植解毒Cd中發(fā)揮著重要作用，使酵母對重金屬的耐受性提高。研究也為更深一步對BvHIPP24基因的功能開發(fā)奠定基礎(chǔ)。