高壓靜電場(chǎng)處理對(duì)甘薯采后愈傷的促進(jìn)效應(yīng)

成紀(jì)予 舒志建 金佳平 路興花 陸國(guó)權(quán) 龐林江

(浙江農(nóng)林大學(xué)農(nóng)業(yè)與食品科學(xué)學(xué)院，浙江省農(nóng)產(chǎn)品品質(zhì)改良技術(shù)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，杭州 311300)

甘薯皮薄質(zhì)嫩，含水量高，不耐貯藏，在采收和貯運(yùn)中易受到機(jī)械損傷，而損傷是造成甘薯采后損耗的主要因素。高溫處理(29～38 ℃)可有效促進(jìn)甘薯采后愈傷[1]，但貯存空間、能源消耗及經(jīng)濟(jì)投入大[2]。據(jù)報(bào)道，外源乙烯、一氧化氮、赤霉素(GA3)、脫落酸(ABA)、苯丙氨酸、殼聚糖、水楊酸(SA)、苯丙噻重氮(BTH)等化學(xué)物質(zhì)處理能提高采后馬鈴薯或甘薯的苯丙烷代謝[3-7]，促進(jìn)代謝產(chǎn)物木質(zhì)素的積累，具有加快愈傷效果，但化學(xué)方法具有操作不便、潛在危害和環(huán)境污染等缺點(diǎn)，在實(shí)際應(yīng)用上會(huì)受到較大的限制。因此，研究與開(kāi)發(fā)新型實(shí)用的甘薯愈傷技術(shù)對(duì)于促進(jìn)甘薯采后愈傷效果，提高耐貯性和貯藏品質(zhì)具有重要意義。

高壓靜電場(chǎng)屬于電磁微能，作為一種物理技術(shù)，具有操作簡(jiǎn)便、無(wú)毒無(wú)害、對(duì)環(huán)境無(wú)殘留無(wú)污染等優(yōu)點(diǎn)，可用于食品保鮮領(lǐng)域[8]?？臻g磁場(chǎng)的改變會(huì)造成植物體的細(xì)胞分裂[9]、細(xì)胞增殖[10]、基因表達(dá)[11]、抗病性[12]及酶活性[13]等方面發(fā)生變化。丹陽(yáng)等[14]研究發(fā)現(xiàn)短時(shí)間的高壓靜電場(chǎng)處理可以抑制黃瓜細(xì)胞膜透率的上升；曹學(xué)成等[15]表明高壓靜電場(chǎng)處理能夠提高黃瓜種子中過(guò)氧化氫酶(CAT)的活性，清除細(xì)胞內(nèi)多余的H2O2，減輕由氧化帶來(lái)的傷害；趙劍等[16]認(rèn)為靜電場(chǎng)預(yù)處理大豆種子可以修復(fù)膜損傷部位。高壓靜電場(chǎng)對(duì)海棠[17]、煙草[18]、銀杏[19]等愈傷組織的生長(zhǎng)和再分化具有促進(jìn)作用?？梢?jiàn)，施加高壓靜電場(chǎng)可以調(diào)控植物生理代謝，但是，不同的高壓靜電場(chǎng)處理參數(shù)對(duì)生物體的作用效應(yīng)影響各異。

本研究以‘心香’甘薯為材料，進(jìn)行人工機(jī)械損傷，通過(guò)單因素和響應(yīng)面法優(yōu)化高壓靜電場(chǎng)愈傷條件，以木質(zhì)素含量為考察指標(biāo)，建立可信的數(shù)學(xué)模型，獲得電場(chǎng)促進(jìn)甘薯愈傷的最佳電場(chǎng)強(qiáng)度、處理時(shí)間及處理溫度參數(shù)；并監(jiān)測(cè)電場(chǎng)處理對(duì)損傷甘薯愈傷效率的影響程度。以期為高壓靜電場(chǎng)在甘薯采后愈傷和貯藏保鮮中的應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鮮食型甘薯品種：心香。挑選無(wú)機(jī)械損傷、無(wú)病蟲(chóng)害、無(wú)發(fā)芽霉變、大小均勻(單個(gè)質(zhì)量約50 g)的薯塊為實(shí)驗(yàn)材料。無(wú)水乙醇、鹽酸、硫酸、三氯乙酸(TCA)、硫代巴比妥酸(TBA)、氫氧化鈉，均為分析純。

1.2 儀器設(shè)備

HWS-250FT智能恒溫恒濕實(shí)驗(yàn)箱(控溫范圍0～50 ℃，精度為±0.5 ℃；控濕范圍50%～90%RH，精度為±2%；外形尺寸為550 mm×610 mm×1 760 mm)。高壓靜電場(chǎng)發(fā)生儀(包含主機(jī)和2塊發(fā)射板，實(shí)驗(yàn)時(shí)將電場(chǎng)發(fā)射板平行安裝于智能恒溫恒濕實(shí)驗(yàn)箱的頂部和底部，兩塊發(fā)射板間距離可調(diào)，可形成30～1 500 kV/m的負(fù)高壓靜電場(chǎng))，T6新世紀(jì)紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，DGG-9053AD電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱，3K15型離心機(jī)，KQ 5200B型超聲波清洗器，BCD-212(KK21E68T1)冰箱。

1.3 處理方法

1.3.1 甘薯人工損傷處理

將甘薯用濃度為0.2%的次氯酸鈉溶液清洗消毒，自然晾干后隨機(jī)分組，每組30個(gè)甘薯，甘薯的損傷方式為沿著赤道橫向切開(kāi)兩半[20]。在愈傷過(guò)程中甘薯的擺放呈平鋪無(wú)堆疊的狀態(tài)，以保證溫度的均勻分布和各個(gè)樣品的受熱均勻性。

1.3.2 高壓靜電場(chǎng)處理單因素實(shí)驗(yàn)

以電場(chǎng)強(qiáng)度、處理時(shí)間和處理溫度為考察因素，用木質(zhì)素含量評(píng)價(jià)高壓靜電場(chǎng)處理對(duì)甘薯愈傷的影響。

電場(chǎng)強(qiáng)度對(duì)甘薯愈傷的影響：將人工損傷后甘薯分別置于0、200、400、600、800、1 000 kV/m電場(chǎng)環(huán)境中作用8 h，作用溫度25 ℃，RH為85%～90%，在愈傷第4天取出檢測(cè)，篩選出較適宜的電場(chǎng)施加強(qiáng)度。同時(shí)與常規(guī)的高溫愈傷處理(35 ℃，RH為85%～90%作對(duì)比。

處理時(shí)間對(duì)甘薯愈傷的影響：將人工損傷后甘薯在25 ℃、RH為85%～90%、800 kV/m的電場(chǎng)環(huán)境中分別作用4、8、12、16、20 h，在愈傷第4天取出檢測(cè)，篩選出較適宜的電場(chǎng)處理時(shí)間。

處理溫度對(duì)甘薯愈傷的影響：將人工損傷后甘薯分別置于10、15、20、25、30、35 ℃的800 KV/m電場(chǎng)環(huán)境中作用12 h，在愈傷第4 d取出檢測(cè)，篩選出較適宜的電場(chǎng)處理溫度。

1.3.3 高壓靜電場(chǎng)處理響應(yīng)面優(yōu)化

在單因素基礎(chǔ)上，根據(jù)Box-behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化，以木質(zhì)素含量為指標(biāo)，考察電場(chǎng)強(qiáng)度、處理時(shí)間及處理溫度對(duì)甘薯愈傷效應(yīng)的影響，因素與水平見(jiàn)表1。

表1 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)因素與水平表

1.4 測(cè)定方法

1.4.1 木質(zhì)素含量

愈傷后用切取甘薯傷口部位及皮下3 mm厚的薯肉組織用于木質(zhì)素含量檢測(cè)。稱(chēng)取5.0 g甘薯樣品M0與15 mL 72% H2SO4于25 ℃靜置1 h，再加345 mL蒸餾水將硫酸濃度稀釋至3%，100 ℃水浴回流3 h后過(guò)濾懸浮液，并用50 ℃左右的溫水將木質(zhì)素連同濾紙M1一起洗滌至中性，將木質(zhì)素連同濾紙一并移入稱(chēng)量瓶，105 ℃烘干至恒重M2。計(jì)算公式為：木質(zhì)素質(zhì)量分?jǐn)?shù)=(M2-M1)/M0×100%。

1.4.2 間苯三酚染色

在甘薯傷口表面滴加2～3滴1 mol/L鹽酸，然后滴加2～3滴5%～10%間苯三酚的85%酒精溶液，根據(jù)染色區(qū)域和顏色深淺檢驗(yàn)愈傷程度[7]。

1.4.3 相對(duì)電導(dǎo)率

切取相同甘薯愈傷部位圓片(直徑×厚度，Ф20 mm×2 mm)，在50 mL去離子水中輕微振蕩3 h，測(cè)定并記錄電導(dǎo)率P1，然后沸水水浴30 min，冷卻后測(cè)定并記錄電導(dǎo)率P2[21]。計(jì)算公式為：相對(duì)電導(dǎo)率=P1/P2×100%。

1.4.4 丙二醛(MDA)含量

取樣方法與木質(zhì)素含量檢測(cè)一致。稱(chēng)取1.0 g甘薯樣品與5 mL 100 g/L三氯乙酸(TCA)溶液，充分研磨成勻漿，于4 ℃、10 000×g離心15 min，收集上清液備用。取1 mL上清液，加入2 mL 0.67%硫代巴比妥酸(TBA)溶液，混勻并煮沸30 min，冷卻后取上清液分別在532、600、450 nm測(cè)定吸光值[21]。上清液MDA含量計(jì)算公式為：MDA含量(μmol/L)=6.45×(OD532 nm-OD600 nm)，再計(jì)算出愈傷組織樣品的MDA含量，單位以μmol/gFW計(jì)。

1.5 數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，實(shí)驗(yàn)結(jié)果以平均值±SD表示。采用OriginPro 2018軟件繪圖；用SPSS 17.0軟件進(jìn)行差異顯著性分析，數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)采用Duncan’s統(tǒng)計(jì)分析，P<0.05表明差異顯著，P<0.01表示差異極顯著；用Design-Expert 8.0軟件進(jìn)行響應(yīng)面設(shè)計(jì)與方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 電場(chǎng)強(qiáng)度對(duì)甘薯愈傷的影響

木質(zhì)素是創(chuàng)傷次生周皮的主要組成物質(zhì)，其含量的合成和積累反映植物細(xì)胞壁木質(zhì)化的進(jìn)程[22]。由圖1可知，不同強(qiáng)度的高壓靜電場(chǎng)處理對(duì)甘薯?yè)p傷部位木質(zhì)素含量的影響不同， 0～800 kV/m木質(zhì)素含量隨電場(chǎng)強(qiáng)度的增大而升高，800～1 000 kV/m木質(zhì)素含量反而略有降低，這可能是因?yàn)檫^(guò)強(qiáng)的電場(chǎng)處理反而削弱木質(zhì)素的合成代謝。800 kV/m電場(chǎng)強(qiáng)度下，甘薯?yè)p傷部位的木質(zhì)素含量顯著高于其他處理組(P<0.05)，表明常溫下電場(chǎng)強(qiáng)度達(dá)800 kV/m時(shí)利于甘薯的愈傷，且較高溫處理具有更好的愈傷效果。

2.1.2 處理時(shí)間對(duì)甘薯愈傷的影響

由圖1可見(jiàn)，電場(chǎng)處理時(shí)間長(zhǎng)短影響甘薯?yè)p傷部位木質(zhì)素的合成量。從0～12 h，木質(zhì)素含量隨時(shí)間的增加而上升；從12～20 h，木質(zhì)素含量隨時(shí)間的增加略有下降，這說(shuō)明過(guò)長(zhǎng)的電場(chǎng)處理時(shí)間反而會(huì)減弱木質(zhì)素的合成，推測(cè)可能是因?yàn)殡妶?chǎng)強(qiáng)度對(duì)木質(zhì)素合成代謝相關(guān)酶活性的影響存在閾值，超過(guò)一定強(qiáng)度會(huì)改變相關(guān)酶的功能，導(dǎo)致木質(zhì)素合成量減少，其具體機(jī)理有待更深入的研究。處理12 h時(shí)甘薯?yè)p傷部位的木質(zhì)素含量顯著高于其他處理組(P<0.05)，表明處理時(shí)間為12 h利于甘薯愈傷組織的形成。

2.1.3 處理溫度對(duì)甘薯愈傷的影響

由圖1可知，電場(chǎng)作用溫度不同，甘薯?yè)p傷部位木質(zhì)素的合成量亦有所不同。隨溫度增加，木質(zhì)素含量呈先上升后下降的趨勢(shì)。10～25 ℃木質(zhì)素含量顯著增加(P<0.05)，25～35 ℃的電場(chǎng)作用下，木質(zhì)素含量顯著降低(P<0.05)，推斷可能是溫度過(guò)高會(huì)導(dǎo)致合成木質(zhì)素的一些酚類(lèi)前體物質(zhì)氧化速度加快，從而造成合成量減少。25 ℃下電場(chǎng)處理甘薯愈傷部位的木質(zhì)素含量最高，且與其他溫度下處理均差異顯著(P<0.05)，表明處理溫度為25 ℃時(shí)利于甘薯愈傷組織的形成。

注：圖中相同字母表示不同條件之間無(wú)顯著性差異(P>0.05)；不同字母表示不同條件之間有顯著性差異(P<0.05)。圖1 不同處理?xiàng)l件下甘薯愈傷部位的木質(zhì)素含量

2.2 響應(yīng)面優(yōu)化結(jié)果

響應(yīng)面分析方案及結(jié)果如表2所示。通過(guò)多元回歸擬合，得到木質(zhì)素含量對(duì)電場(chǎng)強(qiáng)度(A)、作用時(shí)間(B)和作用溫度(C)的二次多項(xiàng)回歸模型為：y=4.62+0.11A-0.45B+0.59C+0.17AB+0.082AC-0.24BC-0.66A2-0.53B2-1.12C2。由表3可知，該模型極顯著(P<0.001)，方程失擬項(xiàng)不顯著(P>0.05)，且實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ偷臎Q定系數(shù)RAdj2為0.950 6，說(shuō)明該模型擬合程度較好，可用于高壓靜電場(chǎng)促進(jìn)甘薯的愈傷處理?xiàng)l件的分析與預(yù)測(cè)。

表2 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

表3 回歸模型方差分析

由表4可知，模型一次項(xiàng)A差異不顯著，B和C差異極顯著(P<0.01)；交互項(xiàng)AB和BC差異顯著，AC差異不顯著；二次項(xiàng)A2、B2和C2差異均極顯著。各因素的主效應(yīng)關(guān)系為：處理溫度>處理時(shí)間>電場(chǎng)強(qiáng)度。由回歸方程模型分析各因素間與響應(yīng)值的交互效應(yīng)，結(jié)果顯示三者兩兩交互作用響應(yīng)面曲線圖均為球形，等高線均為橢圓性，反映三因素兩兩交互作用明顯，且電場(chǎng)強(qiáng)度、處理時(shí)間及處理溫度的增加到一定程度時(shí)，木質(zhì)素含量反而降低，說(shuō)明高壓靜電場(chǎng)施加作用過(guò)于強(qiáng)烈反而不利于甘薯愈傷組織的形成。

表4 回歸模型系數(shù)顯著性檢驗(yàn)表

結(jié)合二次回歸模型的分析結(jié)果，得到高壓靜電場(chǎng)促進(jìn)甘薯愈傷的最佳處理參數(shù)為：電場(chǎng)強(qiáng)度為808.5 kV/m、處理時(shí)間為10.1 h、作用溫度為26.6 ℃，在此條件下獲得甘薯?yè)p傷部位木質(zhì)素質(zhì)量分?jǐn)?shù)的理論值為4.83%。為檢驗(yàn)優(yōu)化結(jié)果的可靠性，同時(shí)考慮實(shí)際操作方便性，將各參數(shù)修正為：電場(chǎng)強(qiáng)度為800 kV/m、處理時(shí)間為10.0 h、作用溫度為26.0 ℃，在此條件下進(jìn)行愈傷處理，木質(zhì)素質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4.82%，與理論值僅相差0.2%，說(shuō)明該模型可靠，經(jīng)優(yōu)化得到的電場(chǎng)處理?xiàng)l件可靠。

2.3 電場(chǎng)處理對(duì)甘薯愈傷的促進(jìn)作用

2.3.1 間苯二酚染色情況

間苯三酚染色染色區(qū)域越大、顏色越深表明甘薯切面愈合程度越高[23]。染色結(jié)果顯示，愈傷期間，靜電場(chǎng)處理和高溫處理組的甘薯切口處染色后顏色均比對(duì)照處理組的深，愈傷4 d后，甘薯切面?zhèn)谟铣潭让黠@好于對(duì)照組。在愈傷1、2 d，靜電場(chǎng)處理組甘薯傷口處的染色深度和染色面積均比高溫處理組更為明顯，反映出愈傷前期靜電場(chǎng)處理更快地誘導(dǎo)木質(zhì)素的生成。

2.3.2 相對(duì)電導(dǎo)率的變化

細(xì)胞膜透性是評(píng)價(jià)細(xì)胞組織完整性的重要指標(biāo)[24]，細(xì)胞膜透性的大小可用相對(duì)電導(dǎo)率衡量；相對(duì)電導(dǎo)率越大，表示電解質(zhì)的滲透量越多，細(xì)胞膜完整性遭到破壞的程度就越大。由圖2可知，甘薯切口部位的相對(duì)電導(dǎo)率總體呈上升的變化趨勢(shì)，高溫處理組和電場(chǎng)處理組的上升幅度與上升速度均顯著低于對(duì)照組(P<0.05)。愈傷4 d后，高溫處理組和電場(chǎng)處理組的甘薯細(xì)胞膜透率分別為4.0%和3.5%左右，顯著低于對(duì)照組(P<0.05)，兩組之間無(wú)顯著性差異(P>0.05)?？梢?jiàn)，高溫處理和電場(chǎng)處理促進(jìn)了傷口愈合的速度，從而大大減輕損傷給甘薯帶來(lái)的細(xì)胞物質(zhì)交換失衡現(xiàn)象，緩解細(xì)胞液滲漏現(xiàn)象。

注：圖中相同字母表示同一時(shí)間下不同條件之間無(wú)顯著性差異(P>0.05)；不同字母表示同一時(shí)間下不同條件之間有顯著性差異(P<0.05),下同。圖2 愈傷期間損傷甘薯相對(duì)電導(dǎo)率的變化

2.3.3 丙二醛含量的變化

丙二醛(MDA)是膜脂過(guò)氧化作用的最終產(chǎn)物，也是衡量細(xì)胞膜膜透性的重要指標(biāo)之一[25]。由圖3可知，機(jī)械損傷造成甘薯細(xì)胞結(jié)構(gòu)的破壞，使得膜脂的過(guò)氧化作用加劇，MDA含量上升。甘薯?yè)p傷1 d時(shí)，對(duì)照組、高溫處理組和電場(chǎng)處理組的MDA含量分別增加4.4倍、4.6倍和3.8倍，3個(gè)處理間無(wú)顯著差異(P>0.05)。但隨著愈傷時(shí)間延長(zhǎng)，電場(chǎng)處理組的MDA含量則明顯低于對(duì)照組和高溫處理組(P<0.05)。對(duì)照組傷口愈合速度慢，使得受損細(xì)胞的膜脂過(guò)氧化作用時(shí)間也增加；而高溫處理雖然傷口可以得到較好愈合，但是高溫下會(huì)加速過(guò)氧化反應(yīng)的速度。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，電場(chǎng)處理能抑制因機(jī)械損傷導(dǎo)致的膜脂過(guò)氧化反應(yīng)，減少膜脂過(guò)氧化物的積累，使MDA含量在愈傷期間維持在較低水平。

圖3 愈傷期間損傷甘薯MDA含量變化情況

3 討論

木質(zhì)素作為植物細(xì)胞壁的主要成分之一，其含量高低反映細(xì)胞壁木質(zhì)化程度，與植物抗病性密切相關(guān)[26]。綜合本研究結(jié)果進(jìn)行分析，不同電場(chǎng)愈傷條件對(duì)甘薯受損部位木質(zhì)素的積累表現(xiàn)出不同的影響，電場(chǎng)強(qiáng)度為800 kV/m、處理時(shí)間為10.0 h和處理溫度為26.0 ℃時(shí)表現(xiàn)出更高的木質(zhì)素的生長(zhǎng)速率和合成量，且對(duì)受損細(xì)胞膜的修復(fù)能力更為明顯。通過(guò)外源處理促進(jìn)愈傷組織的木質(zhì)素大量積累，加速細(xì)胞壁木栓化，可以提高受損組織的愈傷效果，本研究與王連平等[4]研究結(jié)果相類(lèi)似。丹陽(yáng)等[27]、岑劍偉等[28]的研究也表明高壓靜電場(chǎng)處理能更好地維持黃瓜、羅非魚(yú)貯藏期間細(xì)胞的完整性，減緩品質(zhì)的劣變速度。因此，選擇合適的高壓靜電場(chǎng)處理參數(shù)對(duì)提高甘薯采后愈傷效應(yīng)具有重要意義。木質(zhì)素的合成與植物體的苯丙烷代謝密切相關(guān)[29]，通過(guò)誘導(dǎo)調(diào)節(jié)苯丙烷代謝中PAL、C4H和4CL等關(guān)鍵酶的活性和基因表達(dá)，可增加木質(zhì)素及其他抗菌物質(zhì)的合成[30-32]，抑制病原菌侵染。已有研究表明一定劑量的高壓靜電場(chǎng)處理可提高植物組織的SOD酶活性、降低POD酶和IAA氧化酶活性，誘導(dǎo)植物愈傷組織的生長(zhǎng)和形成[18，19]。由此，可推測(cè)高壓靜電場(chǎng)處理可能通過(guò)增強(qiáng)甘薯愈傷組織苯丙烷代謝促進(jìn)木質(zhì)素的沉積，但其對(duì)木質(zhì)素積累的生物學(xué)調(diào)控機(jī)制尚不清楚，有待進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論

通過(guò)比較對(duì)照、高溫處理與高壓靜電場(chǎng)處理對(duì)機(jī)械損傷甘薯切口部位木質(zhì)素合成的影響，發(fā)現(xiàn)高壓靜電場(chǎng)處理具有促進(jìn)甘薯采后愈傷的潛在效應(yīng)。本實(shí)驗(yàn)在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用響應(yīng)面法優(yōu)化電場(chǎng)處理參數(shù)，探究適宜的電場(chǎng)強(qiáng)度、處理時(shí)間和處理溫度，對(duì)促進(jìn)甘薯采后愈傷作用具有指導(dǎo)意義。結(jié)果表明，高壓靜電場(chǎng)處理的最佳處理參數(shù)為：電場(chǎng)強(qiáng)度為800 kV/m、處理時(shí)間為10.0 h、作用溫度為26.0 ℃，在此條件下進(jìn)行愈傷處理，木質(zhì)素合成含量較高。同時(shí)，在愈傷期間，高壓靜電場(chǎng)處理組受損薯塊的相對(duì)電導(dǎo)率和MDA含量均低于對(duì)照組；且較高溫處理相比，高壓靜電場(chǎng)處理作用下可降低膜脂過(guò)氧化程度。表明適宜的電場(chǎng)處理可在一定程度上減輕機(jī)械損傷對(duì)細(xì)胞組織帶來(lái)的傷害，保護(hù)細(xì)胞膜的完整性，促進(jìn)甘薯愈傷，從而增強(qiáng)甘薯貯藏期間的抗病性。