麥麩阿魏酸低聚糖酯組分的結(jié)構(gòu)表征及其對美拉德反應(yīng)產(chǎn)物抑制作用研究

趙文紅 馮麗然 關(guān)二旗

(河南工業(yè)大學(xué)糧油食品學(xué)院，鄭州 450001)

谷物皮層含有多種具有抗氧化活性的酚類物質(zhì)[1]，并且主要以結(jié)合態(tài)的形式存在[2]，具代表性的是麩皮中的阿魏酸低聚糖酯(Feruloylated Oligosaccharides，F(xiàn)Os)(圖1)。基于其結(jié)合態(tài)酚酸結(jié)構(gòu)特征，F(xiàn)Os具有水溶性好、熱穩(wěn)定性高的優(yōu)點[3]，在2010年被美國FDA批準其作為食品添加劑在焙烤食品、飲料等加工食品中使用。

已有研究報道阿魏酸(FA)能夠通過清除自由基、直接或間接抑制反應(yīng)產(chǎn)物生成等方式影響美拉德反應(yīng)[4]。但是FOs作為新型的功能性添加劑對美拉德反應(yīng)產(chǎn)物的影響研究鮮見報道。丙酮醛(MGO)、乙二醛(GO)和2, 3-丁二酮(2, 3-BD)是美拉德反應(yīng)過程中產(chǎn)生的α-二羰基化合物，既是形成食品風(fēng)味和色澤物質(zhì)的重要中間物質(zhì)[5]，同時作為糖基化劑，可參與美拉德反應(yīng)晚期糖基化終末產(chǎn)物(AGEs)的形成，對人體造成危害[6]。MGO和GO的半數(shù)細胞毒性濃度為300～1 000 μmol/L[7]，2, 3-BD引起乳糖不耐癥和氧化應(yīng)激等[8]。谷物皮層中的酚類物質(zhì)活性受到單糖組成、酚酸含量、空間構(gòu)型及溶解度等理化的影響[9,10]，需要明晰其結(jié)構(gòu)才能更好的闡明其活性。因此，本研究即在結(jié)構(gòu)表征麥麩FOs組分F3的基礎(chǔ)上，研究其對模擬體系中美拉德反應(yīng)產(chǎn)物的抑制作用，為高活性FOs組分的篩選與制備提供參考，促進谷物資源功能性因子的開發(fā)和應(yīng)用。

(5-O-FA-α-L-Ara)-(1→3)-[O-β-D-Xyl]n圖1 阿魏酸糖酯基本結(jié)構(gòu)

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

材料：麥麩；Amberlite XAD-2吸附樹脂；Sephadex LH-20凝膠填料

試劑：阿魏酸、木糖和阿拉伯糖標準品；聚苯乙烯標準品；甘氨酸、鄰苯二胺、葡萄糖、谷朊粉、乙二醛、丙醛酮、2, 3-丁二酮、鄰苯二酚。甲醇、乙酸和乙腈為色譜純試劑，其他試劑均為分析純試劑。

1.2 設(shè)備與儀器

RE-6000A 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器，LGJ-10C冷凍干燥機，UV-6300系列可見光光度計，ALPHA傅里葉紅外光譜儀，7890氣相色譜儀，1260 Infineity Ⅱ 高效液相色譜儀。

1.3 方法

1.3.1 F3的制備

F3的制備見文獻[11]。收集合并第三個吸收峰對應(yīng)的洗脫液，濃縮后冷凍干燥即得麥麩阿魏酸糖酯組分(F3)。

1.3.2 F3的紫外光譜分析

以阿魏酸標準品為對照，采用紫外可見分光光度計對1.3.1中組分F3樣液(1 mg/mL)進行紫外全波長掃描(220～400 nm)及組分的定性鑒別。

1.3.3 F3的結(jié)構(gòu)表征1.3.3.1 HPLC分析

F3經(jīng)堿解處理后采用HPLC法檢測并分析其酚酸組成[12]。改良實驗操作為：取1 mL組分F3樣液(1 mg/mL)與1 mL氫氧化鈉溶液(0.4 mol/L)混勻后置于35 ℃的暗處堿解3 h；待冷卻后，加入1.5 mL的H3PO4溶液(0.4 mol/L)終止該反應(yīng)；堿解液經(jīng)0.45 μm有機濾膜過濾后，以阿魏酸標準品為對照進行HPLC檢測。

HPLC檢測采用C18 inertsil ODS-3色譜柱(4.6 mm×250 mm×5 μm)；V(甲醇)∶V(1%醋酸溶液)=0.30∶0.70的流動相；設(shè)定流速為1.0 mL/min；檢測波長320 nm；柱溫：40 ℃；進樣量：10 μL。

1.3.3.2 GC分析

參考Yu[13]的方法，1.3.1中組分F3制成三氟乙酸溶液(2 mol/L)置于120 ℃油浴保溫水解2 h；后經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)干燥后加入50 mg鹽酸羥胺和0.5 mL吡啶，混合后置于90 ℃水浴中反應(yīng)15 min；再加入0.5 mL乙酸酐繼續(xù)于90 ℃保溫20 min；反應(yīng)完成后旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)干燥即得組分F3水解成分乙?；苌?。該衍生物以三氯甲烷溶解后，以木糖和阿拉伯糖標準品為對照進行GC檢測與分析。

GC檢測采用HP-5毛細管柱(30 m×320 μm×250 μm)；載氣流速：氫氣40 mL/min，空氣450 mL/min，氮氣25 mL/min；柱溫：100 ℃；進樣口溫度：200 ℃；檢測器：FID；檢測器溫度：250 ℃；進樣量：1.0 μL。程序升溫。

1.3.3.3 IR分析

取1.3.1步驟中1 mg組分F3置于瑪瑙研缽中，加入100 mg KBr混勻；研磨混合粉末后置于壓模器，加壓制得膜片后在500～4 000 cm-1掃描范圍內(nèi)進行IR檢測與分析。

1.3.3.4 平均相對分子質(zhì)量的分析

用1.0 mL四氫呋喃溶解不同分子質(zhì)量的聚苯乙烯標準品(分子質(zhì)量分別為210、580、850、1 300、1 780 u)，加入25%乙醇水配制成2.0 mg/mL的標準溶液；采用Sephadex LH-20色譜層析柱，以V(四氫呋喃)∶V(25%乙醇水)=1∶10的流動相在0.5 mL/min的流速下，測得不同分子質(zhì)量聚苯乙烯標準品的洗脫圖譜；以分子質(zhì)量為縱坐標，保留時間為橫坐標，繪制并得到分子質(zhì)量-保留時間標準曲線及其方程。

將F3樣品(6 mL)上樣于同一個Sephadex LH-20色譜層析柱；在相同條件下洗脫得到其洗脫圖譜；讀取其相應(yīng)的保留時間，依照上述方程計算得到該組分的平均相對分子質(zhì)量，并結(jié)合其GC、HPLC和IR結(jié)構(gòu)表征結(jié)果解析其組成。

1.3.4 F3對美拉德反應(yīng)模擬體系中間產(chǎn)物的影響1.3.4.1 α-二羰基化合物標準曲線的繪制

參考吳泰鋼等[14]方法，分別取2.0 mL濃度為2、4、10、20、40、100 μg/mL的MGO、GO和2, 3-BD溶液，加入2.0 mL鄰苯二酚(0.6%)后置于60 ℃水浴鍋中反應(yīng)4 h進行衍生化處理，反應(yīng)結(jié)束后反應(yīng)液過0.45 μm有機濾膜，進HPLC檢測分析。

HPLC檢測條件為：ZORBAX SB-C18柱(4.6 mm×150 mm×5 μm)色譜柱；V(乙腈)∶V(0.1%醋酸溶液)=0.30∶0.70流動相；流速為1.0 mL/min；檢測波長為315 nm；柱溫為40 ℃；進樣量為10 μL。以樣品濃度為橫坐標，對應(yīng)的峰面積為縱坐標繪制三種α-二羰基化合物標準曲線。

1.3.4.2 F3對α-二羰基化合物生成的影響測定

參考姚勝文[15]和黃啟瑞[16]的方法經(jīng)改良利用葡萄糖和谷朊粉構(gòu)建美拉德反應(yīng)體系。以0.1 mol/L檸檬酸溶液和0.2 mol/L磷酸氫二鈉溶液配制pH為8.0的緩沖溶液；準確稱取7.0 g葡萄糖用pH 8.0的磷酸緩沖液溶解后定容至100 mL，配制為80 mg/mL的葡萄糖溶液；用pH 8.0的磷酸緩沖液配制F3溶液，分別取0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL F3溶液(50 mg/mL)加入緩沖液使終體積為1.0 mL；分別加入10 mL葡萄糖溶液和0.3 g谷朊粉，充分混勻后放入預(yù)升溫至120 ℃的烘箱中反應(yīng)60 min，之后在冰水浴中終止反應(yīng)；反應(yīng)液定容至15 mL，以5 000 r/min離心10 min，取上清液2.0 mL加入2.0 mL鄰苯二酚，60 ℃水浴4 h進行衍生處理；反應(yīng)結(jié)束后過0.45 μm有機濾膜進行HPLC檢測(檢測條件同前)。以FA為對照，依據(jù)相應(yīng)的α-二羰基化合物的標準曲線計算得出相應(yīng)濃度，并按照以下公式計算F3對α-二羰基化合物的抑制率：

式中：C0為反應(yīng)混合物中不含F(xiàn)3或FA時α-二羰基化合物的濃度/μg/mL；C1為反應(yīng)混合物中含有F3或FA時α-二羰基化合物的濃度/μg/mL。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

2 結(jié)果與分析

2.1 F3的定性鑒別

F3和FA經(jīng)紫外全波長掃描圖譜見圖2。Jankovska等[17]的研究認為，與游離阿魏酸中苯環(huán)的特征吸收位置相比，酯化阿魏酸的吸收會出現(xiàn)一定程度的紅移。由圖2結(jié)果可見，F(xiàn)3在325 nm左右出現(xiàn)最大吸收峰，與FA在310 nm處的吸收相比出現(xiàn)吸收紅移現(xiàn)象。該研究結(jié)果與前人研究一致。紫外全波長掃描圖譜結(jié)果表明，F(xiàn)3結(jié)構(gòu)中可能含有酯化酚酸結(jié)構(gòu)，即F3為結(jié)合型谷物酚類物質(zhì)。

圖2 Sephadex LH-20凝膠柱洗脫組分F3和FA的紫外全波長掃描圖譜

2.2 F3的結(jié)構(gòu)分析

2.2.1 F3中的酚酸成分

酯化酚酸經(jīng)堿水解后經(jīng)HPLC法檢測可鑒別其結(jié)構(gòu)中含有的酚酸成分，結(jié)果見圖3。F3經(jīng)堿解處理后在16.380 min和19.051 min處出現(xiàn)檢出峰(圖3a)；與FA標準品的HPLC出峰時間16.362 min(反式FA)和19.066 min(順式FA)相近(圖3b)。結(jié)果表明：F3中的酚酸成分為阿魏酸。

圖3 F3堿水解(a)及阿魏酸標品(b)的HPLC圖譜

2.2.2 F3中的單糖組成

F3水解產(chǎn)物經(jīng)GC檢測可分析其單糖組成，結(jié)果見圖4。GC結(jié)果可知：F3中主要在16.536 min和16.965 min處出峰(圖4a)；與阿拉伯糖的保留時間16.776 min(圖4b)、木糖(圖4c)的保留時間17.150 min相近。結(jié)果表明：組分F3結(jié)構(gòu)中糖體部分由阿拉伯糖和木糖組成。經(jīng)計算，其中阿拉伯糖和木糖物質(zhì)的摩爾比為1∶2.91。

圖4 F3(a)、阿拉伯糖(b)及木糖(c)的GC圖譜

2.2.3 F3的基團結(jié)構(gòu)

紅外光譜法可測定物質(zhì)的基團結(jié)構(gòu)。F3的紅外光譜掃描圖譜見圖5。在3 400 cm-1左右處出現(xiàn)O—H的伸縮振動；2 920 cm-1左右出現(xiàn)C—H伸縮振動；1 200～1 400 cm-1處出現(xiàn)C—H的變角振動，這些區(qū)域的吸收峰是糖類的特征吸收峰[18]。該結(jié)構(gòu)經(jīng)2.2.2中GC分析證實為阿拉伯糖和木糖。

圖5 F3的紅外光譜圖

此外，1 656～1 500 cm-1之間吸收峰的存在證明了組分中苯環(huán)的存在，該結(jié)果已經(jīng)在2.1步驟中實驗驗證；而在1 728 cm-1附近的吸收峰顯示為酯鍵的特征吸收峰(1 722 cm-1)；另外，896 cm-1左右的吸收峰表現(xiàn)為β (1-4)吡喃糖糖苷鍵的特征峰[19]。IR分析結(jié)果表明，F(xiàn)3為含有β (1-4)吡喃糖糖苷鍵的糖酯類化合物。結(jié)合2.2.1中研究結(jié)果可知，F(xiàn)3為阿魏酸通過酯鍵連接在阿拉伯木糖糖體上的糖酯結(jié)構(gòu)。

2.3 F3的組成分析

不同分子質(zhì)量聚苯乙烯標準品的Sephadex LH-20凝膠柱洗脫圖譜見圖6。在該實驗條件下二者的回歸方程為y=-712.1ln(x)+4 484.5，該模型中聚苯乙烯分子質(zhì)量與保留時間具有良好的擬合度，R2達到了0.989 8。F3在此色譜條件下的出峰時間為(181±3.5) min，根據(jù)回歸方程計算可知該樣品的平均相對分子質(zhì)量為(781.429±13.774) u。

圖6 聚苯乙烯標準品的Sephadex LH-20凝膠柱洗脫圖譜

據(jù)2.2.2中GC法檢測F3中阿拉伯糖和木糖的摩爾比為1∶2.91，推測其可能的分子式為FA-ara-(xly)3，經(jīng)計算該組分的分子質(zhì)量為789.709 u。該結(jié)果在Sephadex LH-20凝膠色譜法擬合的組分F3平均相對分子質(zhì)量范圍(781.429±13.774) u。結(jié)果表明，麥麩組分F3為結(jié)合態(tài)谷物酚類物質(zhì)，阿魏酰阿拉伯糖基木三糖(FA-ara-(xly)3)，該結(jié)果與前人研究一致[20]。

2.4 F3對模擬體系中美拉德反應(yīng)中間產(chǎn)物生成的影響

2.4.1 α-二羰基化合物的檢測

美拉德反應(yīng)產(chǎn)物α-二羰基化合物經(jīng)鄰苯二胺衍生化生成喹喔啉可利用HPLC法檢測。三種α-二羰基化合物的HPLC圖譜及線性回歸關(guān)系參數(shù)見圖7，在2.082 min左右的峰為鄰苯二酚的特征峰，MGO、GO和2,3-BD的出峰時間分別為5.068 min、4.277 min和6.247 min。此外，三種α-二羰基化合物標準曲線的線性關(guān)系良好，在2～100 μg/mL范圍內(nèi)，三個線性回歸方程分別為y=17.516 2x-3.408 1、y=30.066 9x+5.146 8、y=21.816 0x-1.301 6,R2均在0.999 9以上，最低檢測限為10 ng/mL。因此，可進行組分F3對模擬體系中的3種美拉德反應(yīng)產(chǎn)物α-二羰基化合物的影響研究。

圖7三種α-二羰基化合物的HPLC圖譜

2.4.2 麥麩阿魏酸糖酯組分F3抑制美拉德反應(yīng)中間產(chǎn)物α-二羰基化合物

以FA為對照，研究F3對美拉德反應(yīng)中間產(chǎn)物α-二羰基化合物的影響，結(jié)果見圖8，以及當質(zhì)量濃度為50 mg/mL時，F(xiàn)3和FA對3種α-二羰基化合物的抑制作用比較，結(jié)果見表1。

圖8 F3對α-二羰基化合物MGO、GO、2,3-BD的抑制作用

表1 F3和FA對3種α-二羰基化合物抑制作用的比較

由圖8可見，F(xiàn)3和FA對美拉德反應(yīng)產(chǎn)物MGO、GO和2, 3-BD這3種α-二羰基化合物的生成抑制效果順序為：2, 3-BD>GO>MGO，其抑制率隨著濃度的增加呈上升趨勢。由表1可知，當濃度為50 mg/mL時，F(xiàn)3對這3種α-二羰基化合物的抑制率分別為(81.46±4.69)%、(68.24±0.16)%和(54.89±2.25)%，均顯著優(yōu)于FA的(64.85±2.92)%、(57.18±1.52)%和(33.49±1.57)%(P<0.05)。在美拉德反應(yīng)過程中，糖分子的碳鏈裂解會形成α-二羰基化合物，該過程中會有羰自由基、羥自由基等的生成。而組分F3可能受糖酯結(jié)構(gòu)對單電子轉(zhuǎn)移的影響[21]和糖羥基含量的綜合影響，因此對模擬體系美拉德反應(yīng)中間產(chǎn)物的生成具有良好的抑制作用。此外，由于2, 3-BD的毒性較強，因此研究F3和FA對2, 3-BD的抑制作用更具有現(xiàn)實意義。

3 結(jié)論

本研究經(jīng)Sephadex LH-20柱分離獲得F3組分，其表現(xiàn)為結(jié)合態(tài)谷物酚的特征吸收，與游離酚酸相比其最大吸收峰紅移；該組分為阿魏酸通過酯鍵連接在阿拉伯木糖糖體上的糖酯結(jié)構(gòu)；相對平均分子質(zhì)量為(781.429±13.774)u，其分子組成可能為FA-ara-(xly)3，即阿魏酰阿拉伯糖基木三糖。

通過構(gòu)建食品美拉德反應(yīng)體系，研究可見，F(xiàn)3和FA在葡萄糖-谷朊粉美拉德反應(yīng)體系中均能夠很好的抑制美拉德反應(yīng)中間產(chǎn)物—3種α-二羰基化合物的產(chǎn)生，并且其抑制作用呈濃度依賴關(guān)系；其抑制效果順序為：2, 3-BD>GO>MGO，當濃度為50 mg/mL時，F(xiàn)3對這3種α-二羰基化合物的抑制率分別為(81.46±4.69)%、(68.24±0.16)%和(54.89±2.25)%。因而F3對美拉德反應(yīng)產(chǎn)物具有良好的抑制作用，但其抑制機制尚需進一步研究。