高金星,余惠凡,覃彬華,張昌文,
(1.湖北中醫(yī)藥高等??茖W(xué)校,湖北荊州 434020;2.湖北醫(yī)藥學(xué)院生物醫(yī)藥研究院,湖北十堰 442000)
對(duì)乙酰氨基酚(N-acetyl-para-aminophenol,APAP)是一般用于治療普通感冒的一類非甾體解熱鎮(zhèn)痛藥,屬于乙酰水楊酸類,由于其解熱作用較好副作用小被廣泛用于臨床,故常發(fā)生不規(guī)范性使用的現(xiàn)象。短期低劑量使用不會(huì)對(duì)肝臟造成影響,而對(duì)乙酰氨基酚大劑量攝入會(huì)使肝臟積累代謝有毒物質(zhì),進(jìn)而引發(fā)藥物性肝損傷和肝炎[1?2]。藥物性肝損傷是指藥物本身毒性或其活性代謝產(chǎn)物毒性所導(dǎo)致的肝臟損傷,嚴(yán)重時(shí)可發(fā)展為肝功能衰竭甚至導(dǎo)致患者死亡[3]。對(duì)乙酰氨基酚超劑量導(dǎo)致葡萄糖醛酸化和硫酸化不充足以及肝臟中過(guò)量的N-乙酰苯醌亞胺消耗谷胱甘肽,一旦肝臟谷胱甘肽儲(chǔ)備耗盡,未結(jié)合的乙酰苯醌亞胺可與其他細(xì)胞蛋白自由組合,從而加劇肝細(xì)胞氧化應(yīng)激和細(xì)胞凋亡[4?5]。
五汁飲出自清朝吳瑭《溫病條辨》一書,處方由鮮藕汁、鮮梨汁、鮮荸薺汁、蘆根水煎液、鮮麥冬汁組成,具有清熱養(yǎng)陰、生津止渴的功效[6]。組成是由常見食品與使用安全的中藥組成,具有很好的養(yǎng)身保健作用。現(xiàn)代藥理研究表明:梨作為常見水果,有清心、潤(rùn)肺、養(yǎng)肝、解瘡毒和酒毒的功效[7];荸薺富含硒、黃酮、多酚等抗氧化物質(zhì),具有抗氧化、抗癌的作用[8];蘆根中的多糖成分具有抗氧化[9]、抗自由基作用,并可通過(guò)抗氧化作用保護(hù)肝細(xì)胞、抑制膠原沉積等途徑來(lái)抑制肝纖維化,改善肝功能,降低肝脂肪化[10];麥冬是我國(guó)臨床常用的中藥之一,具有養(yǎng)陰生津、潤(rùn)肺清心的功效。麥冬的主要成分有皂苷、黃酮、多糖等[11],具有抗炎、抗氧化、增強(qiáng)免疫、改善肝損傷等藥理作用[12];蓮藕是常見的蔬菜,蓮藕中的多糖、多酚物質(zhì)具有降血糖作用[13],可提升體內(nèi)超氧化物歧化酶(SOD)的活性,減少丙二醛(MDA)的生成。五汁飲的所有組成成分具有良好的保肝、抗氧化、抗自由基作用,由常見食品和使用安全的中藥組成,具有很好的使用安全性。
本文采用高劑量對(duì)乙酰氨基酚誘導(dǎo)小鼠急性肝臟損傷模型[14],但目前對(duì)五汁飲的營(yíng)養(yǎng)和保健作用的機(jī)制研究較少,本文探討了五汁飲(WZY)對(duì)對(duì)乙酰氨基酚AP所致小鼠急性肝損傷的保護(hù)作用及可能機(jī)制,為五汁飲的研究與開發(fā)新型保健飲品提供理論依據(jù)。
SPF級(jí)雄性KM小鼠 40只,5~6周齡,體重18~22 g,由動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供,合格證號(hào)SCXK(鄂)2019-0017,小鼠每天給予充足的水和飼料,3 d后開始實(shí)驗(yàn);新鮮的梨、荸薺、藕 1000 g,均購(gòu)買于本地市場(chǎng);蘆根和麥冬1000 g,本地藥房;HE染液、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)試劑盒、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)試劑盒、谷胱甘肽(GSH)試劑盒、丙二醛(MDA)試劑盒、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)試劑盒、白細(xì)胞介素-6(IL-6)試劑盒、白細(xì)胞介素-1β(IL-1β)試劑盒 上海碧云天生物科技有限公司;對(duì)乙酰氨基酚 純度99%,上海源葉生物有限公司。
RE-5203旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海亞榮生化儀器廠;SHZ-Ш型循環(huán)水真空泵 上海知信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司;AR224CN分析天平 奧豪斯上海有限公司。Leica DMI6000B熒光顯微鏡 德國(guó)徠卡顯微系統(tǒng)(上海)有限公司;GL-12C高速冷凍離心機(jī) 上海安亭科學(xué)儀器廠。
1.2.1 五汁飲樣品制備 梨(去心皮)、荸薺、藕洗凈榨汁合并,蘆根和麥冬(各500 g)放入大砂鍋內(nèi),加入2 L水,浸泡30 min后置大火上煮沸30 min后,改小火煮30 min,過(guò)濾,合并梨、荸薺、藕汁,小火煎煮10 min,反復(fù)三次,紗布擠壓過(guò)濾,濾液減壓濃縮為2.0 g生藥/mL濃縮液,密封,放入4℃冷藏。
1.2.2 動(dòng)物分組及造模給藥處理 參考文獻(xiàn)[15],40只昆明小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后隨機(jī)分為5組:空白組、模型組、五汁飲低劑量組(100 mg/kg)、五汁飲中劑量組(200 mg/kg)和五汁飲高劑量組(400 mg/kg),每組8只。五汁飲(低、中、高)組小鼠持續(xù)灌胃給藥7 d,每日1次,空白組和模型組小鼠灌胃給予等量的生理鹽水。最后一次給藥2 h后,除空白組外,其余各組小鼠腹腔注射AP(300 mg/kg)建立肝損傷模型。24 h后,對(duì)小鼠進(jìn)行眼球取血,靜置離心后留取上清檢測(cè)相關(guān)指標(biāo);取小鼠肝臟和脾臟稱重記錄,后取一部分肝組織固定于福爾馬林溶液中,用于肝組織切片染色觀察病理變化,另一部分肝組織凍存,用于后續(xù)相關(guān)指標(biāo)檢測(cè)。
1.2.3 免疫器官指數(shù)檢測(cè) 稱小鼠體質(zhì)量及肝臟和脾臟質(zhì)量,計(jì)算臟器指數(shù)。肝臟(脾臟)指數(shù)=肝臟(脾臟)質(zhì)量/體質(zhì)量。
1.2.4 血清指標(biāo)檢測(cè) 小鼠進(jìn)行眼球取血,靜置離心(2000 r/min,4℃,離心5 min)后留取上清液用試劑盒檢測(cè)ALT、AST酶活力。
1.2.5 氧化應(yīng)激指標(biāo)檢測(cè) 取?80℃凍存的小鼠肝組織,置于冰上解凍后,加入生理鹽水,勻漿,離心(5000 r/min,常溫,離心5 min),留取上清液,按照GSH和MDA試劑盒的操作說(shuō)明書測(cè)定相關(guān)指標(biāo)。
1.2.6 炎癥因子的檢測(cè) 取血清,按照試劑盒說(shuō)明書,測(cè)定TNF-α、IL-6和IL-1β含量。
1.2.7 HE染色 按照HE染色步驟進(jìn)行染色,封片,在顯微鏡下觀察拍照。將H&E染色后的肝組織切片置于顯微鏡下觀察,根據(jù)AP肝損傷評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)對(duì)其進(jìn)行評(píng)分統(tǒng)計(jì)。肝損傷評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)為:0級(jí)(0~1分):無(wú)明確肝損傷的形態(tài)學(xué)特征;1級(jí)(1~2分):肝小葉Ⅲ區(qū),靜脈周圍散在的片狀壞死病灶;2級(jí)(2~3分):靜脈周圍散在的片狀壞死病灶,一直延續(xù)到Ⅱ區(qū);3級(jí)(3~4分):靜脈片狀壞死病灶,一直延續(xù)到Ⅰ區(qū)。
1.2.8 Tunel染色 將待染色的片子置于脫水框中,脫蠟水化步驟同HE染色,接著用3%H2O2滅活內(nèi)源性過(guò)氧化物酶,再滴加0.01 mol/L TBS新鮮稀釋的Proteinase K(1:200),37℃條件下消化12 min,接著在37℃條件下,依次用標(biāo)記緩沖液孵育2 h、封閉液孵育30 min、抗體稀釋液稀釋的生物素化抗地高辛抗體(1:100)孵育30 min,抗體稀釋液稀釋的SABC(1:100)孵育30 min,最后置于新鮮配制的DAB發(fā)色液中,至鏡檢出現(xiàn)陽(yáng)性信號(hào)出現(xiàn),再置于蘇木素中,之后同HE染色脫水、樹脂封片步驟,待片子風(fēng)干,置于顯微鏡下觀察肝組織細(xì)胞炎癥與凋亡情況。
所有數(shù)據(jù)采用GraphPad Prism 5.01科學(xué)統(tǒng)計(jì)繪圖軟件進(jìn)行分析,以Mean±SD表示,組間和組內(nèi)采用雙向方差分析,當(dāng)P<0.05時(shí),表示數(shù)據(jù)之間具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
給藥7 d后,五汁飲對(duì)小鼠臟器指數(shù)[16]的影響結(jié)果見表1。觀察可見模型組小鼠肝組織出現(xiàn)腫大,說(shuō)明造模成功,肝臟指數(shù)的降低說(shuō)明給藥組對(duì)于肝臟腫大有緩解作用。與空白組相比,模型組小鼠的肝臟指數(shù)下降高度顯著(P<0.001);與模型組比,除低劑量組外,五汁飲可顯著(P<0.05或P<0.01)降低小鼠的肝臟指數(shù),其中以高劑量組的五汁飲降低效果最為顯著(P<0.01)。結(jié)果表明,適宜劑量的五汁飲能夠改善APAP致急性肝損傷小鼠的肝腫脹情況。
表1 五汁飲對(duì)AP致急性肝損傷小鼠臟器指數(shù)的影響(±s,n=8)Table 1 Effects of WZY on organ indices in acute liver-injury mice induced by AP( ±s,n=8)
表1 五汁飲對(duì)AP致急性肝損傷小鼠臟器指數(shù)的影響(±s,n=8)Table 1 Effects of WZY on organ indices in acute liver-injury mice induced by AP( ±s,n=8)
注:與空白組相比,*表示數(shù)據(jù)差異顯著,P<0.05;**表示數(shù)據(jù)差異極顯著,P <0.01;***表示數(shù)據(jù)差異高度顯著,P<0.001;與模型組相比,#表示數(shù)據(jù)差異顯著,P<0.05;##表示數(shù)據(jù)差異極顯著,P<0.01;###表示數(shù)據(jù)差異高度顯著,P<0.001;表2、圖1~圖3同。
ALT和AST是肝損傷的主要指標(biāo)參數(shù),當(dāng)肝臟受到損傷時(shí),這些生理指標(biāo)會(huì)在血液中發(fā)生變化,二者在血清中的指數(shù)會(huì)有所升高[17?18]。如圖1所示,與空白組相比,模型組小鼠血清中ALT(P<0.001)和AST(P<0.01)活力均顯著升高;給予五汁飲后,與模型組相比,小鼠血清中ALT和AST活力均有不同程度的減少,其中,高劑量的五汁飲給藥組引起小鼠機(jī)體變化,其顯著降低了AP作用于小鼠機(jī)體血清中ALT(P<0.001)和AST(P<0.05)的水平。結(jié)果表明五汁飲對(duì)對(duì)乙酰氨基酚所致的急性肝損傷有一定的保護(hù)作用。
圖1 五汁飲對(duì)AP致急性肝損傷小鼠血清中ALT和AST水平的影響(±s,n=8)Fig.1 Effects of WZY on serum ALTand AST levelsof acute liver-injury miceinduced by AP( ±s,n=8)
如圖2所示,與空白組相比,模型組小鼠肝組織中GSH(還原型谷胱甘肽)含量顯著降低(P<0.001),而五汁飲的中(P<0.01)、高劑量組(P<0.001)不同程度地改善了AP引起的小鼠肝組織中GSH含量的減少。MDA水平顯示組織的脂質(zhì)過(guò)氧化物的多少,含量與細(xì)胞的受損程度有關(guān)[19?20]。與空白組小鼠相比,模型組小鼠肝組織中MDA水平顯著升高(P<0.001);與模型組比,中、高劑量的五汁飲顯著降低了小鼠肝組織中MDA的含量(P<0.05)。結(jié)果表明五汁飲能夠提高肝組織抗氧化能力并緩解AP對(duì)肝細(xì)胞產(chǎn)生的脂質(zhì)過(guò)氧化作用。
圖2 五汁飲對(duì)AP致急性肝損傷小鼠肝組織中GSH和MDA含量的影響(±s,n=8)Fig.2 Effectsof WZY on liver GSHand MDA levelsof acute liver-injury miceinduced by AP(±s,n=8)
肝組織中炎癥因子水平反映炎癥反應(yīng)的強(qiáng)弱[21?23]。由表2可知,與空白組相比,模型組的炎癥因子含量明顯升高;與模型組相比,五汁飲低、中、高劑量組顯著抑制了組織中炎癥因子的升高(P<0.05或P<0.01)。
表2 五汁飲對(duì)小鼠肝臟中炎癥因子的影響Table 2 Effectsof WZY on inflammatory factors in liver of mice
如圖3所示,空白組小鼠的肝組織細(xì)胞排列整齊,肝小葉結(jié)構(gòu)清晰;HE染色結(jié)果顯示,模型組小鼠肝組織中央靜脈周圍多數(shù)融合壞死,且部分壞死面積從III區(qū)擴(kuò)張至II區(qū),并伴混合性炎細(xì)胞浸潤(rùn),Tunel凋亡染色圖片可看出模型組小鼠肝臟中央靜脈周圍細(xì)胞變性腫脹,大部分肝細(xì)胞凋亡,呈現(xiàn)灶狀壞死[24?25];經(jīng)過(guò)五汁飲的干預(yù),小鼠肝組織細(xì)胞的凋亡壞死情況得到不同程度的改善,五汁飲高劑量組細(xì)胞完整,排列整齊,肝組織炎癥浸潤(rùn)現(xiàn)象輕微,顯著減輕了AP引起的小鼠肝細(xì)胞凋亡壞死癥狀,并改善了肝組織的炎癥浸潤(rùn)程度,從而改善肝組織的損傷情況。
圖3 五汁飲對(duì)AP致小鼠肝組織細(xì)胞損傷的影響Fig.3 Effects of WZY on liver tissue pathological changesy of acuteliver-injury miceinduced by AP
本實(shí)驗(yàn)中通過(guò)對(duì)小鼠腹腔注射高劑量對(duì)乙酰氨基酚溶液,導(dǎo)致小鼠出現(xiàn)肝臟損傷現(xiàn)象,探討五汁飲對(duì)對(duì)乙酰氨基酚致小鼠急性肝損傷的保護(hù)作用。結(jié)果表明,五汁飲高、中劑量組小鼠血清中ALT和AST的水平均有明顯下降,GSH活性提高,MDA水平降低,肝組織切片顯示肝組織變性及壞死等病理癥狀明顯改善。說(shuō)明五汁飲具有清除自由基、抑制脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)、防止細(xì)胞膜受損、減輕細(xì)胞腫脹壞死的效果,對(duì)藥物所致肝損傷具有顯著保護(hù)作用。五汁飲對(duì)對(duì)乙酰氨基酚所致肝損傷具有一定的保護(hù)作用,其保護(hù)機(jī)制與提高抗氧化酶體系活力、抑制脂質(zhì)過(guò)氧化、維持肝細(xì)胞膜正常形態(tài)有關(guān)。綜上所述,五汁飲能保護(hù)AP所致的小鼠急性肝損傷,其機(jī)制與抑制氧化應(yīng)激、緩解炎癥反應(yīng)有關(guān),這為五汁飲的研究與開發(fā)提供了理論依據(jù)。