暹羅芽孢桿菌LW-1產(chǎn)γ-聚谷氨酸發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化

蔡亞慧，王 青，王文玉，皇高峰，張繼冉，徐淑霞，張世敏，吳 坤

（河南農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，河南鄭州 450002）

γ-聚谷氨酸（γ-polyglutamic acid，γ-PGA）是由D-谷氨酸、L-谷氨酸單體通過(guò)γ-羧基與α-氨基間的γ-酰胺鍵聚合而成的一種天然同聚物，它的分子量為1～200萬(wàn)[1]。γ-PGA的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)使它具有可在水中溶解、可生物降解[2]、可吸附重金屬離子及對(duì)環(huán)境友好的性[3]質(zhì)，因此在日化、食品、醫(yī)藥、環(huán)保、農(nóng)業(yè)等領(lǐng)域中被廣泛應(yīng)用[4?6]。

目前，γ-PGA的生產(chǎn)以微生物發(fā)酵法為主，因其相對(duì)于化學(xué)合成法和提取法，具有周期短、生產(chǎn)條件簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)，但由于微生物發(fā)酵的產(chǎn)出率不高，這限制了γ-PGA的大規(guī)模使用[7?8]?，F(xiàn)階段主要通過(guò)基因工程的手段改造菌株和優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基條件來(lái)提高γ-PGA的產(chǎn)量，但因調(diào)控γ-PGA代謝的基因眾多，單個(gè)基因的敲除、敲入或過(guò)度表達(dá)時(shí)細(xì)胞內(nèi)的代謝易造成紊亂[9?11]；而培養(yǎng)基成分、前體和培養(yǎng)條件明顯影響γ-PGA的產(chǎn)量，尤其是γ-PGA的產(chǎn)量和性質(zhì)都受到培養(yǎng)基成分的直接影響；因此優(yōu)化菌種發(fā)酵γ-PGA時(shí)的培養(yǎng)基是提高工業(yè)發(fā)酵中γ-PGA產(chǎn)量的重要手段[12?13]；王德新、Kongklom、張超及張慧麗等人對(duì)Bacillus subtilis、Bacillus licheniformis的發(fā)酵培養(yǎng)基成分進(jìn)行優(yōu)化，使γ-PGA的產(chǎn)量得到大幅度的提高，甚至達(dá)到36.5 g/L[14?17]。應(yīng)用γ-PGA發(fā)酵培養(yǎng)基發(fā)酵的微生物多為枯草芽孢桿菌（Bacillus suhtilis）、解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）、地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis）[18]，而關(guān)于暹羅芽孢桿菌（Bacillus siamese）發(fā)酵生產(chǎn)γ-PGA的文章目前較少。王德新等分別通過(guò)優(yōu)化培養(yǎng)條件和分批補(bǔ)料發(fā)酵的方法使Bacillus siamensisSB1001和Bacillus siamensisIR10發(fā)酵γ-PGA的產(chǎn)量分別達(dá)到了25.22 g/L和（41.40±2.01）g/L[19?20]。

本實(shí)驗(yàn)室前期從污水中分離篩選得到一株γ-PGA的高產(chǎn)菌株，鑒定后將其命名為暹羅芽孢桿菌LW-1菌株，本實(shí)驗(yàn)用響應(yīng)面法系統(tǒng)的對(duì)暹羅芽孢桿菌產(chǎn)γ-PGA的發(fā)酵培養(yǎng)基成分進(jìn)行優(yōu)化，進(jìn)一步提高γ-PGA產(chǎn)量，為該菌株的工廠發(fā)酵及γ-PGA的大規(guī)模應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

暹羅芽孢桿菌（Bacillus siamese）LW-1由本實(shí)驗(yàn)室選育、保藏；MgSO4·7H2O、CaCl2、KH2PO4·3H2O、NaCl、FeCl3·6H2O、蔗糖、甘油、葡萄糖、麥芽糖、HCl、氯化銨、尿素、MnSO4、淀粉、牛肉膏、無(wú)水乙醇、蛋白胨、玉米芯 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；谷氨酸標(biāo)品Alfa Aesar（中國(guó)）公司；胰蛋白胨粉、酵母浸粉、瓊脂粉 英國(guó)Oxoid公司；谷氨酸鈉 河南蓮花味精股份有限公司。

MQL-61R立式全溫振蕩培養(yǎng)箱 上海宜電科學(xué)儀器有限公司；DH-500A電加熱恒溫培養(yǎng)箱 北京中興偉業(yè)儀器有限公司；2695XE高效液相色譜儀美國(guó)Waters公司；SJ-CJ-2FD雙人單面清潔工作臺(tái) 蘇杰集團(tuán)有限公司；YXQ-LS-50SII立式壓力蒸汽滅菌器 上海工業(yè)醫(yī)療設(shè)備廠；101-2A電加熱鼓風(fēng)干燥箱 天津市泰西儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 培養(yǎng)基配制 種子培養(yǎng)基（g/L）：酵母粉5，胰蛋白胨10，氯化鈉10；基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基（g/L）：谷氨酸鈉40，檸檬酸鈉12，MgSO4·7H2O 0.5，甘油30，(NH4)2SO49，KH2PO40.5，F(xiàn)eCl3·6H2O 0.06，MnSO40.1，CaCl20.15，上述培養(yǎng)基在p H7.5，121℃，0.1 MPa條件下滅菌20 min[21]。

1.2.2 菌種的培養(yǎng)

1.2.2.1 種子培養(yǎng) 甘油管中保藏的菌種接到種子培養(yǎng)基（10 mL/50 mL三角瓶）中，接種量為2%，在培養(yǎng)溫度為37℃的，轉(zhuǎn)速為180 r/min條件下激活并培養(yǎng)12 h；然后按相同的接種量將活化菌株接種到種子培養(yǎng)基（50 mL/250 mL）中，在相同的條件下擴(kuò)增培養(yǎng)12 h[20]。

1.2.2.2 發(fā)酵培養(yǎng) 把種子液接種到基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基（60 mL /250 mL三角瓶）中，接種量為2%，在37℃的培養(yǎng)溫度，210 r/min的轉(zhuǎn)速下?lián)u瓶發(fā)酵48 h。

1.2.3 發(fā)酵培養(yǎng)基單因素實(shí)驗(yàn) 葡萄糖、麥芽糖、淀粉、甘油和蔗糖分別被用作初始發(fā)酵培養(yǎng)基中的碳源，在2%接種量下發(fā)酵48 h。測(cè)定γ-PGA產(chǎn)量，確定最佳碳源，然后對(duì)最佳碳源的濃度（10、30、50、70、90、110、130 g/L）進(jìn)行考察；在最適碳源條件下，以氯化銨、尿素、牛肉膏、硫酸銨、蛋白胨、玉米芯、酵母粉分別作為氮源，確定最佳氮源；然后對(duì)最佳氮源的濃度（3、5、7、9、11、13、15 g/L）進(jìn)行考察；在最適碳氮源條件下對(duì)谷氨酸鈉的濃度（0、10、20、30、40、50、60、70 g/L）進(jìn)行優(yōu)化；在上述最適條件下對(duì)檸檬酸鈉的濃度（4、6、8、10、12 g/L）進(jìn)行優(yōu)化；接著分別對(duì)磷酸二氫鉀濃度（0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 g/L）、硫酸鎂濃度（0、0.4、0.8、1.2、1.6、2.0 g/L）、硫酸錳濃度（0、0.05、0.10、0.15、0.20、0.25 g/L）、氯化鈣濃度（0、0.075、0.150、0.225、0.300 g/L）和三氯化鐵濃度（0、0.02、0.04、0.06、0.08、0.10 g/L）進(jìn)行優(yōu)化。

1.2.4 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.2.4.1 Plackett-Burman設(shè)計(jì) 基于前期單因素實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，以γ-PGA（g/L）產(chǎn)量為響應(yīng)值，考察發(fā)酵培養(yǎng)基中的九個(gè)組分對(duì)γ-PGA產(chǎn)量的影響。利用軟件Design-Expert 10.0設(shè)計(jì)試驗(yàn)，每個(gè)因素選取高低（+1，?1）兩種水平，各因素水平見(jiàn)表1。

表1 Plackett-Burman試驗(yàn)的因素與水平Table 1 Factors and levels of Plackett-Burman design

1.2.4.2 最陡爬坡實(shí)驗(yàn) 主效應(yīng)基于PBD的結(jié)果，系數(shù)估計(jì)值為正的因子選高值，系數(shù)估計(jì)值為負(fù)的因子選低值[22]；響應(yīng)面分析的中心點(diǎn)為γ-PGA產(chǎn)量（g/L）最高的組。

1.2.4.3 Box-Behnken試驗(yàn) 使用響應(yīng)面方法進(jìn)一步優(yōu)化PBD確定的三個(gè)最值得注意的因素，其他因子的濃度與單因素實(shí)驗(yàn)的結(jié)果一致。利用軟件Design-Expert 10.0設(shè)計(jì)三因素三水平的響應(yīng)面試驗(yàn)，總共由17個(gè)實(shí)驗(yàn)組成，包括有5個(gè)中心點(diǎn)。自變量為谷氨酸鈉、檸檬酸鈉和硫酸鎂，響應(yīng)值為γ-PGA（g/L）產(chǎn)量，實(shí)驗(yàn)因素的水平見(jiàn)表2。

表2 Box-Behnken實(shí)驗(yàn)因素水平Table 2 Factors and levelsof Box-Behnken design

1.2.5γ-PGA含量的測(cè)定 把搖瓶里發(fā)酵液的p H調(diào)至3左右，8000 r/min離心30 min，收集上清液將其調(diào)回原pH；取適量的上清液，加入4倍體積的無(wú)水乙醇并混勻，在4℃下靜置過(guò)夜（12 h）；6000 r/min離心15 min，得到沉淀，加入適量的超純水使沉淀復(fù)溶，透析脫鹽后，置于?80℃下冷凍干燥，最后對(duì)提取物稱(chēng)重即得γ-PGA的產(chǎn)量[21]。

1.3 數(shù)據(jù)分析

使用Microsoft Excel 2016和SPSS 20.0來(lái)處理分析試驗(yàn)數(shù)據(jù)，利用Design-Expert 10處理PB實(shí)驗(yàn)和Box-Behnken實(shí)驗(yàn)的結(jié)果繪制出相關(guān)圖表，并使用Origin·Pro 9.0進(jìn)行制圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 不同碳源及碳源濃度對(duì)γ-PGA產(chǎn)量的影響微生物自身的生長(zhǎng)及產(chǎn)物的積累與培養(yǎng)基中碳源的種類(lèi)與濃度密切相關(guān)，因此合適的碳源對(duì)于γ-PGA的積累起著正向作用[23]。在初始發(fā)酵培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，比較不同種類(lèi)的碳源對(duì)暹羅芽孢桿菌LW-1發(fā)酵生產(chǎn)γ-PGA的影響，結(jié)果如圖1所示，從圖中可知，當(dāng)甘油作為碳源時(shí)，γ-PGA產(chǎn)量最高為24.52 g/L，和其它碳源相比存在顯著性差異（P<0.05）。

圖1 不同碳源對(duì)γ-PGA產(chǎn)量的影響Fig.1 Effects of carbon sources on the yield of γ-PGA

對(duì)甘油的最適濃度進(jìn)行研究，結(jié)果如圖2所示，甘油濃度小于30 g/L時(shí)，隨著甘油濃度的升高，γ-PGA的產(chǎn)量增加，甘油濃度處于30 g/L時(shí)，γ-PGA產(chǎn)量最高為24.82 g/L，而后隨著甘油濃度的增加，γ-PGA的產(chǎn)量降低；這可能是高濃度的碳源導(dǎo)致了發(fā)酵液的滲透壓上升，從而抑制了菌體的生長(zhǎng)與代謝，進(jìn)而抑制了γ-PGA的合成[24]。因此選取濃度為30 g/L的甘油作為碳源。

圖2 甘油濃度對(duì)γ-PGA產(chǎn)量的影響Fig.2 Effects of glycerol concentration on the yield of γ-PGA

2.1.2 不同氮源及氮源濃度對(duì)γ-PGA產(chǎn)量的影響在最適碳源的條件下，比較不同種類(lèi)的氮源對(duì)γ-PGA產(chǎn)量的影響，結(jié)果如圖3所示，從圖中可知，當(dāng)無(wú)機(jī)類(lèi)的氮作為氮源時(shí)，如：（NH4）2SO4、尿素，γ-PGA產(chǎn)量顯著高于有機(jī)類(lèi)的氮（牛肉膏、酵母粉、蛋白胨）作為氮源時(shí)的產(chǎn)量（P<0.05），這與Wan-Tack Ju研究的B.subtilisMJ80的結(jié)果相似，表明暹羅芽孢桿菌LW-1利用無(wú)機(jī)氮源的能力強(qiáng)，可能因無(wú)機(jī)氮源的結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單更易被菌體利用[25]；當(dāng)（NH4）2SO4作為氮源時(shí)，γ-PGA的產(chǎn)量達(dá)到最高為24.53 g/L。

圖3 不同氮源對(duì)γ-PGA產(chǎn)量的影響Fig.3 Effects of different nitrogen sources on the yield of γ-PGA

（NH4)2SO4的濃度對(duì)暹羅芽孢桿菌合成γ-PGA時(shí)的影響，結(jié)果如圖4所示，從圖中可知：γ-PGA的產(chǎn)量隨(NH4)2SO4濃度的增加而增加，（NH4)2SO4濃度為13 g/L時(shí)，γ-PGA的產(chǎn)量最大為26.10 g/L，此后γ-PGA的產(chǎn)量變化不大；可能由于在發(fā)酵初期，菌體濃度較大，氮源濃度加大時(shí)，菌體與氮源接觸較充分，發(fā)酵反應(yīng)比較充分，但隨著反應(yīng)的進(jìn)行，菌體進(jìn)入衰亡期，即使增加（NH4)2SO4，發(fā)酵反應(yīng)程度也會(huì)降低[26]，因此選取13 g/L的（NH4)2SO4較為合適。

圖4 （NH4)2SO4濃度對(duì)γ-PGA產(chǎn)量的影響Fig.4 Effects of (NH4)2SO4 concentration on the yield of γ-PGA

2.1.3 不同濃度的谷氨酸鈉對(duì)γ-PGA產(chǎn)量的影響因大多數(shù)產(chǎn)γ-PGA的菌株為谷氨酸依賴(lài)型菌株，谷氨酸鈉的濃度對(duì)γ-PGA產(chǎn)量有著重要的作用[21]。從圖5可以看出，谷氨酸鈉的濃度在10～60 g/L時(shí)，γ-PGA的產(chǎn)量隨著谷氨酸鈉含量的增加而增大，谷氨酸鈉的濃度為60 g/L時(shí)，γ-PGA的產(chǎn)量最大為30.42 g/L，此后γ-PGA的產(chǎn)量開(kāi)始降低，這說(shuō)明谷氨酸鈉的濃度過(guò)高時(shí)不利于γ-PGA的合成；可能由于谷氨酸鈉與γ-PGA的結(jié)構(gòu)類(lèi)似，當(dāng)濃度過(guò)高時(shí)會(huì)對(duì)γ-PGA合成酶系產(chǎn)生反饋?zhàn)瓒?，從而抑制了?PGA的合成[27]。

圖5 谷氨酸鈉濃度對(duì)γ-PGA產(chǎn)量的影響Fig.5 Effectsof sodium glutamate concentration on the yield of γ-PGA

2.1.4 不同濃度的檸檬酸鈉對(duì)γ-PGA產(chǎn)量的影響谷氨酸依賴(lài)型菌株一般為多碳源形式[28]，因此研究檸檬酸鈉的濃度對(duì)暹羅芽孢桿菌LW-1合成γ-PGA時(shí)的影響，從圖6可以看出，當(dāng)檸檬酸鈉的濃度小于10 g/L時(shí)，隨著檸檬酸鈉濃度的增加，γ-PGA的產(chǎn)量增大，檸檬酸鈉濃度為10 g/L時(shí)，γ-PGA的產(chǎn)量達(dá)到最大為31.61 g/L，此后γ-PGA的產(chǎn)量開(kāi)始降低，因此確定檸檬酸鈉的最適濃度為10 g/L。

圖6 檸檬酸鈉的濃度對(duì)γ-PGA產(chǎn)量的影響Fig.6 Effects of concentration of sodium citrate on the yield of γ-PGA

2.1.5 無(wú)機(jī)鹽離子濃度優(yōu)化結(jié)果 無(wú)機(jī)鹽離子和微生物的生命活動(dòng)相關(guān)，任何生命活動(dòng)的進(jìn)行都離不開(kāi)無(wú)機(jī)鹽離子，同樣無(wú)機(jī)鹽離子的濃度影響著γ-PGA的合成[29]。進(jìn)一步優(yōu)化基礎(chǔ)培養(yǎng)基中無(wú)機(jī)鹽離子的濃度，優(yōu)化結(jié)果見(jiàn)圖7A～圖7E。從圖中可知，無(wú)機(jī)鹽離子總體對(duì)γ-PGA產(chǎn)量影響的大致趨勢(shì)為γ-PGA的產(chǎn)量隨著無(wú)機(jī)鹽離子濃度的增加先升高后降低，最適濃度分別為：MgSO41.2 g/L、KH2PO41.0 g/L、CaCl20.075 g/L、FeCl30.06 g/L、MnSO40.1 g/L。

圖7 無(wú)機(jī)鹽離子濃度對(duì)γ-PGA產(chǎn)量的影響Fig.7 Effects of inorganic salt concentration on the yield of γ-PGA

2.2 PIackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)果及分析

基于單因素實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，采用Plackett-Burman設(shè)計(jì)（N=9）進(jìn)行試驗(yàn)，響應(yīng)值為γ-PGA的產(chǎn)量（g/L）。PB實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及響應(yīng)值見(jiàn)表3（每組試驗(yàn)有3個(gè)重復(fù)，取平均值）。試驗(yàn)水平、各因素的顯著性方差分析及效果分析見(jiàn)表4。該試驗(yàn)?zāi)Ｐ蚉=0.0044<0.01，這說(shuō)明該試驗(yàn)?zāi)Ｐ陀绊憳O顯著，決定系數(shù)R2=0.9990；校正系數(shù)R2Adj=0.9946，這表明該模型對(duì)于實(shí)驗(yàn)的重復(fù)是高度可靠的，各因素水平的設(shè)計(jì)較合理。谷氨酸鈉（A）和檸檬酸鈉（B）的P值分別為0.0006、0.0053（<0.01），說(shuō)明它們對(duì)γ-PGA產(chǎn)量的影響極顯著；硫酸鎂（F）的P值為0.0210（<0.05），說(shuō)明它對(duì)γ-PGA產(chǎn)量有顯著影響。此外谷氨酸鈉、檸檬酸鈉和硫酸鎂的估計(jì)值均為正值，說(shuō)明它們對(duì)γ-PGA產(chǎn)量為顯著的正效應(yīng)，且影響順序?yàn)楣劝彼徕c>檸檬酸鈉>硫酸鎂。因此選取谷氨酸鈉、檸檬酸鈉、硫酸鎂進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。

表3 Plackett-Burman 試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 3 Design and resultsof Plackett-Burman experiments

表4 Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)水平及效果分析Table 4 Plackett-Burman experimental level and effect analysis

2.3 最陡爬坡試驗(yàn)結(jié)果與分析

基于Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)的結(jié)果分析，選取谷氨酸鈉、檸檬酸鈉、硫酸鎂這三個(gè)因素進(jìn)行最陡爬坡試驗(yàn)，由于谷氨酸鈉、檸檬酸鈉、硫酸鎂均對(duì)γ-PGA的合成起積極作用，因此取高水平，爬坡試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見(jiàn)表5。從表中可看出，第八組實(shí)驗(yàn)γ-PGA的產(chǎn)量達(dá)到最高為45.71 g/L，因此將第八組每個(gè)因子的水平作為響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)的中心點(diǎn)，即谷氨酸鈉84 g/L，檸檬酸鈉18 g/L，硫酸鎂2.1 g/L。

表5 最陡爬坡實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 5 Steep climbing experimental design and results

2.4 響應(yīng)面試驗(yàn)

2.4.1 響應(yīng)面設(shè)計(jì)及結(jié)果 以谷氨酸鈉、檸檬酸鈉、硫酸鎂這三個(gè)因素的濃度為自變量，γ-PGA產(chǎn)量（g/L）為響應(yīng)值，以最陡爬坡實(shí)驗(yàn)的結(jié)果為依據(jù)設(shè)計(jì)一個(gè)三因素三水平的Box-Behnken實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和結(jié)果見(jiàn)表6，回歸模型系數(shù)的顯著性結(jié)果見(jiàn)表7。根據(jù)表6結(jié)果，運(yùn)用Design-Expert 10.0軟件對(duì)其進(jìn)行二次回歸分析，可得到的擬合回歸方程為：γ-PGA產(chǎn)量（g/L）= ?842.43099+4.62321X1+69.2414X2+63.00469X3+0.022478X1X2+0.40344X1X3?0.4015X2X3?0.033888X12?1.96048X22?21.5451X32。

表6 Box-Behnken 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table6 Design and resultsof Box-Behnken experiments

由表7可知，這個(gè)回歸模型的P值為0.003（<0.01），模型的失擬項(xiàng)P=0.0857（>0.05），表明該模型的誤差小、可信性高、數(shù)據(jù)擬合度較好；模型的決定系數(shù)R2=0.9283和校正系數(shù)R2Adj=0.8361，表明該模型的預(yù)測(cè)值與實(shí)際值吻合度較高，且83.61%的暹羅芽孢桿菌發(fā)酵產(chǎn)γ-PGA的模型可用該模型來(lái)解釋?zhuān)灰虼嗽撃Ｐ涂捎脕?lái)分析及預(yù)測(cè)暹羅芽孢桿菌產(chǎn)γ-PGA的最大值；此外該模型的一次項(xiàng)X1和二次項(xiàng)X12、X22都極顯著（P<0.01），表明各因素間對(duì)γ-PGA的影響并不是簡(jiǎn)單的線性關(guān)系。

表7 Box-Behnken 結(jié)果的統(tǒng)計(jì)分析Table 7 Statistical analysis of Box-Behnken design experiments

2.4.2 各因素交互作用分析 借助Design-Expert 10.0軟件繪制出相應(yīng)的響應(yīng)曲面圖與等高線圖（圖8～圖10），兩因素間交互作用的情況可用等高線圖直觀地表現(xiàn)出，等高線之間的輪廓越接近圓形，表明兩因素間的相互作用越不明顯，輪廓越接近橢圓形，表明兩因素間的相互作用越明顯[24]。在谷氨酸鈉、檸檬酸鈉和硫酸鎂選取的范圍內(nèi)，γ-PGA產(chǎn)量存在最大值，由響應(yīng)曲面圖可知，隨著各因素濃度的增加，γ-PGA的產(chǎn)量先增加后減小，由圖8和圖9可知，谷氨酸鈉引起的響應(yīng)曲面坡度比檸檬酸鈉和硫酸鎂的更陡峭，表明谷氨酸鈉對(duì)暹羅芽孢桿菌LW-1發(fā)酵產(chǎn)γ-PGA的影響比檸檬酸鈉和硫酸鎂更大，從圖10可知，檸檬酸鈉引起的響應(yīng)曲面坡度比硫酸鎂的陡峭，表明檸檬酸鈉對(duì)γ-PGA產(chǎn)量的影響比硫酸鎂更大；該響應(yīng)曲面圖（圖8～圖10）說(shuō)明了兩兩因素之間存在著交互作用，它們共同影響著γ-PGA的合成，但兩兩因素間的交互作用對(duì)γ-PGA產(chǎn)量的影響沒(méi)有顯著性。

圖8 谷氨酸鈉和檸檬酸鈉對(duì)暹羅芽孢桿菌LW-1發(fā)酵產(chǎn)γ-PGA的影響Fig.8 Effects of sodium glutamateand sodium citrateon γ-PGA production from Bacillus siamese LW-1

圖9 谷氨酸鈉和硫酸鎂對(duì)暹羅芽孢桿菌LW-1發(fā)酵產(chǎn)γ-PGA的影響Fig.9 Effects of sodium glutamate and magnesium sulfate on γ-PGA production from Bacillus siamese LW-1

圖10 檸檬酸鈉和硫酸鎂的對(duì)暹羅芽孢桿菌LW-1發(fā)酵產(chǎn)γ-PGA的影響Fig.10 Effectsof sodium citrate and magnesium sulfate on γ-PGA production from Bacillus siamese LW-1

2.4.3 最優(yōu)培養(yǎng)基的確定及驗(yàn)證 對(duì)擬合回歸方程中的自變量進(jìn)行分析求極值，可得到該模型中三因素的最佳值分別為：谷氨酸鈉86.709 g/L，檸檬酸鈉17.941 g/L，硫酸鎂2.107 g/L，在該發(fā)酵培養(yǎng)基中γ-PGA產(chǎn)量的理論最大值為45.91 g/L。

為了驗(yàn)證預(yù)測(cè)值及回歸方程的精確性，按得出的最佳培養(yǎng)基配方：谷氨酸鈉86.71 g/L，檸檬酸鈉17.94 g/L，MgSO4·7H2O 2.11 g/L，甘油 25 g/L，KH2PO41.4 g/L，（NH4）2SO414 g/L，MnSO40.075 g/L，CaCl20.1 g/L，F(xiàn)eCl3·6H2O 0.04 g/L，進(jìn)行5次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，得到γ-PGA的產(chǎn)量為（44.78±0.62）g/L，與模型預(yù)測(cè)出來(lái)的產(chǎn)量吻合度達(dá)97.54%，比在初始培養(yǎng)基中的產(chǎn)量（23.26 g/L），提高了1.93倍。

3 結(jié)論

本文通過(guò)單因素試驗(yàn)與PBD試驗(yàn)確定了培養(yǎng)基中對(duì)γ-PGA產(chǎn)量影響顯著的因子，并通過(guò)響應(yīng)面法對(duì)顯著因子進(jìn)行優(yōu)化，得出顯著因子的最佳添加量為：谷氨酸鈉 86.71 g/L，檸檬酸鈉 17.94 g/L，MgSO4·7H2O 2.11 g/L，經(jīng)過(guò)驗(yàn)證，在最佳培養(yǎng)基條件下γ-PGA的產(chǎn)量為44.78 g/L，產(chǎn)量比優(yōu)化前（23.26 g/L）相比提高了1.93倍。因此用響應(yīng)面法得到γ-PGA的最佳發(fā)酵培養(yǎng)基是合理的、可行的，此外這為γ-PGA工業(yè)化大量發(fā)酵提供了一種新型菌株。但目前γ-PGA的提取方法有有機(jī)溶劑沉淀法、化學(xué)沉淀法和膜分離沉淀法，這些提取方法成本較高、工藝復(fù)雜，γ-PGA的提取方法還需進(jìn)一步改進(jìn)；此外目前對(duì)于生產(chǎn)特定分子量的γ-PGA一般用溫度、超聲波等方式對(duì)高分子量γ-PGA進(jìn)行降解，用菌株發(fā)酵生產(chǎn)特定分子量的γ-PGA也需進(jìn)一步探究[30?32]。