體外培養(yǎng)細(xì)胞中細(xì)胞器的分離與純化

周夢(mèng)，史熊杰

（武漢大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，湖北武漢 430072）

在真核生物中，細(xì)胞內(nèi)部被嚴(yán)格地組織成分門別類的細(xì)胞器[1]，它們各自擁有特殊的結(jié)構(gòu)特征以及動(dòng)態(tài)特性，發(fā)揮著不同的生物學(xué)功能。為了研究某一特定細(xì)胞器的微觀結(jié)構(gòu)、生化組成以及特定的功能，需要將其從細(xì)胞中分離純化出來(lái)。在這個(gè)過(guò)程中，要求純化的細(xì)胞器結(jié)構(gòu)完整、形態(tài)與細(xì)胞內(nèi)無(wú)異、具有生物學(xué)活性，在數(shù)量足夠基礎(chǔ)上，提高純度、節(jié)省時(shí)間、提高效率、節(jié)約經(jīng)濟(jì)成本。如在蛋白質(zhì)組學(xué)的研究中，需要分離純化出純度較高的細(xì)胞器，以滿足電泳或色譜分離要求，從而建立相應(yīng)的細(xì)胞器蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)庫(kù)[2]。因此，針對(duì)分離的目的和后期鑒定要求，選擇合適細(xì)胞破碎溶劑、破碎方法以及分離純化方式對(duì)于純化的細(xì)胞器至關(guān)重要。細(xì)胞器分離純化方法分為離心分離、親和免疫純化分離、自由流電泳分離、熒光激活細(xì)胞器分選、光學(xué)鑷子和激光捕獲顯微解剖、雙向電泳分離等[3]，本文主要介紹離心和親和純化兩種分離方法，對(duì)這兩種分離純化方法的原理、操作步驟以及特點(diǎn)討論分析。

1 細(xì)胞器的釋放

理想的勻漿是成功分離純化細(xì)胞器的第一步，即細(xì)胞器等細(xì)胞成分能完整、均一地分布在勻漿液中[4]。在勻漿過(guò)程中，經(jīng)常觀察到細(xì)胞質(zhì)聚集體，這是因?yàn)榧?xì)胞破碎不充分或不當(dāng)，細(xì)胞器與圍繞在細(xì)胞核周圍的細(xì)胞骨架元素相聯(lián)系，或被困在大的聚集物中，形成大的細(xì)胞沉積團(tuán)塊。這會(huì)導(dǎo)致在去除核的初始離心步驟中，細(xì)胞器大量損失，因此必須優(yōu)化每個(gè)細(xì)胞系的均勻化條件[4]。

1.1 溶劑的選擇

在離心分離細(xì)胞器過(guò)程中，適用的溶劑通常是由細(xì)胞器的種類決定的[5]，每一步分離溶液成分都有所變化。最開(kāi)始分離細(xì)胞器是以大鼠肝臟和其他軟組織為原材料，以離心分離為基本方式純化，因此這些試劑是以動(dòng)物組織中細(xì)胞器分離的目的而發(fā)明的，通常含有蔗糖作為滲透平衡劑。許多培養(yǎng)的細(xì)胞也可以在通用培養(yǎng)基或其他類似的等滲培養(yǎng)基中均質(zhì)[6]，但如果是在低滲介質(zhì)中進(jìn)行均質(zhì)，則應(yīng)盡快調(diào)整到推薦的蔗糖和其他添加劑濃度。本文列舉以下離心分離常見(jiàn)溶劑體系。（1）通用的勻漿溶劑：0.25 mol/L 的蔗糖，1 mmol/L 的EDTA，10 mmol/L 的Hepes-NaOH（或10 mmol/L 的Tris-HCl），pH=7.4；（2）細(xì)胞核：與通用的體系基本相同，只是將1 mmol/L的EDTA 換成25 mmol/L 的KCl，5 mmol/L 的MgCl2；（3）過(guò)氧化物酶體：在通用的體系上加入0.1%的乙醇；（4）線粒體：0.2 mol/L的甘露醇，50 mmol/L的蔗糖，1 mmol/L 的EDTA，10 mmol/L 的HEPES-NaOH，pH=7.4。

親和純化分離細(xì)胞器中，一般采用磷酸鹽緩沖溶液（Phosphate Buffer Saline，PBS）作為溶劑，其主要成分是Na2HPO4、KH2PO4、NaCl 和KCl，其中Na2HPO4和KH2PO4可以通過(guò)二級(jí)解離起到緩沖作用，而NaCl 和KCl 主要作用為增加鹽離子濃度，使細(xì)胞里pH 和滲透壓保持不變，最大限度起到保護(hù)細(xì)胞的作用。對(duì)于特殊的細(xì)胞器純化，可在PBS 補(bǔ)加1 mmol/L 的CaCl2和0.5 mmol/L 的MgCl2，提供二價(jià)陽(yáng)離子。雖然PBS 適用范圍很廣，但是針對(duì)于某些細(xì)胞器的親和純化需要改進(jìn)溶液體系，如加入KCl的緩沖液可以分離出能夠支持膜電位的耦合的線粒體[7]。因此，2016 年來(lái)自于劍橋大學(xué)CHEN 等[8]開(kāi)發(fā)了一種僅由KCl 和KH2PO4組成的LC/MS 兼容的緩沖液KPBS，能顯著提高純化效率。越來(lái)越多的學(xué)者選擇KPBS 來(lái)代替PBS，不僅局限于純化線粒體，也包括溶酶體和過(guò)氧化物酶體等[1]。

1.2 細(xì)胞破碎

常見(jiàn)的細(xì)胞破碎方法分為玻璃勻漿器法、超聲波破碎法、化學(xué)法和液氮反復(fù)凍融法。

（1）玻璃勻漿器法。玻璃勻漿器法是最常用的細(xì)胞器破碎方法，勻漿器一般由一根底端為球形表面磨砂的玻璃桿和一個(gè)內(nèi)壁磨砂的玻璃套管組成，研缽磨球和玻璃管內(nèi)壁之間間隙保持在幾微米距離。使用時(shí)，將剪碎的組織或細(xì)胞懸液加入勻漿管中，然后將研磨桿放入玻璃套管上下移動(dòng)數(shù)次，即可將細(xì)胞破碎。

（2）超聲波處理法。超聲波破碎儀能產(chǎn)生固定頻率的超聲信號(hào)，聲波形成沖擊和振動(dòng)會(huì)產(chǎn)生一定的剪切力，致使細(xì)胞破碎。超聲破碎儀耗時(shí)短且省力，但是在超聲時(shí)會(huì)產(chǎn)熱，因此在超聲時(shí)應(yīng)將材料置于冰浴中，避免溫度升高造成生物大分子失活。

（3）化學(xué)裂介法。處理前，常需要在破碎過(guò)程中加入表面活性劑，常見(jiàn)的表面活性劑有Triton-100、NP-40、SDS 以及脫氧膽酸鈉等，然后加以機(jī)械輔助，如用針頭裂解。這類化學(xué)試劑可以改變細(xì)胞膜的通透性使生物大分子從細(xì)胞中釋放出來(lái)，從而達(dá)到細(xì)胞破碎的目的，注意后續(xù)操作中應(yīng)將這些表面活性劑清除，避免影響分析。

（4）反復(fù)凍融法。將制備好的組織或細(xì)胞懸液放在液氮中冷凍后，然后在室溫或者37 ℃融化，經(jīng)過(guò)3 ～4 次凍融周期，可使細(xì)胞破碎。

2 細(xì)胞器的分離純化

2.1 離心分離純化法

2.1.1 背景及原理

離心法分離中離心轉(zhuǎn)子的旋轉(zhuǎn)產(chǎn)生離心場(chǎng)和離心力，離心力作用于離心場(chǎng)中的粒子并取決于粒子的質(zhì)量、旋轉(zhuǎn)速度和離旋轉(zhuǎn)中心的距離[9]。離心分離技術(shù)原理非常簡(jiǎn)單，根據(jù)細(xì)胞器的大小、密度、沉降系數(shù)不同，采用逐漸增加離心速度或低速和高速交替進(jìn)行離心，使沉降速度不同的顆粒在不同的分離速度及不同的離心時(shí)間下分批分離的方法。1974年，來(lái)自洛克菲勒和紐約大學(xué)的DUVE、CLAUDE 和PALADE 發(fā)現(xiàn)并總結(jié)了現(xiàn)代微觀分析技術(shù)和密度梯度離心的基本原理，并使用離心技術(shù)成功分離來(lái)自大鼠肝臟的細(xì)胞器而共同獲得了諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)[10]。如今，隨著離心機(jī)種類增多和功能不斷完備，離心技術(shù)已經(jīng)成為實(shí)驗(yàn)室中分離細(xì)胞器使用最廣泛和可信的手段，離心機(jī)的分類（按轉(zhuǎn)速）見(jiàn)表1。

表1 離心機(jī)的分類（按轉(zhuǎn)速）

2.1.2 離心分離過(guò)程

在離心分離純化細(xì)胞器過(guò)程中，分為差速離心和密度梯度離心。差速離心是根據(jù)離心機(jī)不同轉(zhuǎn)速下產(chǎn)生不同離心力，將各種細(xì)胞器進(jìn)行分離的，其一般操作過(guò)程如圖1 所示。

圖1 差速離心的一般過(guò)程

因此，差速離心需要多次離心以達(dá)到分離不同組分的目的。盡管如此，得到的細(xì)胞器純度并不高，所以實(shí)驗(yàn)室在分離純化細(xì)胞器的過(guò)程中往往還會(huì)在差速離心分離的基礎(chǔ)上，將得到的沉淀利用密度梯度離心進(jìn)行再分離。

密度梯度離心法是由BRAKKE 在1951 年發(fā)明的[9]，用于根據(jù)物質(zhì)的密度分離樣品。用這種方法分離細(xì)胞器，梯度液的配制是一個(gè)要點(diǎn)，常見(jiàn)的配制梯度液的介質(zhì)有蔗糖、Ficoll[11]、Percoll、碘化介質(zhì)（OptiPrep，Nycodenz 及metrizamide）等[12]。因蔗糖溶液配制簡(jiǎn)單，材料易得而且價(jià)格低廉，實(shí)驗(yàn)室中多采用蔗糖作為密度梯度液來(lái)分離細(xì)胞器。但是蔗糖本身在不同密度都具有一定的滲透性，分離滲透性敏感的細(xì)胞器如溶酶體，需要用其他材料代替。

根據(jù)以往的文獻(xiàn)報(bào)道，密度梯度離心分離純化細(xì)胞器常見(jiàn)的介質(zhì)以及轉(zhuǎn)速如表2 所示。

表2 細(xì)胞器分離推薦使用的密度梯度和離心條件

總的來(lái)說(shuō)，用離心分離法純化細(xì)胞器可以處理大批量材料，成本低，適用性廣。但是離心分離法的缺陷也很明顯：第一，純度低，達(dá)不到生化分析尤其是在蛋白質(zhì)組學(xué)分析要求[1]；第二，耗時(shí)耗力，不適用于分析細(xì)胞內(nèi)某些信號(hào)分子或者不穩(wěn)定小分子代謝物，如溶酶體攜帶了氧化鐵共軛右旋糖酐后，離心分離無(wú)法去除這部分溶酶體[13]，因?yàn)殡S著載入和追逐時(shí)間的延長(zhǎng)，梯度液在不同的核內(nèi)體和溶酶體中都有不同程度的富集[14]，且長(zhǎng)期積累不可降解的右旋糖酐可能會(huì)對(duì)溶酶體功能產(chǎn)生一些意想不到的影響[15]；第三，離心分離過(guò)程中需要的各種類型的離心設(shè)備價(jià)格昂貴，對(duì)于缺乏相應(yīng)設(shè)備的實(shí)驗(yàn)室來(lái)說(shuō)可能無(wú)法進(jìn)行相關(guān)實(shí)驗(yàn)。

2.2 親和純化

2.2.1 原理及背景

親和純化，最開(kāi)始被稱為免疫分離。1978 年ITO和PALADE 提出了免疫分離亞細(xì)胞器的方法，隨后多個(gè)研究小組以此為基礎(chǔ)進(jìn)行了方法研究，每種方法都使用了不同的固體載體和原理[16]。親和純化依賴于暴露在抗原外表面的抗原位點(diǎn)的存在，利用抗原抗體特異性識(shí)別結(jié)合特性，而不是細(xì)胞器的物理特性。識(shí)別抗原的抗體通常與一個(gè)固體載體結(jié)合，一般稱為磁珠，通過(guò)含有特異性抗體的磁珠將細(xì)胞器與其他成分分離，因此親和純化的限制性因素是特異性抗體的制備[3]。而細(xì)胞器標(biāo)志蛋白的發(fā)現(xiàn)、抗體數(shù)量增加和蛋白標(biāo)記技術(shù)飛速發(fā)展使這項(xiàng)技術(shù)得到了廣泛的應(yīng)用。

2.2.2 純化過(guò)程

親和純化一般流程如圖3 所示。以從體外培養(yǎng)的細(xì)胞中純化細(xì)胞器為例，實(shí)驗(yàn)室常用的做法是構(gòu)建穩(wěn)定特異性表達(dá)細(xì)胞器標(biāo)志蛋白和標(biāo)簽蛋白的融合蛋白的細(xì)胞株，將一定量的細(xì)胞株勻漿后，用勻漿液與磁珠結(jié)合一定時(shí)間，用等滲緩沖液清洗和去除不必要的污染物，最后用多肽或者其他競(jìng)爭(zhēng)性洗脫液洗脫。細(xì)胞器親和純化技術(shù)可用于分離包括質(zhì)膜[17]、突觸囊泡[18]、葉綠體[19]、線粒體[20]、過(guò)氧化物酶體[21]和溶酶體[22]等細(xì)胞器。

相對(duì)于離心分離，親和純化分離細(xì)胞器優(yōu)勢(shì)明顯：（1）速度快，對(duì)于分析某些信號(hào)分子和代謝物來(lái)說(shuō)適用；（2）特異性強(qiáng)，分離純化得到的細(xì)胞器純度高；（3）分離過(guò)程中不涉及一些大型的實(shí)驗(yàn)設(shè)備和復(fù)雜的過(guò)程，可操作性強(qiáng)，從而克服了傳統(tǒng)方法的一些缺點(diǎn)。但是，親和純化分離細(xì)胞器也有包括抗體親和純化需要大量的抗體、用多肽洗脫細(xì)胞器效率不高等問(wèn)題。

3 細(xì)胞器純化分離后鑒定

細(xì)胞器純化分離后需要鑒定細(xì)胞器的純度和完整性。常見(jiàn)的鑒定細(xì)胞器完整性方法是胰蛋白酶消化實(shí)驗(yàn)、定量Western Blot 鑒定純度輔助質(zhì)譜分析。用雙向凝膠電泳也可以對(duì)分離的細(xì)胞器組分進(jìn)行定量和定性分析[17]。對(duì)于所有組分的形態(tài)分析，可以采用標(biāo)準(zhǔn)的電子顯微鏡程序[4]。

圖2 親和純化一般流程

4 結(jié)語(yǔ)

隨著現(xiàn)代生物學(xué)的發(fā)展，人們對(duì)各種細(xì)胞器的功能以及相關(guān)蛋白的研究越來(lái)越深入。高效快速的分離純化純度較高的單個(gè)細(xì)胞器對(duì)于后續(xù)蛋白質(zhì)組學(xué)分析起著重要作用。因此，在純化分離細(xì)胞器的過(guò)程中應(yīng)該根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康?，在試劑、破碎方法、純化方式中綜合設(shè)計(jì)最佳方案。

傳統(tǒng)的離心分離處理批量大、適用性廣、穩(wěn)定可靠，但處理過(guò)程耗時(shí)耗力而且有時(shí)達(dá)不到理想的純度。親和純化是現(xiàn)在比較受歡迎的純化方式，純化速度快，特異性強(qiáng)，純度高，但適用于小批量純化，受限于抗體的可用性，且磁珠價(jià)格昂貴。未來(lái)生物學(xué)的發(fā)展將不斷改進(jìn)這些試驗(yàn)方法的缺陷，細(xì)胞的分離純化方式將會(huì)得到更進(jìn)一步完善。