發(fā)卡狀銀納米簇?zé)晒馓结樣糜诨驒z測(cè)

張 浩，趙 影，婁大偉

(吉林化工學(xué)院 化學(xué)與制藥工程學(xué)院,吉林 吉林 132022)

基因檢測(cè)對(duì)遺傳疾病診斷、癌癥治療和傳染病控制意義非凡[1].2002年爆發(fā)的非典與2019年的新冠肺炎這兩種重大傳染病都與病毒有關(guān),在這兩件實(shí)例中基因檢測(cè)是有效的篩查手段.除傳染病外,細(xì)菌對(duì)抗生素治療的耐藥性也是我們面對(duì)的難題,2015年研究者發(fā)現(xiàn)了一種抗生素耐藥性基因相關(guān)的耐藥機(jī)制[2].這些事例表明,展開對(duì)基因檢測(cè)方法的研究是非常有必要的.目前基因檢測(cè)的方法有毛細(xì)管電泳法[3]、聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)[4]、電化學(xué)發(fā)光法[5]等,而這些方法不可避免的要經(jīng)歷耗時(shí)繁瑣的步驟和高昂的成本,建立一種成本低廉、方便快速的基因檢測(cè)方法成為近年來的研究熱點(diǎn).

DNA是生物學(xué)中遺傳信息的主要分子載體[6],它的構(gòu)象非常靈活,隨著人工合成DNA技術(shù)的發(fā)展,DNA被越來越多的人用作納米顆粒模板[7].銀納米簇(AgNCs)由幾個(gè)至幾百個(gè)銀原子組成[8],由于其在納米尺度上的光學(xué)性能優(yōu)于其他過渡金屬而被廣泛關(guān)注[9],使用DNA為模板合成的銀納米簇(DNA-AgNCs)具有生物相容性好、光學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定等特點(diǎn)[10],基于發(fā)卡狀銀納米簇?zé)晒馓结槥榛驒z測(cè)提供了一種降低成本、簡化操作過程的新思路.

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試劑與儀器

硝酸銀(AgNO3)和硼氫化鈉(NaBH4)購買自國家醫(yī)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司.實(shí)驗(yàn)中涉及的試劑均為分析純且無進(jìn)一步純化.實(shí)驗(yàn)中使用的超純水均取自Mill-Q試劑水系統(tǒng).熒光發(fā)射光譜測(cè)試結(jié)果記錄于F97XP(上海棱光技術(shù)有限公司)熒光分光光度計(jì),激發(fā)波長為466 nm,激發(fā)帶寬與發(fā)射帶寬分別為10 nm.熒光銀納米簇在SHA-C 恒溫往復(fù)水浴鍋中合成.緩沖溶液pH值通過Sartorius PB-10 pH計(jì)(中國北京標(biāo)準(zhǔn)儀器有限公司)校準(zhǔn).本文涉及的DNA樣品購買于上海Sangon 生物科技有限公司,其序列如表1所示.

表1 DNA序列

1.2 實(shí)驗(yàn)過程

銀納米簇的制備:在小管中依次滴入10 μL 30 μM發(fā)卡狀探針probe,50 μL 100 μM pH=7.4的Tris-HNO3緩沖溶液，40 μL水,室溫震蕩2 h,隨后加入100 μL Tris-HNO3和60 μL水10 μL 180 μM AgNO3溶液,震蕩5 min后加入10 μL 180 μM NaBH4溶液繼續(xù)震蕩5 min隨后25 ℃水浴6 h.

可行性試驗(yàn):分別制備空白樣與試驗(yàn)樣,空白樣A中僅含有發(fā)卡狀探針probe,試驗(yàn)樣B中同時(shí)含有發(fā)卡狀探針probe與乙肝病毒合成序列HBV[11],在熒光分光光度計(jì)上分別檢測(cè)二者熒光強(qiáng)度并記錄.

制備條件的探究:為了優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件,對(duì)制備過程中的合成時(shí)間,反應(yīng)溫度以及探針與硝酸銀的摩爾比進(jìn)行了探究.

HBV序列的檢測(cè):使用探針probe對(duì)人工合成序列HBV的一系列濃度進(jìn)行了熒光強(qiáng)度的檢測(cè).

選擇性試驗(yàn):選擇3種與HBV相似但不同的DNA序列作為類似物對(duì)探針的選擇性進(jìn)行了探究.

2 結(jié)果與討論

2.1 機(jī)理及可行性分析

當(dāng)待測(cè)液中不含HBV時(shí),探針probe自發(fā)組裝為發(fā)卡狀,此時(shí)向溶液中加入硼氫化鈉來還原硝酸銀得到的銀納米簇呈現(xiàn)較弱熒光.向探針probe中加入HBV后,HBV的序列與環(huán)狀識(shí)別區(qū)結(jié)合形成穩(wěn)定的雙螺旋結(jié)構(gòu),將發(fā)卡狀探針probe打開,此時(shí)在溶液中再加入硼氫化鈉與硝酸銀時(shí)整個(gè)體系的熒光強(qiáng)度顯著增加.這個(gè)現(xiàn)象是因?yàn)檫x用了一個(gè)能生成銀納米簇的DNA模板序列C3AC3AC3TC3A[12].在發(fā)卡打開時(shí),此模板形成i-motif結(jié)構(gòu),可作為模板誘導(dǎo)合成有熒光的銀納米簇.發(fā)卡沒打開的時(shí)候,部分形成的DNA雙鏈結(jié)構(gòu)會(huì)阻礙i-motif結(jié)構(gòu)的形成,從而導(dǎo)致熒光強(qiáng)度下降.熒光強(qiáng)度的變化與HBV的濃度正相關(guān),據(jù)此實(shí)現(xiàn)對(duì)HBV的基因檢測(cè).

對(duì)提出的檢測(cè)方法進(jìn)行可行性分析.如圖1(a)所示,使用466 nm為激發(fā)波長時(shí)在540 nm處得到明顯的吸收峰,這表明合成了發(fā)射藍(lán)綠光的熒光銀納米簇.分別測(cè)試了當(dāng)待測(cè)液中僅含有探針probe和探針probe與HBV共存時(shí)的熒光發(fā)射光譜,結(jié)果如圖1(b)所示,向探針probe中加入HBV后體系熒光明顯增強(qiáng),我們可以依據(jù)熒光變化程度對(duì)HBV濃度進(jìn)行檢測(cè).

(a)探針DNA1檢測(cè)HBV的機(jī)理圖

Wavelength/nm(b)探針DNA1的激發(fā)光譜與發(fā)射光譜

Wavelength/nm(c)空白樣品與試驗(yàn)樣品的熒光發(fā)射光譜圖1 可行性分析

2.2 實(shí)驗(yàn)條件的優(yōu)化

在銀簇合成過程中,時(shí)間與溫度等實(shí)驗(yàn)條件對(duì)銀簇有較大影響,因此對(duì)合成時(shí)間、反應(yīng)溫度以及探針probe與硝酸銀的摩爾比進(jìn)行了研究.實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖2所示,如圖2(a)所示,隨著反應(yīng)時(shí)間的增長,熒光的變化程度在逐漸增大,6 h以后熒光強(qiáng)度的變化程度趨于平緩,這說明銀納米簇在6 h就可完全形成,因此合成時(shí)間選擇6 h.在合成銀簇的實(shí)驗(yàn)中,4 ℃與25 ℃是兩個(gè)常用溫度,所以我們對(duì)其進(jìn)行了探索,結(jié)果如圖2(b)所示,在同樣反應(yīng)了6 h后,反應(yīng)溫度為25 ℃時(shí)熒光強(qiáng)度的變化更為明顯,所以選擇25 ℃作為反應(yīng)溫度.此外,分別探究探針probe與硝酸銀摩爾比為1：3、1：6、1：9、1：12、1：15時(shí)的熒光變化程度,圖2(c)表明n(DNA1)：n(AgNO3)為1：6時(shí)實(shí)驗(yàn)效果最好,此實(shí)驗(yàn)結(jié)果也符合銀納米簇模板序列i-motif結(jié)構(gòu)的化學(xué)計(jì)量學(xué)比例.所以我們?cè)?5 ℃,n(DNA1)：n(AgNO3)為1：6,反應(yīng)6 h的條件下來制備熒光銀納米簇.

t/h(a)時(shí)間與熒光變化程度的關(guān)系

T/℃(b)溫度與熒光變化程度的關(guān)系

(c)DNA和硝酸銀之間的摩爾比與熒光變化程度的關(guān)系圖2 實(shí)驗(yàn)條件的優(yōu)化

2.3 基因序列的檢測(cè)

用設(shè)計(jì)好的探針probe對(duì)一系列不同濃度的HBV進(jìn)行檢測(cè),具體濃度分別為0、0.05、0.1、0.25、0.5、0.75、1 μM.檢測(cè)結(jié)果如圖3所示,圖3(a)表明隨著HBV在待測(cè)液中濃度的升高,發(fā)生了輕微藍(lán)移,熒光強(qiáng)度也隨之加強(qiáng),且在0.05～1 μM間有良好的線性關(guān)系,線性方程為F=545.92+1266.85C(HBV),檢出限為0.016 μM.

Wavclength/nm(a)含有一系列不同濃度HBV待測(cè)液的熒光發(fā)射光譜

Concentration/μm(b)HBV濃度與熒光強(qiáng)度的關(guān)系圖3 HBV的檢測(cè)

2.4 選擇性

為了探究探針probe對(duì)HBV的選擇性,選擇了3種與HBV相似但不同的人工合成序列作為類似物,并對(duì)其進(jìn)行分析.結(jié)果如圖4所示.

圖4 探針DNA1對(duì)HBV的選擇性

探針對(duì)HBV的響應(yīng)最高,其他類似物的序列無法打開發(fā)卡狀結(jié)構(gòu),說明所設(shè)計(jì)的探針選擇性良好.

3 結(jié) 論

基于人工合成DNA設(shè)計(jì)了一種探針來檢測(cè)HBV,當(dāng)HBV存在時(shí)會(huì)引起DNA結(jié)構(gòu)變化來誘導(dǎo)合成熒光銀納米簇,并對(duì)反應(yīng)時(shí)間、合成溫度、摩爾比等對(duì)體系熒光有影響的因素進(jìn)行了探究,在最優(yōu)實(shí)驗(yàn)條件下該探針選擇性良好,在0.05～1 μM間有良好的線性關(guān)系,檢出限低,整個(gè)檢測(cè)方法耗時(shí)短且成本低.