斑馬魚Slc26A4基因敲除品系的構(gòu)建

賴若沙謝繽靈鄧慧玲付貴芳劉嘉伍偉景謝華平謝鼎華*

1中南大學(xué)湘雅二醫(yī)院耳鼻咽喉科(長沙410011)

2動(dòng)物腸道功能調(diào)控湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(長沙410081)

3動(dòng)物營養(yǎng)與人體健康實(shí)驗(yàn)室(長沙410081)

4淡水魚類發(fā)育生物學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(長沙410081)

SLC26A4是大前庭水管綜合癥(enlarged vestibular aqueduct syndrome,EVAS)的致病基因，也是中國第二位致聾基因[1,2]。SLC26A4基因編碼一種由780個(gè)氨基酸和12個(gè)或更多的跨膜域組成的跨膜蛋白--pendrin。Pendrin是一種跨質(zhì)膜交換陰離子蛋白，主要參與甲狀腺中的Cl-/I-交換和內(nèi)耳中的Cl-/HCO3-交換，后者在胚胎后期和出生后早期的內(nèi)耳發(fā)育中至關(guān)重要。SLC26A4基因突變可導(dǎo)致常染色體隱性遺傳的Pendred綜合征(PS)，包括甲狀腺腫、聽力喪失和前庭導(dǎo)水管增大[3]。

內(nèi)耳由耳蝸、前庭和內(nèi)淋巴囊組成[4]，內(nèi)淋巴液位于內(nèi)耳膜迷路內(nèi)，具有其獨(dú)特的離子組成[5]。穩(wěn)定的內(nèi)淋巴離子環(huán)境是正常聽力和前庭功能所必需的，它受到內(nèi)耳細(xì)胞中表達(dá)的各種離子通道、轉(zhuǎn)運(yùn)體和泵的調(diào)節(jié)。Pendrin是Cl-/HCO3-交換陰離子交換劑，表達(dá)于內(nèi)耳的上皮細(xì)胞，對內(nèi)淋巴離子環(huán)境的穩(wěn)態(tài)非常重要[6-8]。

目前已有SLC26A4致聾機(jī)制的小鼠模型，包括基 因 敲 除 小 鼠（Slc26A4Δ/Δ），基 因 敲 入 小 鼠（Slc26A4tm1Dontuh/tm1Dontuh），和 一 個(gè) ENU 誘 發(fā) 的Slc26A4loop/loop突變小鼠和幾個(gè)轉(zhuǎn)基因模型[9]。這些小鼠模型因?yàn)橄忍烊狈δ苄詐endrin，表現(xiàn)為重度聽力喪失和前庭功能障礙，并伴有內(nèi)淋巴間隙增大[9,10]。近年來，斑馬魚已經(jīng)成為研究魚體內(nèi)離子調(diào)節(jié)的強(qiáng)大模型[11]。斑馬魚和人類基因有高達(dá)87%的同源性，并且能夠在胚胎中進(jìn)行基因沉默實(shí)驗(yàn)[12]。成年斑馬魚具有極高的親和力和高容量Cl-攝取機(jī)制，該機(jī)制可根據(jù)環(huán)境變化進(jìn)行調(diào)節(jié)[13]。因此，在描述內(nèi)耳的Cl-/HCO3-交換的分子機(jī)制方面，斑馬魚比其他物種具有顯著的優(yōu)勢。

為了研究Slc26A4基因在斑馬魚內(nèi)耳發(fā)育過程中的作用，本研究利用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)構(gòu)建斑馬魚Slc26A4基因敲除品系，對于EVAS的病理機(jī)制的理解和新的防治方案的研發(fā)具有十分重要的意義。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 試驗(yàn)動(dòng)物

TU品系斑馬魚來自本實(shí)驗(yàn)室。水溫28℃，pH值在6.5～ 7.5，14h光照/10h黑暗交替循環(huán)。胚胎在28.5℃的E3水中培養(yǎng)，第5天開始喂食草履蟲至2周左右，之后轉(zhuǎn)移至養(yǎng)殖系統(tǒng)架上喂食豐年蟲。

1.1.2 主要試劑

引物由擎科生物合成，DNA marker，PCR高保真酶購自擎科生物，瓊脂糖購自BBI公司，PCR產(chǎn)物純化試劑盒購自生工生物，體外轉(zhuǎn)錄試劑盒購自Thermo Fisher Scientific公司，RNA純化試劑盒購自Qiagen公司，Cas9蛋白購自ThermoFisherScientific公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 sgRNA靶位點(diǎn)設(shè)計(jì)

首先在Ensembl網(wǎng)站上（http://www.ensembl.org/index.html）獲取目標(biāo)基因的完整序列，各個(gè)轉(zhuǎn)錄本以及內(nèi)外顯子等信息；找出所有緊鄰5‘-NGG-3’（PAM）的候選靶序列，靶序列一般大小為18～ 20bp。sgRNA引物序列F基本結(jié)構(gòu)：靶序列前加保護(hù)堿基（gcg）和T7啟動(dòng)子[11]（TAATACGACT‐CACTATA），靶序列后加sgRNA骨架序列上游序列（GTTTTAGAGGCTAGAAATAGG），R：（AAGCACC‐GACTCGGTGCCACT），根據(jù)Slc26A4基因靶位點(diǎn)通過Primer3.0設(shè)計(jì)基因組正反檢測引物GSlc26A4-F和GSlc26A4-R（表1）。

表1 本文涉及到的引物和模板序列Table 1 Primers and template sequences involved in this study

1.2.2 sgRNA的合成

以Template DNA為模板[11]，sgRNA1-F/sgRNAR或sgRNA2-F/sgRNA-R為正反引物，退火溫度為58℃，延伸時(shí)間為10s，用高保真酶進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得攜帶T7啟動(dòng)子的Slc26A4基因靶位點(diǎn)序列1及序列2的sgRNA模板序列；PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳并切膠回收，以回收的PCR產(chǎn)物作為模板，用T7體外轉(zhuǎn)錄試劑盒合成sgRNA，轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物用RNA純化試劑盒進(jìn)行純化回收，-80℃保存。

1.2.3 顯微注射以及靶位點(diǎn)有效性檢測

收集15 min內(nèi)產(chǎn)的斑馬魚受精卵，待發(fā)育至1細(xì)胞期，將Slc26A4基因靶位點(diǎn)的sgRNA1、sgRNA2和Cas9蛋白按合適比例混勻，注射到斑馬魚受精卵中，隨后置于28.5℃的恒溫箱中培養(yǎng)；受精卵發(fā)育至36hpf挑選部分胚胎進(jìn)行基因敲除的有效性鑒定，剩余胚胎繼續(xù)培養(yǎng)至成魚。

1.2.4 可穩(wěn)定遺傳突變體的篩選

將注射后的胚胎培養(yǎng)至2個(gè)月左右發(fā)育為幼魚，并對幼魚逐條剪尾進(jìn)行基因型鑒定。由于兩個(gè)靶位點(diǎn)之間相距145 bp，如果兩個(gè)靶位點(diǎn)都有效，就會(huì)造成較大片段的缺失。用檢測引物對基因組進(jìn)行PCR擴(kuò)增，隨后進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，若PCR產(chǎn)物會(huì)同時(shí)出現(xiàn)473bp的野生型目的條帶，以及比野生型目的條帶小100bp左右的條帶，則這些幼魚為攜帶突變的F0代魚；將F0代幼魚繼續(xù)飼養(yǎng)1個(gè)月左右至成魚，與野生型進(jìn)行雜交，用同樣的基因型鑒定方法篩選出可穩(wěn)定遺傳的魚，這些魚為F1代突變體。基因型鑒定后，將F1代突變體中比野生型目的條帶小的DNA條帶進(jìn)行切膠回收，并送公司測序并分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 Slc26A4基因結(jié)構(gòu)域分析

在https://www.ncbi.nlm.nih.gov查找斑馬魚Slc26A4基因信息，利用SMART網(wǎng)站（http://smart.embl-heidelberg.de）分析蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域（圖1）。

圖1 SLC26A4蛋白結(jié)構(gòu)域分析Fig.1 Analysis of SLC26A4 protein domain

2.2 Slc26A4基因靶位點(diǎn)確定

按1.2.1所述的方法在Slc26A4上選擇敲除位點(diǎn)（見圖2），靶位點(diǎn)序列前加保護(hù)堿基和啟動(dòng)子序列，靶位點(diǎn)序列后加sgRNA骨架上游序列，將此作為正向引物sgRNA1-F和sgRNA2-F。sgRNA骨架下游序列作為反向引物sgRNA-R。

圖2 Slc26A4基因靶位點(diǎn)示意圖。Slc26A4基因的部分序列，大寫加粗部分為外顯子，小寫未加粗部分為內(nèi)含子；下劃線為波浪線的表示靶位點(diǎn)序列，下劃線為雙直線的表示為PAM序列；下劃線為直線的則是檢測引物。Fig.2 The diagram ofSlc26A4gene targeting site.Above is partial sequence of theSlc26A4gene.The capitalized with bold sequences are exons,the lower case with bold parts are introns；The sequence with wavy line indicated the target site1 and target site2 sequence,respectively;the doubled underlines showed PAM sequence.Underlined by single lines are prim‐ers for genotyping.

2.3 Slc26A4基因注射有效性檢測與分析

為了檢驗(yàn)靶位點(diǎn)的有效性，本文按方法1.2.3中所述將注射后胚胎進(jìn)行基因型鑒定，結(jié)果顯示，2號(hào)和6號(hào)泳道除了野生型條帶外，下方有一條小帶，證明暗示選擇的這兩個(gè)靶位點(diǎn)都有效（見圖3）。

圖3 sgRNA有效性分析。PCR電泳圖。M：DNAmarker；1：對照；2～ 6：注射胚胎PCR產(chǎn)物。2和6泳道除了有一條野生型條帶外，下方有一條小帶(黑色箭頭指示)，證明兩個(gè)靶位點(diǎn)都有效。Fig.3 Effectiveness analysis of sgRNA.Gel electrophoresis of PCR products.M:DNA marker;1:Control;2～ 6:PCR products injected with sgRNA.In addition to a wild-type band in lanes 2 and 6,there is band(indicated by a black arrow‐head)below,indicating that both target sites work.

2.4 F0代突變體篩選

將剩余胚胎養(yǎng)至成魚并做基因型鑒定（見圖4）。結(jié)果顯示2、3、6、7以及8號(hào)成魚攜帶突變基因。

圖4 F0代幼魚篩選。M：DNAmarker；1：野生型對照；2～ 8：幼魚剪尾提取基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增的產(chǎn)物。2、3、6、7以及8號(hào)泳道除了野生型條帶外，下方有一條小帶(黑色箭頭指示)。Fig.4 F0 juvenile screening.M:DNA marker;1:Control;2～ 8:PCR products using juvenile genomic DNA injected with Slc26A4 sgRNAs.In addition to a wildtype band,lanes 2,3,6,7 and 8 have a smaller band(black arrowhead indicated).

2.5 穩(wěn)定遺傳突變體的篩選

本試驗(yàn)將篩選到的F0代突變體與野生型斑馬魚雜交，得到F1代，收集F1代胚胎，進(jìn)行DNA鑒定，結(jié)果顯示F0代突變體可穩(wěn)定遺傳（圖5a）。隨后將較小的條帶回收并送測序，峰圖顯示兩個(gè)靶位點(diǎn)都出現(xiàn)缺失(圖5b)，測序結(jié)果證明兩個(gè)靶位點(diǎn)都有效并造成大片段的缺失，結(jié)果如圖5c。將剩余的F1代胚胎養(yǎng)至2個(gè)月的幼魚，再逐條剪尾進(jìn)行基因型鑒定（圖5d），獲得到可穩(wěn)定遺傳的F1代魚，說明敲除品系構(gòu)建成功。

圖5 F1代突變體篩選。a.F1代基因型鑒定電泳圖。M：DNAmarker；1：對照；2～ 14：注射胚胎sgRNA后，提取基因組 DNA，進(jìn)行PCR擴(kuò)增的產(chǎn)物。第13號(hào)泳道除了野生型條帶外，下方有一條小帶(黑色箭頭指示)。b.F1突變體成魚PCR產(chǎn)物凝膠電泳。M：DNAmarker；1：對照；2～ 13：注射胚胎基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增的產(chǎn)物。第2、13號(hào)泳道除了有野生型條帶外，下方有一條小帶(黑色箭頭指示);c.F1代胚胎PCR產(chǎn)物測序峰圖，峰值圖中：“——”代表靶位點(diǎn)1序列；d.測序序列比對結(jié)果。Fig.5 F1 generation mutant screening.a:Gel electrophore‐sis of F1 embryogenotyping.M:DNA marker;1:control;2～ 14:PCR products using genomic DNA injected with sgRNA.In addition to a wild-type band,thereis a smaller band in lane 13(indicated by the black arrowhead);b):Gel electrophoresis of PCR products of F1 mutant.M:DNA marker;1:control;2～ 13:PCR product injected with embryo genomic DNA.In ad‐dition to a wildtype band,there is a smaller band in lanes 2,13(Indicated by the black arrowhead);c:The F1 mutant se‐quencing result,the smaller band of PCR product was puri‐fied and sent for sequencing,“——”indicated the first tar‐get site sequence;d:Sequence alignmentresult.

3 討論

EVAS是兒童感音神經(jīng)性耳聾中最常見的病因之一，EVAS患者聽力損失具有延遲發(fā)作和進(jìn)行性發(fā)展的特點(diǎn)，這為臨床進(jìn)行干預(yù)提供了治療時(shí)間窗，尤其對于語言能力習(xí)得階段的嬰幼兒來說至關(guān)重要[2]。研究小鼠模型發(fā)現(xiàn)，內(nèi)耳內(nèi)淋巴囊增大、內(nèi)淋巴液酸化是聽力喪失發(fā)病機(jī)制中的早期事件[9]。因此，EVAS的聽力損失機(jī)制研究將集中在耳蝸發(fā)育過程中液體運(yùn)輸及離子交換，以及耳蝸細(xì)胞和分子功能改變[2]。這些研究結(jié)果可以指導(dǎo)制定相應(yīng)的治療方案，以最大限度地保留SLC26A4突變患者的聽力。

人體有一些器官是利用充滿液體的腔體來分隔生化和生物物理環(huán)境，并發(fā)揮相應(yīng)功能的，如眼睛、腦室及內(nèi)耳。病理情況下由于房水產(chǎn)生或引流減少而引起的眼壓不穩(wěn)定可導(dǎo)致失明，如高滲性黃斑病變或青光眼；而腦室靜水壓力不穩(wěn)定與腦積水和精神障礙有關(guān)；同樣，內(nèi)耳壓力不穩(wěn)定會(huì)導(dǎo)致耳聾和平衡障礙，如EVAS和梅尼埃病。膜迷路中內(nèi)淋巴壓力的正常調(diào)節(jié)對我們的聽覺和平衡感至關(guān)重要，而內(nèi)淋巴囊及蝸管的存在有助于這種調(diào)節(jié)。然而，內(nèi)淋巴囊是如何發(fā)揮其作用的尚不太清楚。內(nèi)耳被包裹在人體最密集的巖骨中，因此很難被研究。而斑馬魚的內(nèi)耳結(jié)構(gòu)在骨頭形成之前就開始工作了，易于注射和顯微鏡觀察，因此Winburne[14]等人利用了斑馬魚胚胎的內(nèi)耳進(jìn)行研究，并發(fā)現(xiàn)當(dāng)內(nèi)耳壓力升高時(shí)，內(nèi)淋巴囊慢慢充滿淋巴液，然后迅速釋放。而魚的基因突變會(huì)阻止囊腔收縮，導(dǎo)致囊腔過度膨脹，而這些變化與聽力和平衡障礙患者相一致。這些結(jié)果表明斑馬魚可以作為很好的模型，來研究內(nèi)耳發(fā)育過程中Slc26A4在內(nèi)淋巴囊增大、內(nèi)淋巴液酸化的中發(fā)揮的作用。

CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)是近年來頗受關(guān)注的新技術(shù)，該技術(shù)由兩部分組成，CRISPR結(jié)構(gòu)骨架序列和Cas9蛋白。CRISPR結(jié)構(gòu)骨架序列由前導(dǎo)序列、Cas基因、CRISPR基因座共同組成，具有招募Cas蛋白作用[15]。Cas9蛋白能結(jié)合到靶序列處特異性切割DNA雙鏈。CRISPR基因座經(jīng)過轉(zhuǎn)錄加工后，得到成熟的CRISPR RNA即crRNA，而crRNA與反式激活的crRNA即tracrRNA能形成一種嵌合RNA，該嵌合RNA與Cas9蛋白形成復(fù)合物，從而切斷基因組DNA[15,16]。后經(jīng)改造，將crRNA和tracrRNA改造成一個(gè)sgRNA（sequencespecific guide RNA）[17]，sgRNA與靶序列進(jìn)行堿基配對，從而引導(dǎo)Cas9蛋白結(jié)合到靶序列處行使DNA切割功能。目的基因靶位置序列的3’端有原間隔序列相鄰基序PAM（protospacer adjacent motifs），為5‘-NGG-3’序列，這是Cas9蛋白的識(shí)別位點(diǎn)。最后，通過改變sgRNA序列，體外合成sgRNA，Cas9蛋白可以靶向切割目的基因，從而達(dá)到基因敲除目的[18,19]。

CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)面世之前，基因編輯的方法有鋅指核酸酶技術(shù)（Zinc-finger nucleas‐es，ZFN）和轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應(yīng)物核酸酶技術(shù)（Transcription activator-like effector nucleases，TALEN），但ZFN基因打靶技術(shù)操作過程繁瑣，周期長[15,20]。CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)比前兩種技術(shù)簡單，高效，一經(jīng)面世，就被廣泛應(yīng)用。本研究采用Cloning freeCRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)，簡化了基因敲除的過程，提高了試驗(yàn)效率。本文采取大片段的缺失敲除的方法，敲除結(jié)果可經(jīng)過瓊脂糖凝膠電泳中直接觀察到，方便了后續(xù)的實(shí)驗(yàn)操作。因?yàn)镕0代胚胎為嵌合體，其突變不一定能夠遺傳到下一代，利用PCR直接篩選大片段缺失的突變體，將攜帶突變的個(gè)體與野生型雜交產(chǎn)生F1代，對F1代胚胎進(jìn)行基因型鑒定，隨后純化回收、Sanger測序，確定敲除位點(diǎn)。

F1代突變體能夠穩(wěn)定遺傳，將F1代雜合子自交，經(jīng)基因型鑒定，約25%的子代為純合子，與預(yù)期結(jié)果相符合。將F1雜合子自交，觀察F2代純合突變胚胎，其外表未出現(xiàn)明顯缺陷（圖6），這說明基因敲除后不影響整體胚胎發(fā)育，但是該基因是否引起細(xì)微結(jié)構(gòu)改變、離子通道功能是否正常尚不清楚。我們接下來將建立Slc26A4基因的純合突變品系，在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步研究該基因的功能。我們將利用膜片鉗技術(shù)觀察內(nèi)耳毛細(xì)胞電流的變化；同時(shí)，我們將用轉(zhuǎn)錄組結(jié)合生物信息學(xué)分析的方法來研究內(nèi)耳毛細(xì)胞的Cl-/HCO3-交換的分子機(jī)制。

圖6 Slc26A4基因純合突變胚胎整體發(fā)育正常(50×)。a對照組；bSlc26A4基因純合突變體。結(jié)果顯示Slc26A4基因純合突變體與野生型相比，外表沒有明顯變化。Fig.6 Slc26A4 null mutant has no obvious defect(50×).a:control;b:Slc26A4 Homozygous mutant.The result showed that the Slc26A4 homozygous mutant had no obvious differ‐ence compared to the wild type.

本研究構(gòu)建了Slc26A4基因敲除斑馬魚模型，為后續(xù)的Slc26A4基因功能研究提供了良好的基礎(chǔ)。在接下來的研究中，我們將利用斑馬魚模型進(jìn)行內(nèi)耳結(jié)構(gòu)和功能的深入研究，并進(jìn)行相關(guān)基因的編輯和調(diào)控，對其上下游的因子進(jìn)行調(diào)節(jié)，以進(jìn)一步深入研究EVAS的病理機(jī)制和新的防治方案。