龍牙百合灰霉病病原菌灰葡萄孢菌的分離與鑒定

吳力紅，李潤(rùn)根，廖振軍，易 敏

（1. 株洲市淥口區(qū)農(nóng)業(yè)農(nóng)村局，湖南 株洲 412100；2. 宜春學(xué)院生命科學(xué)與資源環(huán)境學(xué)院，江西省作物生長(zhǎng)發(fā)育調(diào)控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西 宜春 336000）

龍牙百合（Lilium brownii var.viridulumBaker）是百合科百合屬多年生球根類草本植物。龍牙百合因其很高的藥用、食用和觀賞價(jià)值深受市場(chǎng)歡迎，也由此成為具備藥、食、園藝觀賞綜合功能的重要經(jīng)濟(jì)作物，其種植產(chǎn)業(yè)逐步成為全國(guó)多個(gè)地區(qū)的重要經(jīng)濟(jì)支柱[1]。全國(guó)范圍內(nèi)，江西萬載、泰和、高安，湖南隆回、安化、龍山，以及廣西永福、資源、柳州等市縣大面積推廣龍牙百合的栽培[2]，使龍牙百合成為我國(guó)三大食用百合之首[3]。在江西萬載，有近500 a種植歷史的龍牙百合逐步發(fā)展成當(dāng)?shù)刂匾奶厣?jīng)濟(jì)作物[4]。隨著栽培年限的延長(zhǎng)與栽培面積的不斷擴(kuò)大，多個(gè)地區(qū)百合病害頻發(fā)，病情也愈趨嚴(yán)重。其中，百合灰霉病的發(fā)生與危害尤為突出，重災(zāi)區(qū)可導(dǎo)致產(chǎn)量損失接近 40%[5]，市場(chǎng)上迫切需要針對(duì)百合灰霉病的有效防控策略。作為百合地上部危害最嚴(yán)重的病害之一，灰霉病的蔓延危害主要發(fā)生于每年4—6月間。田間發(fā)病癥狀為葉片枯死，花器褐腐，莖桿發(fā)黑。病害后期染病植株呈火燒狀，病株地下鱗莖提早停止生長(zhǎng)?；颐共楹Φ貐^(qū)百合產(chǎn)量驟降，產(chǎn)品品質(zhì)低劣，市場(chǎng)價(jià)值大打折扣。由此造成種植農(nóng)戶嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失，影響農(nóng)戶的種植積極性，最終制約該地區(qū)百合種植業(yè)的發(fā)展[6]。明確百合灰霉病的病原物是制定有效的防控策略、開展抗病品種選育、實(shí)施田間防治措施的必要前提，鑒于此，筆者針對(duì)江西萬載百合灰霉病危害現(xiàn)狀，開展病原物的分離、鑒定工作，研究結(jié)果將明確該地區(qū)的百合灰霉病病原菌，進(jìn)一步研究致病菌的生物學(xué)特性與防治策略提供理論基礎(chǔ)。。

1 材料與方法

1.1 材 料

龍牙百合灰霉病發(fā)病葉片于2017年4月6日采自江西省萬載縣高城鎮(zhèn)百合生產(chǎn)基地。

1.2 病原菌的分離與鑒定

1.2.1 病原菌的分離純化利用田間龍牙百合灰霉病發(fā)病葉片，采用常規(guī)組織分離法分離獲得病原菌[7]。將分離后的菌株在20 ℃、黑暗條件下培養(yǎng)5 d，挑取尖端菌絲，培養(yǎng)至產(chǎn)生分生孢子，進(jìn)行單孢純化。純化后的菌株在馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA）斜面培養(yǎng)基上預(yù)培養(yǎng)5 d后于4 ℃下保藏。

1.2.2 病原菌的形態(tài)學(xué)鑒定將純化菌株置于PDA平板培養(yǎng)基上，20℃黑暗條件下培養(yǎng)10～30 d進(jìn)行活化[8]，并觀察菌落和菌絲形態(tài)與著生情況。用10 mL/皿的無菌水配制孢子懸浮液，加入到100 mL 1%經(jīng)滅菌的蔗糖水溶液中，置于25℃、180 r/min 的搖床振蕩培養(yǎng)。培養(yǎng)8 h后顯微鏡下觀測(cè)孢子萌發(fā)形態(tài)[9]。病原菌產(chǎn)孢梗形態(tài)與孢子著生方式參照郭潤(rùn)婷[10]方法。用滅菌的脫脂棉與石英砂在20℃黑暗條件下保濕培養(yǎng)菌株150 d后，觀察菌核萌發(fā)情況。依據(jù)以上觀測(cè)結(jié)果，參照《真菌鑒定手冊(cè)》[11]對(duì)獲得的病原菌進(jìn)行初步分類鑒定。

1.2.3 病原菌的分子生物學(xué)鑒定利用植物基因組DNA提取試劑盒[天根生化科技（北京）有限公司]對(duì)菌株的DNA進(jìn)行提取。以菌株的DNA為模板，采用真菌ITS、G3PDH和HSP60基因序列的通用引物（表1）對(duì)相應(yīng)基因序列片段進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增的反應(yīng)體系（25 μL）為：DNA模板2 μL、10×Buffer（含Mg2+）2.5 μL、Taq polymerase（5 U/μL）0.2 μL，引物（10 μmol/μL）各1 μL，dNTP（10 mmol/L）0.4 μL，ddH2O 17.9 μL。反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性5 min；95℃變性1 min，55℃退火30 s，72℃延伸80 s，35個(gè)循環(huán)，72℃延伸10 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳純化后送生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行擴(kuò)增子測(cè)序。將所得序列提交至NCBI/GenBank并獲得基因登錄號(hào)。同時(shí)，用所得序列在NCBI中進(jìn)行序列比對(duì)，在比對(duì)結(jié)果中挑選代表性序列進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建[12-13]，根據(jù)目標(biāo)菌株的序列在系統(tǒng)發(fā)育樹中的分布，進(jìn)一步推斷菌株的分類地位。

表1 PCR擴(kuò)增和測(cè)序用引物

1.3 Koch’s法則鑒定致病性

依據(jù)Koch’s法則對(duì)分離的病原菌進(jìn)行致病性測(cè)定。采用健康的當(dāng)年生百合葉片進(jìn)行表面消毒后，將直接為5 mm的病原菌菌餅接種到用葉片上。接種后的葉片用無菌脫脂棉進(jìn)行恒溫保濕培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為20℃，相對(duì)濕度為80%～90%。以無菌PDA培養(yǎng)基餅塊作為空白對(duì)照，所有處理重復(fù)3次。培養(yǎng)3～5 d后觀察發(fā)病情況。同時(shí)，選取具備灰霉病發(fā)病癥狀葉片再次進(jìn)行病原菌的分離鑒定，以鑒定結(jié)果符合第一次分離鑒定結(jié)果為標(biāo)準(zhǔn)，即完成致病性測(cè)定。

2 結(jié)果與分析

2.1 病原菌分離鑒定

2.1.1 病原菌形態(tài)學(xué)鑒定將分離獲得的菌株命名為YJ-3。將病原菌在PDA培養(yǎng)基上20℃培養(yǎng)24 h后，灰白色簇狀菌絲長(zhǎng)出，并向四周輻射狀延伸。菌落呈不規(guī)則圓形（圖1A和B），7 d后長(zhǎng)滿9 cm培養(yǎng)皿。進(jìn)一步培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)菌落逐漸轉(zhuǎn)為灰褐色。顯微鏡下取樣觀測(cè)發(fā)現(xiàn)，病原菌分生孢子單生并著生于分生孢子梗末端膨大的體表面。孢子外觀呈葡萄串狀，大小為11.15（8.57～15.24）μm×8.12（5.71～10.48）μm（圖1C）。分生孢子與分生孢子梗均為灰褐色。分生孢子在糖水中易萌發(fā)，從一端或兩端長(zhǎng)出芽管，培養(yǎng)8 h后可伸長(zhǎng)至50～60 μm（圖1D）。菌絲有隔，呈現(xiàn)不規(guī)則分支狀，分支處有隘縮（圖1E）。分生孢子梗散生不集結(jié)為孢子束或分生孢子座。孢子梗分支末端膨大，彎曲（圖1F～H）。長(zhǎng)滿菌絲的菌板繼續(xù)培養(yǎng)多天后，板外圍散生大量黑色菌核。菌核形狀不規(guī)則形或球形，嵌入培養(yǎng)基中或深埋在培養(yǎng)皿的底部（圖1I）。菌核大小不一，在（1～3）mm×（2～4）mm。脫脂棉或石英砂保濕，20℃黑暗條件下培養(yǎng)150 d后，菌核萌發(fā)。萌發(fā)率分別為69.2%和88.9%（圖1J）。依據(jù)以上結(jié)果，形態(tài)學(xué)初步鑒定該病原菌為灰葡萄孢菌（Botrytis cinerea）。

圖1 YJ-3致病性及其的形態(tài)特征

2.1.2 病原菌的分子鑒定將菌株的ITS、G3PDH和HSP60序列分別在NCBI序列庫(kù)中進(jìn)行搜索匹配。上述序列分別與MK562062.1、MH479930.1和MH479931.1相似度達(dá)100%。分析結(jié)果顯示研究中的擴(kuò)展序列與灰葡萄孢菌中的相應(yīng)同源序列高度相似。選用近源種序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹（圖2）結(jié)果表明，分離菌株的ITS、G3PDH和HSP60序列基因與灰葡萄孢菌中的相應(yīng)基因序列高度同源。結(jié)合形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果，該病原菌鑒定為灰葡萄孢菌B. cinerea。

圖2 基于G3PDH-HSP60基因整合序列采用鄰接法構(gòu)建的Botrytis屬系統(tǒng)發(fā)育樹

2.3 病原菌致病性鑒定

將龍牙百合葉片接種分離菌株，2 d后葉片可見病斑，3 d后葉片開始呈水浸狀腐爛，并密生白色絮狀菌絲，5 d后病斑擴(kuò)大且密生白色絮狀菌絲（圖1K）。對(duì)照組無發(fā)病癥狀呈現(xiàn)（圖1L）。隨著接菌時(shí)間的延長(zhǎng)，葉尖呈深褐色壞死、干枯，并不斷擴(kuò)展蔓延。從發(fā)病葉片上分離的菌株在PDA培養(yǎng)基上的培養(yǎng)特性與純化菌株一致。分離物形態(tài)特征與原接種菌株一致。在無菌PDA培養(yǎng)基塊的葉片中沒有分離到相關(guān)致病菌。上述結(jié)果進(jìn)一步表明研究中分離的病原菌菌株為百合灰霉病致病菌。

3 小結(jié)與討論

通過形態(tài)學(xué)結(jié)合多基因分子生物學(xué)鑒定，明確了引起江西萬載龍牙百合灰霉病菌的病原菌為灰葡萄孢菌。該結(jié)果首次揭示了灰葡萄孢菌在龍牙百合上致病，與引起江西、江蘇南京、甘肅蘭州、廣西永福、廣東廣州和臺(tái)灣地區(qū)的百合致病菌橢圓葡萄孢B. elliptica（Berk.）Cooke[6,14-17]和天竺葵葡萄孢B. pelargonii[8]不同。該研究結(jié)果與CAO X等[18-19]和杜艷麗等[20]鑒定的鐵炮百合、蘭州百合和東方百合灰霉病病原菌相同。

灰葡萄孢是一種常見的植物致病病原菌，也是已知的葡萄孢屬中寄主范圍最廣的種， 可以侵染200種以上植物[12]。這種廣譜寄生特性使得該病原菌的清除困難，防治效果不理想。研究基于其形態(tài)和分子特征，對(duì)萬載龍牙百合灰霉病病原菌進(jìn)行了鑒定，明確了致病菌的分類歸屬。該結(jié)果為針對(duì)性制定萬載龍牙百合灰霉病的科學(xué)合理預(yù)防措施提供了重要依據(jù)。此外，江西龍牙百合種植區(qū)灰霉病發(fā)生時(shí)多伴有葉尖干枯病和黑斑病等病害的發(fā)生，栽培過程中應(yīng)結(jié)合必要的綜合防控措施。