激光誘導(dǎo)熒光結(jié)合磁分離檢測CP4-EPSPS基因

龐月紅，王逸盈，孫夢夢，沈曉芳，張 毅

（江南大學(xué)食品學(xué)院，江蘇 無錫 214122）

在過去的20 a中據(jù)統(tǒng)計全球轉(zhuǎn)基因作物的播種面積空前增長，到2018年達到1.917億 公頃，為全球大豆總種植面積的78%，約占全球轉(zhuǎn)基因作物總種植面積的50%[1]。CP4-5-烯醇丙酮酸酯-3-磷酸合酶基因（CP4-5-enolpyruvyl-shikimate-3-phosphate synthase gene，CP4-EPSPS）是從土壤農(nóng)桿菌CP4菌株中克隆的EPSPS基因，是轉(zhuǎn)基因大豆中使用最早、最普遍的抗除草劑性的轉(zhuǎn)基因[2]。轉(zhuǎn)基因大豆的檢測主要有兩類，一類是基于外源基因表達蛋白的檢測，包括分子印跡[3]、酶聯(lián)免疫[4-5]和試紙條法[6]等。這些基于蛋白質(zhì)檢測的方法耗時，有的需要用檢測蛋白的專用儀器。另一類是基于外源基因進行的基因檢測[7]。這些基因檢測方法包括聚合酶鏈式反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）結(jié)合瓊脂糖凝膠電泳[8]、real-time PCR[9-10]、表面等離振子共振[11]等。然而，這些方法儀器昂貴、操作較為復(fù)雜。因此，研究操作簡單、檢測靈敏度高、特異性強的檢測轉(zhuǎn)基因大豆分析方法十分有意義。

磁納米粒子是一種粒徑在100 nm左右的超磁性納米粒子，可以利用其磁性，快速地從復(fù)雜體系中分離出目的分子[12]。由于磁納米粒子可以結(jié)合分離生物分子并且具有增強信號的性能，在檢測中可被用于結(jié)合適配體。特別是近年來，磁納米粒子在傳感器中被廣泛應(yīng)用[13-14]。

激光誘導(dǎo)熒光（laser induced fluorescence，LIF）技術(shù)用于測定激光誘導(dǎo)的液體中熒光[15]。由于其檢出限范圍從nmol/L到pmol/L[16]，且穩(wěn)定性強，LIF已成為最靈敏的檢測方法之一。LIF已經(jīng)被廣泛應(yīng)用在結(jié)合毛細管電泳[17]、高效液相色譜[18]和微流控技術(shù)[19]等。此外，LIF檢測被用于提高分子靈敏度和選擇性[20]。本實驗建立一種LIF結(jié)合磁分離檢測CP4-EPSPS基因的方法。通過制備磁納米捕獲探針，利用DNA堿基配對的特異性和磁納米粒子的磁分離，通過高靈敏度和準確性的LIF，實現(xiàn)CP4-EPSPS基因的檢測。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

轉(zhuǎn)基因大豆干粉 美國分析化學(xué)家協(xié)會；氨基磁納米粒子（magnetic nanoparticles， MNPs）（10.0 nm）南京東納米生物公司；用于配制緩沖液的試劑以及戊二醛國藥集團化學(xué)試劑有限公司；親和素、牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）、核苷酸序列 生工生物工程（上海）股份有限公司。

從轉(zhuǎn)基因大豆中提取用于PCR擴增的DNA樣品。使用大豆CP4-EPSPS基因的寡核苷酸引物進行PCR，核苷酸序列見表1。

表1 本方法所用核苷酸序列Table 1 Sequences of oligonucleotides used in this work

1.2 儀器與設(shè)備

UV-1100紫外分光光度計 日本日立公司；F-7000熒光分光光度計 日本島津公司；XW-80A旋渦混合器上海精科實業(yè)有限公司；TriSepTM-2000 LIF檢測器上海通微有限公司；LSP02-1B注射泵 中國蘭格恒流泵有限公司；T100TMPCR儀 美國Bio-Rad公司；Nicolet 10傅里葉變換紅外光譜儀 中國賽默飛世爾科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 制備捕獲探針修飾的MNPs

首先將200.0 μL 4.0 mg/mL的MNPs溶液加入到1.6 mL含25%的戊二醛-磷酸緩沖液（pH 8.0）中，室溫下避光混合振蕩2 h，磁分離后得到戊二醛修飾的MNPs。然后加入0.5 mg/mL的親和素，室溫下避光混合振蕩6 h，沖洗3 次后得到親和素化的MNPs。將生物素化的捕獲探針（cDNA）加入上述溶液，混合振蕩孵育30 min，通過生物素-親和素系統(tǒng)固定在MNPs表面[21]。然后加入1.0 mg/mL的BSA溶液封閉未結(jié)合的位點，用磷酸鹽緩沖液磁分離清洗后，得到捕獲探針修飾的磁納米粒子（cDNA-MNPs）。

1.3.2 在線檢測方法的設(shè)計與建立

先向50.0 μL cDNA-MNPs溶液中加入50.0 μL FAM標記的信號探針（sDNA）和50.0 μL一定濃度的CP4-EPSPS目標基因（tDNA），混合液95 ℃加熱5 min后，冰浴5 min。然后將所得混合液在室溫下孵育30 min形成穩(wěn)定結(jié)構(gòu)sDNA-tDNA-MNPs，并通過注射泵以一定速度注入毛細管。毛細管下方帶有磁場，在磁場和流體動力阻力的作用下，將混合物與毛細管中未結(jié)合的雜質(zhì)分離。通過LIF檢測器，不與cDNA-MNPs雜交的FAM探針形成熒光信號平臺。當熒光信號降低到零時，即無邊界的FAM探針被完全沖洗掉。然后去除磁場，以高流速沖洗毛細管，被磁場富集的FAM-tDNA-MNPs夾心結(jié)構(gòu)快速通過LIF檢測器，出現(xiàn)一個熒光信號峰。

1.3.3 樣品中CP4-EPSPS基因的檢測

首先根據(jù)SDS方法從轉(zhuǎn)基因大豆粉中提取DNA樣品。將0%、0.5%、1.0%和10.0%的轉(zhuǎn)基因大豆DNA摻入非轉(zhuǎn)基因大豆中，并通過PCR擴增稀釋后的DNA，以獲得相應(yīng)的長片段。然后將6 μL的PCR擴增產(chǎn)物做瓊脂糖凝膠電泳，瓊脂糖為1%，電壓為5 V/cm，電泳時間為40 min。最后，將PCR產(chǎn)物用10.0 mmol/L Tris-HCl稀釋，通過在沸水浴中加熱5 min而變性，然后在冰浴中冷凍2 min，以獲得單鏈DNA溶液。將這種方法檢測CP4-EPSPS的結(jié)果與傳統(tǒng)PCR方法進行比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 LIF結(jié)合磁分離在線傳感檢測技術(shù)的構(gòu)建

構(gòu)建原理如圖1所示，首先通過戊二醛反應(yīng)使氨基MNPs表面結(jié)合上親和素，親和素化的MNPs與生物素化的捕獲探針進一步混合反應(yīng)，并用BSA溶液封閉未結(jié)合的位點[22]，得到捕獲探針修飾的MNPs（cDNAMNPs）。隨后，將得到的cDNA-MNPs溶液與信號探針和CP4-EPSPS基因溶液混合后注入毛細管，在磁場的作用下分離雜質(zhì)。當熒光信號歸零時再撤去磁場，通過LIF檢測器得到熒光信號峰，峰面積可用于CP4-EPSPS基因的檢測和定量。

圖1 LIF結(jié)合磁分離的在線傳感原理圖Fig. 1 Schematic diagram of LIF combined with magnetic separation on-line sensing detection

2.2 MNPs修飾過程的表征

為驗證cDNA是否成功地修飾到MNPs上，對每個修飾過程表征。如圖2A所示，戊二醛在233 nm波長處有較強的特征吸收峰，在280 nm波長處有較弱的特征吸收峰。MNPs本身沒有特征吸收峰，而與MNPs反應(yīng)后的戊二醛在233 nm波長處的紫外吸收峰值有所下降，280 nm波長處的紫外吸收峰值有紅移，表明戊二醛與MNPs發(fā)生席夫堿反應(yīng)，從而使MNPs活化。如圖2B所示，親和素在285 nm波長處有很強的紫外吸收峰。與MNPs反應(yīng)后，上清液中的親和素在285 nm波長處的紫外吸收峰值明顯下降，說明親和素已經(jīng)成功地共價結(jié)合到MNPs的表面。如圖2C所示，MNPs在586 cm-1和1 073 cm-1處均有吸收峰，586 cm-1處為Fe—O鍵的振動峰，1 073 cm-1為Si—O鍵的伸縮振動峰。而經(jīng)親和素修飾后除了MNPs的特征峰外，在1 642 cm-1及1 576 cm-1處出現(xiàn)新的仲酰胺特征峰，對應(yīng)為C＝O鍵的伸縮振動峰。在2 928 cm-1處為—CH2的C—H鍵伸縮振動峰，3 400 cm-1處為N—H鍵的伸縮振動峰，與—OH伸縮振動峰發(fā)生重合，且在這兩處的峰均變寬變強，表明親和素已經(jīng)成功地修飾到MNPs上。cDNA是一端修飾有生物素的捕獲基因，在260 nm波長處有紫外吸收峰，根據(jù)反應(yīng)前后原體系中的cDNA含量可以判斷cDNA是否連接到親和素化的MNPs上。如圖2D所示，cDNA結(jié)合親和素化的MNPs后在260 nm波長處的吸收峰有明顯的下降，表明已將cDNA成功裝配到親和素化的MNPs表面上，形成了cDNA-MNPs。

圖2 MNPs修飾過程表征Fig. 2 Characterization of MNPs modification

2.3 檢測方法可行性分析

制備好的cDNA-MNPs、FAM熒光標記的信號探針和CP4-EPSPS基因室溫孵育30 min。將混合液以一定的速度泵入毛細管中以沖洗雜質(zhì)，并記錄色譜圖。如圖3A所示，對照組的熒光信號圖譜，當注入混合液時出現(xiàn)熒光信號平臺，繼續(xù)沖洗除去未結(jié)合的FAM探針，熒光信號降為0。撤掉毛細管下方的磁場，使用較大的流速推動混合物通過LIF檢測器，此時無熒光信號，表明沒有夾心結(jié)構(gòu)即沒有檢測到CP4-EPSPS基因。如圖3B所示，當沖洗掉未結(jié)合的FAM探針并且熒光信號消失時，相對熒光單元（relative fluorescence unit，RFU）也具有一個平臺。除去磁場后，通過LIF檢測器有熒光信號峰出現(xiàn)，表示有CP4-EPSPS基因存在，通過計算熒光峰的面積可以得出CP4-EPSPS基因的濃度。整個過程共用時3 min，表明該方法可以快速且有效地檢測CP4-EPSPS基因。

圖3 CP4-EPSPS基因熒光信號圖譜Fig. 3 Fluorescence signal spectra of the CP4-EPSPS gene

2.4 實驗條件的優(yōu)化

MNPs質(zhì)量濃度對最終FAM-tDNA-MNPs結(jié)構(gòu)的熒光強度有影響，為實現(xiàn)準確分析，研究MNPs質(zhì)量濃度對實驗結(jié)果的影響。如圖4A所示，MNPs質(zhì)量濃度從0.1 mg/mL增加到0.3 mg/mL，熒光峰面積也隨之增加，在0.4 mg/mL時達到最大值，之后隨著質(zhì)量濃度的增加熒光峰面積下降。

通過基因探針cDNA與MNPs特異性結(jié)合，從而實現(xiàn)信號的檢測，因此基因探針cDNA濃度直接影響實驗的結(jié)果。如圖4B所示，與MNPs偶聯(lián)后，使用cDNA從樣品中捕獲CP4-EPSPS基因。增加MNPs上的cDNA負載可以增加與CP4-EPSPS基因結(jié)合的cDNA的親和力和數(shù)量，從而提高捕獲效率。熒光峰面積隨著cDNA濃度的增加而增加，在100 nmol/L時達到最高，濃度再增加，熒光峰面積降低。

圖4 實驗條件的優(yōu)化Fig. 4 Optimization of experimental conditions

本實驗用BSA作為封閉劑[22]，減少熒光素與MNPs的接觸，并且起到了分散MNPs的作用，有助于改善靈敏度和可重復(fù)性。如圖4C所示，隨著BSA質(zhì)量濃度的增加，熒光峰面積增加，并在1.0 mg/mL達到最高。BSA過剩會影響DNA雜交實驗，因此在1.0 mg/mL之后隨著質(zhì)量濃度的增高，熒光峰面積下降。綜上所述，選擇1.0 mg/mL BSA作為最佳質(zhì)量濃度。

2.5 LIF結(jié)合磁分離在線檢測

在信號探針和cDNA-MNPs存在的情況下，通過雜交反應(yīng)實現(xiàn)CP4-EPSPS基因的檢測。根據(jù)優(yōu)化條件，LIF用于檢測一系列不同濃度的CP4-EPSPS。如圖5A所示，熒光圖譜中熒光峰信號隨著CP4-EPSPS基因濃度的增加而增強。如圖5B所示，建立了熒光峰面積與CP4-EPSPS基因濃度之間的線性關(guān)系，線性方程為y=31.31lgx+69.52，R2=0.993，線性范圍為1.0×10-11～2.0×10-7mol/L，檢出限為4.0×10-12mol/L（RSN=3）。與文獻[23-29]相比（表2），本方法由于無需擴增且磁性納米粒子具有分離和富集的雙重功能，因此，具有較寬的線性范圍和較低的檢出限。

圖5 不同濃度CP4-EPSPS基因的熒光檢測Fig. 5 Fluorescence detection of CP4-EPSPS gene at different concentrations

表2 不同傳感器對轉(zhuǎn)基因片段檢測效果比較Table 2 Figures of merit of several different biosensors for detection of transgenic fragments

2.6 方法特異性的檢測結(jié)果

為了檢驗本方法的特異性，以空白試劑、CP4-EPSPS基因、2 個堿基錯配的基因序列、5 個堿基錯配的基因序列及隨機序列作為研究對象，濃度均為100 nmol/L。如圖6所示，由于錯配的基因無法有效地與探針雜交形成穩(wěn)定的雙鏈體復(fù)合物，本方法具有較高的特異性。

圖6 不同基因的熒光信號Fig. 6 Comparison of fluorescence peak areas for different genes

2.7 實際大豆樣品的檢測

研究表明，生物傳感器能進一步測定PCR擴增的轉(zhuǎn)基因大豆實際樣品[30]。運用本方法檢測轉(zhuǎn)基因大豆樣品，并與傳統(tǒng)的生物技術(shù)檢測方法PCR進行比較。首先，通過PCR，對轉(zhuǎn)基因大豆的DNA序列進行擴增，對擴增樣品進行編號。如圖7A所示，隨著轉(zhuǎn)基因大豆含量的增加，熒光峰面積明顯增加，且可以成功地將其與非轉(zhuǎn)基因大豆和空白進行區(qū)分。如圖7B所示，1、2、3號的擴增樣品在207 bp處有明顯的條帶，表明含有CP4-EPSPS基因，而在非轉(zhuǎn)基因大豆和空白對照組中沒有發(fā)現(xiàn)任何條帶。通過與傳統(tǒng)PCR方法比較，兩種方法檢測到的結(jié)果一致，且檢測在3 min內(nèi)即可完成，表明了LIF在線檢測方法實際可行。

圖7 轉(zhuǎn)基因大豆擴增產(chǎn)物檢測Fig. 7 Detection of genetically modified soybean amplification products

3 結(jié) 論

本實驗成功地建立了一種LIF結(jié)合磁分離技術(shù)用于在線檢測轉(zhuǎn)基因大豆中的CP4-EPSPS基因的方法。該方法具有高特異性、低檢出限和短檢測時間，并用于檢測轉(zhuǎn)基因大豆樣品的PCR擴增產(chǎn)物，表明該方法可用于檢測轉(zhuǎn)基因大豆中的CP4-EPSPS基因。同時，與傳統(tǒng)PCR相比，具有更低的儀器成本，更加便捷化的前景，同時材料的批量生產(chǎn)也更符合工業(yè)化和快檢技術(shù)的要求。