基于GC-MS和GC-IMS聯(lián)用法分析不同采收期廣佛手精油揮發(fā)性成分

湯 釀，劉靜宜，陳小愛(ài)，楊玉潔，陳樹(shù)喜，張子明，周愛(ài)梅,*

（1.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，廣東省功能食品活性物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510642；2.廣東展翠食品股份有限公司，廣東 潮州 515634）

佛手（Citrus medicaL. var.sarcodactylisSwingle）為蕓香科香櫞屬植物的果實(shí)，含有揮發(fā)油、黃酮、多糖以及香豆素類(lèi)等多種生理活性物質(zhì)，具有疏肝理氣、和胃止痛、燥濕化痰的功效，還具有抗炎、抗菌、抗氧化等多種藥理作用，可作為一種傳統(tǒng)的藥食兩用中藥材[1-3]。佛手精油是佛手的主要活性組分之一，現(xiàn)代藥理研究表明，佛手精油具有抗氧化、抗菌、抗炎等多種活性[4-5]，在食品、藥品及化妝品行業(yè)具有廣闊的應(yīng)用前景[2]。佛手的采摘時(shí)期會(huì)影響佛手精油的產(chǎn)率、品質(zhì)及其藥理作用[6]。因此，比較不同采收期佛手精油揮發(fā)性成分的變化，可對(duì)佛手的采收時(shí)期及佛手精油的合理開(kāi)發(fā)利用提供科學(xué)依據(jù)。

目前國(guó)內(nèi)外有關(guān)佛手精油的研究主要集中于精油的提取分離、成分分析和功能活性[7-10]。鮮見(jiàn)關(guān)于不同采收期佛手精油揮發(fā)性組分變化規(guī)律的研究。Wu Zhen等[11]應(yīng)用氣相色譜-質(zhì)譜（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）聯(lián)用技術(shù)研究了川佛手果實(shí)在成熟階段精油的產(chǎn)量和揮發(fā)性組分變化，結(jié)果表明隨著佛手成熟，精油產(chǎn)量顯著增加，萜烯類(lèi)物質(zhì)始終是精油的主要組分，單萜烴和酮類(lèi)物質(zhì)的含量增加，倍半萜烴類(lèi)和其他氧化衍生物含量減少。嚴(yán)贊開(kāi)等[12]應(yīng)用GC-MS技術(shù)研究了廣佛手成熟期間揮發(fā)油成分的變化規(guī)律，結(jié)果表明黃熟期主要為萜烯類(lèi)物質(zhì)，佛手果實(shí)在黃熟期采摘，可獲得含量豐富的檸檬烯。有關(guān)于佛手精油成分分析的研究，GC-MS是目前應(yīng)用最為普遍的方法[13-14]。

利用GC優(yōu)良的分離性和MS鑒定的高選擇性，可實(shí)現(xiàn)對(duì)待測(cè)樣品具體風(fēng)味化合物的定性和定量分析，是一種成熟的常規(guī)分析技術(shù)。該技術(shù)分離性能強(qiáng)，具有獨(dú)特、高效、快速的特點(diǎn)，但此技術(shù)無(wú)法分析鑒定出一些含量少而對(duì)風(fēng)味至關(guān)重要的物質(zhì)[15-17]。氣相色譜-離子遷移譜（gas chromatography-ion mobility spectrometry，GC-IMS）是近年來(lái)新興的一種分析方法，該技術(shù)基于離子遷移分離原理能夠高效分離化合物中的同分異構(gòu)體，具有靈敏度高、分析速度快、操作簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)，且樣品幾乎不需要任何前處理，目前已廣泛應(yīng)用于食品風(fēng)味分析、品質(zhì)檢測(cè)等多個(gè)領(lǐng)域[18-19]。由于GC-IMS技術(shù)相對(duì)于傳統(tǒng)分析技術(shù)具有諸多優(yōu)勢(shì)，其在揮發(fā)性有機(jī)化合物（volatile organic compounds，VOCs）分析中具有較大的應(yīng)用潛力[20-21]。GC-MS和GC-IMS兩種技術(shù)的結(jié)合可充分利用GC-IMS快速靈敏及信息的豐富性，以及GC-MS對(duì)于鑒定氣味物質(zhì)的獨(dú)特和高效性，能更全面且科學(xué)地對(duì)不同采收期佛手精油揮發(fā)性成分的變化進(jìn)行研究。

本實(shí)驗(yàn)以不同采收期的廣佛手為原料，利用水蒸氣蒸餾法提取廣佛手精油，進(jìn)而采用GC-MS和GC-IMS技術(shù)檢測(cè)廣佛手精油中揮發(fā)性成分的變化，獲得不同采收期廣佛手精油樣品揮發(fā)性化合物的綜合信息，并結(jié)合聚類(lèi)熱圖和主成分分析（principal component analysis，PCA）化學(xué)計(jì)量法對(duì)不同采收期廣佛手精油加以區(qū)分。2 種技術(shù)相結(jié)合更有利于探明不同采收期廣佛手精油揮發(fā)性成分的變化，為廣佛手精油品質(zhì)鑒別和其最佳采收時(shí)間的選取提供科學(xué)依據(jù)，這對(duì)于探索佛手獨(dú)特?fù)]發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的研究具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

實(shí)驗(yàn)用廣佛手樣品均產(chǎn)于廣東展翠食品股份有限公司的佛手種植基地，分別采摘于2019年6月、7月、8月、9月和10月中旬5 個(gè)時(shí)期，共采摘5 次，每隔1 個(gè)月采摘1 次。每次取2～3 株，每株取大小相近的果7～10 個(gè)，各月份采摘的廣佛手如圖1所示。

圖1 不同采收期廣佛手Fig. 1 Pictures of fingered citrons from Guangdong province harvested in different months

正己烷（色譜純） 天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；無(wú)水硫酸鈉、氯化鈉等其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

TSQ 8000 Evo三重四極桿GC-MS聯(lián)用儀（配有Xcalibur軟件） 美國(guó)Thermo公司；Flavour Spec GC-IMS聯(lián)用儀（配有分析軟件包括LAV（Laboratory Analytical Viewer）和三款插件以及GC×IMS Library Search） 德國(guó)G.A.S公司；AL104萬(wàn)分之一電子天平 梅特勒-托利多儀器有限公司；水蒸氣蒸餾簡(jiǎn)易裝置 廣州北?？茖W(xué)儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 廣佛手精油的制備

參考林敏浩等[22]的方法，采用水蒸氣蒸餾法提取精油并加以改進(jìn)。取新鮮廣佛手切片（1 cm×1 cm×1 mm），裝入揮發(fā)油提取器中按料液比1∶3（g/mL）加入蒸餾水，再加入9%氯化鈉溶液作為助劑，加熱至微沸提取4 h后用正己烷進(jìn)行萃取，經(jīng)氮吹儀除去殘余正己烷，獲得的精油經(jīng)無(wú)水硫酸鈉干燥，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次，用0.22 μm有機(jī)膜過(guò)濾精油，所得精油封裝后置于-20 ℃冰柜中備用。按下式計(jì)算精油得率：

式中：m1為精油的凈質(zhì)量/g；m2為鮮佛手的干質(zhì)量/g。

1.3.2 廣佛手水分含量測(cè)定

提取精油前測(cè)定廣佛手水分含量，根據(jù)GB 5009. 3—2010《食品中水分的測(cè)定》中第一法直接干燥法進(jìn)行測(cè)定[23]。

1.3.3 GC-MS分析條件

GC條件：TG-5 MS色譜柱（60 m×0.25 mm，0.25 μm）；載氣He（99.999%）；流量1.0 mL/min；進(jìn)樣量1.0 μL；分流比5∶1；進(jìn)樣口溫度250 ℃；程序升溫：50 ℃保持2 min，然后以10 ℃/min升溫至110 ℃，再以4 ℃/min升至190 ℃，5 ℃/min升至220 ℃，10℃/min升至260 ℃，保持5 min。

MS條件：電子電離源；電子能量70 eV；離子源溫度280 ℃；四極桿溫度150 ℃；質(zhì)量掃描范圍m/z50～550；溶劑延遲時(shí)間9 min。用NIST MS Search 2.0譜庫(kù)檢索加以確認(rèn)，各物質(zhì)相對(duì)含量采用峰面積歸一化法確定[11]。

1.3.4 GC-IMS分析條件

GC-IMS分析委托山東海能科學(xué)儀器有限公司應(yīng)用實(shí)驗(yàn)室完成。

頂空進(jìn)樣條件：頂空孵化溫度80 ℃；孵化時(shí)間10 min；孵化轉(zhuǎn)速500 r/min；進(jìn)樣體積100 μL；進(jìn)樣針溫度85 ℃。

GC條件：FS-SE-54-CB-1色譜柱（15 m×0.53 mm，1 μm）；色譜柱溫60 ℃；運(yùn)行時(shí)間40 min；載氣為高純N2（純度≥99.999%）；載氣流速：起始2.00 mL/min，保持2 min，在2～20 min線性增至20.00 mL/min，在20～30 min線性增至100.00 mL/min后保持10 min。

IMS條件：離子源為氚源（6.5 keV）；正離子模式；漂移管長(zhǎng)度9.8 cm；管內(nèi)線性電壓500 V/cm；漂移氣流速150 mL/min（高純氮?dú)?，純度?9.999%）；漂移管溫度45 ℃[24]。

1.4 數(shù)據(jù)處理

應(yīng)用軟件內(nèi)置的NISTMS Search 2.0譜庫(kù)對(duì)GC-MS檢測(cè)到的揮發(fā)性成分進(jìn)行鑒定；取相似指數(shù)大于750為有效數(shù)據(jù)，當(dāng)相似指數(shù)大于750則認(rèn)定該組分存在于樣品中；用峰面積歸一化法確定各種成分的相對(duì)含量；采用GC-IMS設(shè)備自帶儀器分析軟件，包括LAV和插件（Reporter、Galleryplot），以及GC-IMS Library Search定性分析軟件對(duì)樣品的VOCs進(jìn)行采集和分析，Dynamic PCA插件進(jìn)行動(dòng)態(tài)PCA；使用TB tools軟件繪制聚類(lèi)熱圖；使用SPSS 25.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，采用t檢驗(yàn)進(jìn)行組間差異顯著性分析，P＜0.05，差異顯著；結(jié)果以表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同采收期廣佛手精油得率比較

采用水蒸氣蒸餾法提取不同采收期廣佛手精油，所得精油得率（以干物質(zhì)計(jì)算）見(jiàn)圖2。結(jié)果顯示，不同采收時(shí)間廣佛手精油得率分別為9月（3.65±0.08）%＞10月（3.43±0.17）%＞8月（2.63±0.12）%、7月（2.62±0.12）%＞6月（1.48±0.10）%。顯然，在佛手成熟過(guò)程中伴隨著精油的積累，9月廣佛手的精油得率達(dá)到峰值，隨后精油得率下降（P＜0.05）。其原因可能是9月采摘的佛手初生代謝速度減慢，而次生代謝占主導(dǎo)，次生代謝產(chǎn)物不斷富集，達(dá)到最高值[25]。本研究佛手精油的得率（1.48%～3.65%）與Wu Zhen等[11]的研究結(jié)果（2.39%～3.57%）相近，且都表明不同采收期佛手精油的含量差異顯著。有研究表明，農(nóng)業(yè)氣候條件、收獲時(shí)間和提取分析方法等多種因素都會(huì)影響精油的產(chǎn)率和品質(zhì)[26]，9月中旬（果皮約85%黃色時(shí)）采摘廣佛手，可使佛手精油得率最大化。

圖2 廣佛手在不同采收期的精油得率Fig. 2 Yield of essential oil from fingered citrons from Guangdong province harvested at different times

2.2 基于GC-MS分析不同采收期廣佛手精油揮發(fā)性成分

2.2.1 不同采收期廣佛手精油揮發(fā)性成分變化及聚類(lèi)熱圖分析

如圖3所示，其中8月和9月樣品的峰數(shù)量顯著增多且各揮發(fā)性成分豐度值顯著增大，表明這2 個(gè)采收期可能伴有新物質(zhì)的生成且樣品中各揮發(fā)性組分濃度相對(duì)較高。如表1所示，不同采收期廣佛手精油樣品中共檢測(cè)出54 種VOCs，其C鏈均在C9～C21以?xún)?nèi)，包括萜烯類(lèi)、醇類(lèi)、醛類(lèi)、酯類(lèi)、酚類(lèi)和烷烴類(lèi)6 類(lèi)化合物。其中6—10月精油樣品中分別鑒定出19、17、38、41 種和26 種VOCs，分別占總檢出成分的92.68%、97.36%、98.59%、97.79%和98.90%。隨著佛手的成熟，精油樣品中的各類(lèi)揮發(fā)性成分種類(lèi)和含量發(fā)生明顯變化，且有些物質(zhì)僅出現(xiàn)在特定的采收期樣品中。

圖3 不同采收期廣佛手精油成分的總離子流圖Fig. 3 Total ion current chromatograph of essential oil of fingered citrons from Guangdong province harvested at different times

萜烯類(lèi)是佛手精油中含量最高且種類(lèi)最多的一類(lèi)化合物，5 個(gè)廣佛手精油樣品中共檢測(cè)到25 種萜烯類(lèi)物質(zhì)，相對(duì)含量變化范圍為79.48%～97.21%，且多為單萜烯類(lèi)化合物，其中D-檸檬烯（35.29%～51.42%）、γ-松油烯（25.91%～34.31%）、α-蒎烯（1.55%～3.20%）、β-蒎烯（1.22%～2.91%）為主要成分。隨著廣佛手的成熟，精油樣品中萜烯類(lèi)物質(zhì)的種類(lèi)呈先升后降的變化趨勢(shì)，而其總相對(duì)含量呈現(xiàn)升-降-升的變化趨勢(shì)，且在10月達(dá)到峰值。佛手中萜烯類(lèi)化合物具有檸檬香、木香、柑橘香和藥草香等香味，其中α-蒎烯、β-蒎烯、D-檸檬烯、γ-松油烯、β-石竹烯、松油烯、水芹烯、月桂烯、α-側(cè)柏烯、(S)-β-沒(méi)藥烯是對(duì)佛手香氣貢獻(xiàn)較大的香氣物質(zhì)[14,27]。

5 個(gè)采收期廣佛手精油樣品中醇類(lèi)物質(zhì)相對(duì)含量分別為1.28%、1.32%、6.68%、3.35%、0.91%，且在8月達(dá)到最大值，其中α-松油醇（1.69%）和香葉醇（3.93%）占該時(shí)期醇類(lèi)總量的84.13%。醇類(lèi)化合物種類(lèi)呈先升后降的變化趨勢(shì)，在8月樣品中達(dá)到最多。佛手中醇類(lèi)大多具有不同的果香、花香、木香等香氣，其中α-松油醇具有柑橘、紫丁香花香、木香，香葉醇具有玫瑰花香、果香，橙花醇具有柑橘、木蘭香氣，對(duì)佛手香氣具有一定貢獻(xiàn)[14]。

5 個(gè)采收期廣佛手精油中醛類(lèi)物質(zhì)相對(duì)含量分別為4.88%、3.40%、9.23%、2.24%、0.13%，其相對(duì)含量和種類(lèi)呈先升后降的變化趨勢(shì)，與醇類(lèi)物質(zhì)變化趨勢(shì)一致。醛類(lèi)物質(zhì)含量在8月樣品中最高，橙花醛（3.74%）和檸檬醛（4.50%）占該時(shí)期醛類(lèi)總量的89.27%。佛手中醛類(lèi)大多具有不同的果香、花香、青香等香氣，其中橙花醛具有柑橘甜、似檸檬皮，檸檬醛具有明顯的檸檬香甜感，對(duì)佛手香氣具有一定貢獻(xiàn)[14]。

表1GC-MS鑒定不同采收期廣佛手精油的VOCsTable 1 Identification of volatile organic compounds in essential oil of fingered citrons from Guangdong province harvested at different times by GC-MS

酯類(lèi)物質(zhì)僅在8、9月廣佛手精油樣品中檢出，相對(duì)含量極微，分別為0.31%和0.48%。烷烴類(lèi)和酚類(lèi)物質(zhì)主要在8月和9月樣品中檢出，且相對(duì)含量分別為2.89%和3.14%。其中對(duì)傘花烴具有新鮮的柑橘氣息和木香[14]，乙酸橙花酯具有玫瑰花香、果香，主要用以配制生梨、蘋(píng)果、檸檬、柑橘類(lèi)等水果型香精，乙酸香葉酯因具有香味而被廣泛用于化妝品行業(yè)[28]。香芹酚具有柑橘香，為目前應(yīng)用最為廣泛的重要香料之一[29]。結(jié)果表明，含量較少的一些VOCs也有可能是佛手精油的主要賦香成分。

為直觀觀察不同采收期廣佛手精油之間的差異，使用TB tool軟件進(jìn)行熱圖聚類(lèi)分析。以鑒定出的54 種VOCs的相對(duì)含量作為變量，在row-scale基礎(chǔ)上對(duì)每個(gè)變量進(jìn)行Z-score標(biāo)準(zhǔn)化，得到不同采收期廣佛手精油的熱圖（圖4）。從圖4可以看出，5 個(gè)采收期廣佛手精油可聚為3 類(lèi)，6、7月聚為一類(lèi)，8、9月聚為一類(lèi)，10月另為一類(lèi)。結(jié)合表1和圖4可看出，6、7月廣佛手精油樣品中的萜烯類(lèi)、醇類(lèi)、醛類(lèi)和酯類(lèi)化合物種類(lèi)較少，而D-檸檬烯、松油烯和水芹烯等幾類(lèi)物質(zhì)含量較高。8、9月廣佛手精油樣品中醇類(lèi)、醛類(lèi)、酯類(lèi)、酚類(lèi)和烷烴類(lèi)化合物種類(lèi)較多且相對(duì)含量較高。10月采收的廣佛手精油樣品與其他樣品間差異較大，主要為單萜烯類(lèi)物質(zhì)（96.05%），倍半萜烯類(lèi)、醇類(lèi)、醛類(lèi)和酯類(lèi)等物質(zhì)含量極少。

圖4 不同采收期廣佛手精油的揮發(fā)性化合物含量變化的聚類(lèi)分析熱圖Fig. 4 Heat map of cluster analysis showing the change of volatile compounds in essential oil of fingered citrons from Guangdong province harvested at different times

GC-MS結(jié)果表明，5 個(gè)采收期廣佛手精油中的主要成分是萜烯類(lèi)化合物（79.48%～97.21%），而醇類(lèi)、醛類(lèi)、酯類(lèi)、酚類(lèi)及烷烴化合物含量較少。隨著佛手的成熟，精油中的萜烯類(lèi)物質(zhì)含量呈現(xiàn)升-降-升的變化趨勢(shì)，在10月增至最大值，醇、醛類(lèi)物質(zhì)的含量在8月達(dá)到峰值，而酯類(lèi)、烷烴和酚類(lèi)物質(zhì)主要存在于8、9月精油樣品中。熱圖聚類(lèi)可將5 個(gè)采收期精油區(qū)分為3 類(lèi)，使其特征性物質(zhì)可視化。由于佛手精油的化學(xué)組成復(fù)雜，且其結(jié)果易受客觀的提取方法、所應(yīng)用的佛手品種和栽培地點(diǎn)等多種因素的影響，因此本研究結(jié)果與Wu Zhen[11]和嚴(yán)贊開(kāi)[12]等的研究結(jié)果存在一定差異。

2.2.2 不同采收期廣佛手精油共有VOCs的變化

不同采收期廣佛手精油中鑒定出15 個(gè)共有峰（84.59%～95.03%），分別為水芹烯、α-蒎烯、月桂烯、β-蒎烯、松油烯、D-檸檬烯、羅勒烯、γ-松油烯、β-石竹烯、大牛兒烯D、(S)-β-沒(méi)藥烯、4-萜烯醇、α-松油醇、香葉醇、對(duì)傘花烴。進(jìn)一步分析比較15 個(gè)共有VOCs的動(dòng)態(tài)變化趨勢(shì)，見(jiàn)圖5。如圖5A所示，D-檸檬烯相對(duì)含量隨廣佛手的成熟呈先降后升的變化趨勢(shì)，在8月降至最低值35.29%，10月增加至峰值51.42%。γ-松油烯相對(duì)含量呈升-降-升的變化趨勢(shì)，在7月達(dá)到峰值34.31%。2 種主要成分總含量在10月可達(dá)最高82.56%。如圖5B所示，α-蒎烯、β-蒎烯、月桂烯、β-石竹烯、(S)-β-沒(méi)藥烯、對(duì)傘花烴相對(duì)含量均在9月達(dá)到峰值，這一現(xiàn)象與佛手精油含量變化趨勢(shì)一致。如圖5C所示，4-萜烯醇、α-松油醇、香葉醇和大牛兒烯D相對(duì)含量在8月達(dá)到峰值，與醇類(lèi)物質(zhì)總的變化趨勢(shì)一致。如圖5D所示，水芹烯、松油烯相對(duì)含量在7月達(dá)峰值，此后隨廣佛手成熟度的增加而減少，羅勒烯在整個(gè)成熟階段，含量一直呈升高的趨勢(shì)，在10月采收期達(dá)到峰值。在廣佛手成熟期間，D-檸檬烯和γ-松油烯總含量在8月和9月采收期較低，10月升至最高點(diǎn)。而α-蒎烯、β-蒎烯、月桂烯、香葉醇、α-松油醇等含量在8、9月達(dá)到峰值，達(dá)到峰值后其總含量呈下降趨勢(shì)，呈現(xiàn)出與D-檸檬烯和γ-松油烯相反的變化趨勢(shì)，這表明精油中的上述共有揮發(fā)性成分在廣佛手成熟過(guò)程中的代謝變化可能同時(shí)受某一因子的調(diào)節(jié)，并且D-檸檬烯的生物合成可能與α-松油醇和香葉醇的合成存在底物競(jìng)爭(zhēng)的關(guān)系[33]。在15 種共有成分中，D-檸檬烯具有明顯檸檬特征果香和青香味，γ-松油烯、α-蒎烯、β-蒎烯具有強(qiáng)烈萜類(lèi)物質(zhì)特征的木青氣息、花香和藥草香氣，是佛手精油的主要香氣成分[14]，且總含量在10月精油中達(dá)到最大值89.03%，為廣佛手精油應(yīng)用于香精香料行業(yè)確定了最佳采收時(shí)間。

圖5 不同采收期廣佛手揮發(fā)油樣品中15 個(gè)共有化合物相對(duì)含量Fig. 5 Changes in relative contents of 15 components in essential oil of fingered citrons from Guangdong province with harvest time

2.3 基于GC-IMS分析不同采收期廣佛手精油揮發(fā)性成分

2.3.1 不同采收期廣佛手精油揮發(fā)性組分變化規(guī)律分析

如圖6所示，橫坐標(biāo)1.0處紅色豎線為反應(yīng)離子峰（經(jīng)歸一化處理），反應(yīng)離子峰右側(cè)的每一個(gè)點(diǎn)代表一種揮發(fā)性化合物，顏色代表物質(zhì)的濃度，白色表示濃度較低，紅色表示濃度較高，顏色越深表示濃度越大。從圖6可以看出，不同采收期廣佛手精油樣品內(nèi)VOCs可通過(guò)GC-IMS很好地分離。圖6紅框區(qū)域的VOCs在6月樣品中含量最高，隨著佛手的成熟，其含量逐漸降低。圖6黃框區(qū)域的VOCs在6、7月2 個(gè)樣品中較相似，而在其他月樣品中差異明顯。圖6表明不同采收期廣佛手精油VOCs的差異主要表現(xiàn)在離子峰的位置、數(shù)量、強(qiáng)度及時(shí)間上。

圖6 不同采收期廣佛手精油的GC-IMS二維譜圖Fig. 6 Two-dimensional GC-IMS spectra of essential oil in fingered citrons from Guangdong province harvested at different times

在5 個(gè)采收期廣佛手精油樣品中共計(jì)檢測(cè)出71 種揮發(fā)性組分，根據(jù)目前現(xiàn)有的軟件內(nèi)置NIST 2014氣相保留指數(shù)數(shù)據(jù)庫(kù)與G.A.S.的IMS遷移時(shí)間數(shù)據(jù)庫(kù)資料進(jìn)行二維定性，定性檢出61 種VOCs（表2）。61 種VOCs的C鏈均在C2～C10以?xún)?nèi)，主要包括萜烯類(lèi)14 種、醇類(lèi)13 種、醛類(lèi)12 種、酯類(lèi)8 種、酮類(lèi)5 種、酸類(lèi)4 種、呋喃類(lèi)3 種、硫醚類(lèi)1 種、吡嗪類(lèi)1 種。5 個(gè)樣品中富含檸檬烯、γ-松油烯、羅勒烯、α-蒎烯、水芹烯和芳樟醇等常見(jiàn)香味成分，賦予了佛手精油較強(qiáng)烈木青氣息和似檸檬的柑橘氣息[14]。其中，L-薄荷醇、反式-2-己烯-1-醇、庚醛、呋喃甲醛、異戊醛、肉桂酸乙酯、苯乙酸乙酯、乙酸丙酯、甲基庚烯酮、丙酮、2,3-丁二酮、辛酸、2-乙基呋喃、2-乙?；秽?、2-甲基吡嗪等VOCs，目前在佛手精油的揮發(fā)性成分研究中鮮有報(bào)道。

表2GC-IMS鑒定廣佛手精油的VOCsTable 2 Yolatile organic compounds identified in essential oil of fingered citrons from Guangdong province by GC-IMS

為進(jìn)一步比較不同采收期廣佛手精油VOCs的差異，采用G.A.S.公司開(kāi)發(fā)的LAV軟件的GalleryPlot插件，選取圖中待分析區(qū)域自動(dòng)生成指紋圖譜。橫軸為VOCs，縱軸為6—10月5 個(gè)采收期的廣佛手精油樣品。由圖7可知，隨著廣佛手成熟度的提高，佛手精油中一部分VOCs逐漸減少，甚至消失，而另有一部分VOCs不斷增多，甚至從無(wú)到有，說(shuō)明精油中揮發(fā)性組分會(huì)隨采收時(shí)間發(fā)生顯著變化。圖7中A區(qū)域?yàn)? 個(gè)采收期的共有VOCs，主要為萜烯類(lèi)和醇類(lèi)物質(zhì)，其中γ-松油烯、羅勒烯、檸檬烯（單體和二聚體）、α-蒎烯、水芹烯、芳樟醇和α-松油醇等在5 個(gè)采收期樣品中含量都較高。B區(qū)域VOCs主要為酯類(lèi)和醛類(lèi)物質(zhì)，包括肉桂酸乙酯、戊酸乙酯、異戊酸乙酯、乙酸異丁酯、呋喃甲醛、庚醛、苯甲醛和壬醛等。從B區(qū)域可看出，酯類(lèi)和醛類(lèi)物質(zhì)主要存在于6、7月和8月樣品中。C區(qū)域VOCs有：2,3-丁二酮、2-庚酮、正己醇、反式-2-己烯-1-醇、2-甲基-1-丁醇。從C區(qū)域可看出，這幾種物質(zhì)主要存在于9、10月樣品中。D區(qū)域VOCs主要為醇類(lèi)、酸類(lèi)和呋喃類(lèi)等物質(zhì)，包括正丁醇、乙醇、辛酸、丁酸、醋酸、2-乙基呋喃、2-甲基吡嗪等。從D區(qū)域可看出，這些物質(zhì)主要存在于6、7月和8月樣品中。E區(qū)域VOCs未進(jìn)行定性，1～10號(hào)未知化合物在6、7月和8月采收期濃度較高。

圖7 不同采收期廣佛手精油的VOCs指紋圖譜Fig. 7 Fingerprints of volatile organic compounds in essential oil of fingered citrons from Guangdong province harvested at different times

由圖7結(jié)合表2可知，隨著廣佛手的成熟，萜烯類(lèi)化合物始終是廣佛手精油的主要組成部分，酮類(lèi)化合物濃度逐漸增大，酸類(lèi)化合物含量逐漸減少，醛類(lèi)和酯類(lèi)化合物特征峰在9月采收期開(kāi)始消減，部分醇類(lèi)物質(zhì)逐漸累積，另有一部分醇類(lèi)物質(zhì)逐漸消減，在6、7、8月精油樣品中各類(lèi)揮發(fā)性組分更為豐富。該結(jié)果與GC-MS結(jié)果呈現(xiàn)一定差異性，原因是GC-MS技術(shù)檢測(cè)出的多為大分子且含量較高的揮發(fā)性成分，而GC-IMS檢測(cè)出的大部分為小分子且含量低的揮發(fā)性成分，且IMS對(duì)高電負(fù)性或高質(zhì)子親和力官能團(tuán)結(jié)構(gòu)的物質(zhì)具有高靈敏度，如氨基、巰基、鹵素基團(tuán)以及含不飽和鍵結(jié)構(gòu)的醛、酮、醚等有機(jī)化合物和芳香族化合物[35]。而目前關(guān)于佛手精油成分的研究，大部分都是采用GC-MS進(jìn)行檢測(cè)分析，且很少有檢測(cè)到酮類(lèi)、酸類(lèi)、呋喃類(lèi)等化合物，是由于這類(lèi)物質(zhì)分子質(zhì)量小且含量極微，難以被檢測(cè)到[10-11]，而本研究表明GC-IMS能夠很好地彌補(bǔ)GC-MS在檢測(cè)中存在的缺陷，擴(kuò)大樣品中揮發(fā)性成分檢測(cè)范圍，在揮發(fā)性成分的分析中具有較大的應(yīng)用潛力。

2.3.2 不同采收期廣佛手精油VOCs的 PCA

PCA通過(guò)對(duì)以VOCs種類(lèi)為變量的高維數(shù)組進(jìn)行維度壓縮，以幾個(gè)互相無(wú)關(guān)的PC因子表示原始樣本中許多復(fù)雜的變量，然后根據(jù)PC因子在不同樣本中的貢獻(xiàn)率評(píng)價(jià)樣本之間的規(guī)律性和差異性[36]。本研究以所選取的特征峰對(duì)應(yīng)的峰強(qiáng)度值為特征參數(shù)變量，得到圖8，不同點(diǎn)代表不同采收期廣佛手精油樣品的歸類(lèi)情況。如圖8所示，PC1貢獻(xiàn)率為56%，PC2貢獻(xiàn)率為20%，PC1與PC2的貢獻(xiàn)率之和為76%，數(shù)據(jù)降維后所得綜合變量在二維空間能較好地代表原始數(shù)據(jù)所反映的信息。通過(guò)二維空間的數(shù)據(jù)分布差異可以直觀地觀察到組間和組內(nèi)樣品間的差異性，組內(nèi)各樣品相對(duì)距離較近或重疊，說(shuō)明不同采收期精油樣品的重復(fù)性較好，不同樣品各組數(shù)據(jù)的成簇區(qū)域有明顯的間距，說(shuō)明不同采收期精油樣品間的特異性較明顯，樣品間VOCs差異較大。6、7月和9月樣品的主要差異在PC1，7月和8月樣品的主要差異在PC2，各樣品的組間距離明顯，9月和10月樣品在PC1和PC2上都表現(xiàn)出一定的差異，能較好區(qū)分。上述結(jié)果表明，GC-IMS可針對(duì)不同采收期的佛手精油進(jìn)行快速分類(lèi)鑒別，可用于監(jiān)測(cè)佛手精油品質(zhì)。

圖8 不同采收期廣佛手精油PCAFig. 8 PCA plot for volatile organic compounds in essential oil of fingered citrons from Guangdong province harvested at different times

3 結(jié) 論

9月中旬（果皮約85%黃色時(shí)）采摘廣佛手，可使精油提取率最大化。利用GC-MS和GC-IMS技術(shù)的互補(bǔ)優(yōu)勢(shì)對(duì)不同采收期廣佛手精油揮發(fā)性成分進(jìn)行分析，2 種技術(shù)的分析結(jié)果存在差異。GC-MS檢測(cè)出的大多是大分子（C9～C21）高含量揮發(fā)性組分，GC-IMS檢測(cè)出的主要是小分子（C2～C10）低含量揮發(fā)性成分，此2 種技術(shù)相結(jié)合能彌補(bǔ)各自的局限，并擴(kuò)大樣品中揮發(fā)性成分檢測(cè)范圍，更加全面地反映樣品中揮發(fā)性組分的變化情況。根據(jù)2 種技術(shù)的結(jié)果得出5 個(gè)采收期廣佛手精油揮發(fā)性組分主要為萜烯類(lèi)物質(zhì)，其次為醇類(lèi)、醛類(lèi)和酯類(lèi)物質(zhì)。隨著廣佛手的成熟，精油中萜烯類(lèi)物質(zhì)含量在10月達(dá)最大值，酮類(lèi)化合物逐漸增多，酸類(lèi)化合物逐漸減少，醇類(lèi)物質(zhì)在成熟過(guò)程中伴隨著累積和消減，低分子質(zhì)量醛類(lèi)、酯類(lèi)物質(zhì)主要存在于6、7、8月樣品中。GC-IMS能更好地對(duì)不同采收期佛手精油進(jìn)行區(qū)分。本研究為廣佛手精油品質(zhì)鑒別和其最佳采收時(shí)間的選取提供了科學(xué)依據(jù)。