鹽酸克倫特羅檢測(cè)方法的建立及應(yīng)用

李志娟，李洪政＊，付 坤，閻永斌，王永生

（1.河南國(guó)康檢測(cè)技術(shù)有限公司，河南 鄭州 450003；2.河南中德檢測(cè)技術(shù)有限公司；3.河南農(nóng)業(yè)大學(xué)禽病研究所）

鹽酸克倫特羅（clenbuterol，CLB），俗稱“瘦肉精”，是一類β-腎上腺素受體激動(dòng)劑化學(xué)物質(zhì)的總稱，該物質(zhì)為白色或類白色的結(jié)晶體粉末，味苦，熔點(diǎn)為161℃，溶于水、乙醇，微溶于丙酮，不溶于乙醚。當(dāng)瘦肉精進(jìn)入機(jī)體后，導(dǎo)致心血管系統(tǒng)和神經(jīng)系統(tǒng)運(yùn)行出現(xiàn)障礙，引起多種心血管和神經(jīng)系統(tǒng)疾病。動(dòng)物源性食品中瘦肉精是我國(guó)明令禁止的違禁藥品。因此，需要加強(qiáng)動(dòng)物性食品中的瘦肉精的檢測(cè)，及時(shí)發(fā)現(xiàn)不合格的肉及肉制品，保障食品安全，對(duì)鹽酸克倫特羅的有效檢測(cè)和監(jiān)控刻不容緩。

目前對(duì)鹽酸克倫特羅的檢測(cè)方法有感官檢驗(yàn)法、酸堿度法、酶聯(lián)免疫法（ELISA）、膠體金快速檢測(cè)卡（DIGFA）、毛細(xì)管電泳法（EC）、高效液相法（HPLC）、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（LC-MS）、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法（GC-MS）、金磁納米粒子高靈敏定量（MGNPs）、中空纖維膜三相液相微萃取法（HF-LLLME）、光聲光譜法（PS）、液相芯片技術(shù)（LC-chip）等方法，其中朱小艾等采用高效液相色譜法對(duì)鹽酸克倫特羅的前處理和上機(jī)條件進(jìn)行優(yōu)化，但與液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（LC-MS）相比，液質(zhì)方法耗時(shí)更短，定量更準(zhǔn)確。俞慧紅采用GC-MS的檢測(cè)方法，但其前處理過(guò)程需要通過(guò)提取-反萃取-凈化-柱后衍生的方式進(jìn)行，耗時(shí)較長(zhǎng)。（原）農(nóng)業(yè)部1025號(hào)公告-18-2008《動(dòng)物源性食品中β-受體激動(dòng)劑殘留檢測(cè) 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法》采用了液質(zhì)的方法，但其前處理過(guò)程采用酶解較為復(fù)雜。故該研究擬在前人研究的基礎(chǔ)上，對(duì)樣品的前處理過(guò)程和上機(jī)條件進(jìn)行優(yōu)化，旨在為鹽酸克倫特羅的檢測(cè)提供一種簡(jiǎn)便、快速、準(zhǔn)確的定量方法。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 豬肉、牛肉、羊肉 均采購(gòu)自菜市場(chǎng)。

1.1.2 鹽酸克倫特羅標(biāo)準(zhǔn)品 純度大于98.0%，德國(guó)Dr.EhrenstorferGmbH公司。

1.1.3 乙酸乙酯、氨水、碳酸鈉 分析純，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司。

1.1.4 甲醇、甲酸、乙腈 色譜純，sigma。

1.2 主要儀器與設(shè)備

1.2.1 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀（配電噴霧離子源） 美國(guó)Waters公司W(wǎng)aters TQD。

1.2.2 反向色譜柱 美國(guó)WatersUPLCTMBEHC18

（2.1NN 100mm，1.7μm）。

1.2.3 電子天平 BSA2202S-CW，感量0.01g，賽多利斯。

1.2.4 分析天平 BT125D，感量0.00001g，賽多利斯。

1.2.5 氮吹儀 WD1000，杭州瑞誠(chéng)儀器有限公司。

1.2.6 固相萃取裝置 ASE-12/16/24，天津奧特賽恩斯儀器有限公司。

1.2.7 高速冷凍離心機(jī) 熱電ThermoST8ST8R，Thermo Fisher。

1.2.8 恒溫振蕩水浴搖床 MKY-SPH-110X12，麥科儀（北京）科技有限公司。

1.2.9 渦旋混合器 88882010，ThermoFisher。

1.3 方法

1.3.1 試劑的配制

5%氨化甲醇溶液：量取5mL氨水，加甲醇稀釋至100 mL，搖勻即得；0.1%甲酸溶液：量取水100mL，加入0.1mL甲酸，混勻；乙腈-0.1%甲酸溶液（5＋95，V/V）：量取乙腈5mL，加入0.1%甲酸溶液95mL，混勻；10%碳酸鈉水溶液：稱量10g碳酸鈉，溶于100mL水中，混勻；標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液：稱取鹽酸克倫特羅約10.0mg，置于100mL量瓶?jī)?nèi)，用甲醇溶解并稀釋成濃度為100μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，-20℃冰箱中保存，有效期6個(gè)月?；旌蠘?biāo)準(zhǔn)中間工作液：準(zhǔn)確量取鹽酸克倫特羅標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液置100mL量瓶中，用甲醇稀釋成濃度為20ng/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)中間工作液。-20℃冰箱中保存，有效期6個(gè)月。

1.3.2 試樣的制備與保存

取適量新鮮的空白樣品和采購(gòu)的10份豬肉、牛肉、羊肉肌肉部分，分別混勻，-20℃以下貯存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3 質(zhì)量控制樣品的制備

空白樣品：取空白試樣，與待測(cè)試樣同步處理。添加樣品：取空白試樣2i0.02g，添加20ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)中間工作液100μL，制得濃度為1μg/kg的陽(yáng)性添加試樣，與待測(cè)試樣同步處理。

1.3.4 提取

準(zhǔn)確稱取2i0.02g供試樣品于50mL離心管內(nèi)，加入10%碳酸鈉水溶液5mL。加10mL乙酸乙酯提取，渦旋震蕩10min，8000r/min離心10min，重復(fù)提取一次，合并兩次上清液。向合并的上清液中加入0.1mol/L鹽酸溶液5mL，渦旋混勻，震蕩10min，5000r/min離心5min，重復(fù)提取一次，合并兩次水相，備用。

1.3.5 凈化

混合型陽(yáng)離子交換固相萃取柱依次用甲醇、一級(jí)水各3mL活化；取全部備用液過(guò)柱；再依次用一級(jí)水、甲醇各3 mL淋洗，減壓抽干；用5%氨水甲醇溶液3mL洗脫，洗脫液在50℃下用氮?dú)獯蹈?，殘余物用乙?0.1%甲酸溶液（5＋95，V/V）1.0mL溶解，渦旋混勻，取上清液過(guò)濾，供超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀測(cè)定。

1.3.6 系列標(biāo)準(zhǔn)工作液的制備

準(zhǔn)確量取鹽酸克倫特羅標(biāo)準(zhǔn)溶液，用乙腈-0.1%甲酸溶液（5＋95，V/V）稀釋成濃度分別為5ng/mL、10ng/mL、20ng/mL、50ng/mL、80ng/mL的系列標(biāo)準(zhǔn)工作液。

取空白試樣2i0.02g于不同離心管中，按1.3.4、1.3.5步驟操作，制得濃度為0.5ng/mL、1.0ng/mL、2.0ng/mL、5.0ng/mL、8.0ng/mL、10.0ng/mL、20.0ng/mL的對(duì)照溶液。

1.4 儀器參數(shù)與測(cè)定

1.4.1 色譜條件優(yōu)化

色譜柱：WatersUPLCTMBEHC18（2.1NN 100mm，1.7μm）；柱溫：40℃；流動(dòng)相：A-乙腈；B-0.1%甲酸溶液，梯度洗脫，進(jìn)樣量：10μL。

1.4.2 質(zhì)譜條件

離子源類型：ESI＋；毛細(xì)管電壓：3.0KV；萃取補(bǔ)償電壓：70V；源溫：150℃；霧化溫度：450℃；錐孔氣流速：150L/hr；霧化氣流速：1000L/hr。

1.5 精密度試驗(yàn)

該研究選取多種空白樣品進(jìn)行添加回收率和精密度試驗(yàn)，選取了3種基質(zhì)豬肉、牛肉、羊肉，按1.3.4和1.3.5步驟操作，添加水平分別為0.5μg/kg、1.0μg/kg、5.0μg/kg，按該文方法進(jìn)行前處理和測(cè)定，平行測(cè)定6次。

1.6 方法應(yīng)用

隨機(jī)抽檢動(dòng)物源性食品10份，采用該文建立的方法測(cè)定其中鹽酸克倫特羅的含量，并采用（原）農(nóng)業(yè)部1025號(hào)公告-18-2008進(jìn)行復(fù)測(cè)，進(jìn)行結(jié)果比對(duì)。

2 結(jié)果與分析

2.1 前處理優(yōu)化結(jié)果

該研究采用3種前處理方法處理樣品，每種方法優(yōu)缺點(diǎn)，見(jiàn)表1。

表1 3種樣品前處理方法的比較

2.2 色譜條件優(yōu)化結(jié)果

試樣開始采用乙腈-水作為流動(dòng)相，發(fā)現(xiàn)響應(yīng)值較低，在水相中加入0.1%甲酸，可促進(jìn)其離子化，響應(yīng)值增高，于是采用0.1%甲酸溶液-乙腈作為流動(dòng)相。

2.3 標(biāo)曲溶液稀釋液的確定

取陰性空白樣，按1.3.4、1.3.5步驟操作，配置一系列基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液，同時(shí)用乙腈-0.1%甲酸溶液（5＋95，V/V）配置相同濃度的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，上機(jī)測(cè)定，用上述兩套標(biāo)曲處理同一個(gè)加標(biāo)濃度結(jié)果顯示，基質(zhì)標(biāo)曲溶液處理出來(lái)的結(jié)果是乙腈-0.1%甲酸溶液配置的標(biāo)曲處理的105%，說(shuō)明經(jīng)前處理，凈化程度較高，基質(zhì)效應(yīng)影響較小。在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中，可直接采用乙腈-0.1%甲酸溶液配置標(biāo)曲溶液。

2.4 線性關(guān)系、檢出限和定量限結(jié)果

該研究采用乙腈-0.1%甲酸配置質(zhì)量濃度0.5～20 ng/mL的鹽酸克倫特羅標(biāo)準(zhǔn)溶液，按優(yōu)化后的液相質(zhì)譜條件進(jìn)行測(cè)定，線性關(guān)系良好，線性方程y=429.858x-53.1756（R2=0.999178），采用標(biāo)準(zhǔn)添加法，以信噪比S/N≥10確定定量限（LOQ）為0.5μg/kg，逐級(jí)稀釋，以信噪比S/N≥3確定方法檢出限0.25μg/kg，依據(jù)動(dòng)物源食品克倫特羅限量標(biāo)準(zhǔn)禁止檢出，所以定量限滿足要求。其線性回歸方程見(jiàn)圖1。

圖1 鹽酸克倫特羅標(biāo)準(zhǔn)曲線線性關(guān)系

2.5 添加回收率和精密度試驗(yàn)結(jié)果

三種基質(zhì)中，鹽酸克倫特羅的平均回收率80.2%～96.7%，相對(duì)偏差（RSD）為0.78～3.1，說(shuō)明優(yōu)化的前處理方法所得結(jié)果的回收率和精密度滿足實(shí)驗(yàn)要求，符合定量分析，其回收率和精密度結(jié)果詳見(jiàn)表2。

表2 鹽酸克倫特羅的加標(biāo)回收率和精密度（n=6）

2.6 方法應(yīng)用結(jié)果

對(duì)購(gòu)買的10份動(dòng)物源性食品，采用該文建立的方法與（原）農(nóng)業(yè)部1025號(hào)公告-18-2008方法同時(shí)測(cè)定其中鹽酸克倫特羅的含量，均為陰性。

3 結(jié)論與討論

該研究建立了一種專門用于動(dòng)物源性食品中鹽酸克侖特羅含量的高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測(cè)方法，該研究與朱小艾等所建立的方法比較，液質(zhì)比液相定量更為準(zhǔn)確；與（原）農(nóng)業(yè)部1025號(hào)公告-18-2008《動(dòng)物源性食品中β-受體激動(dòng)劑殘留檢測(cè)液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法》相比較，對(duì)樣品的前處理方法進(jìn)行優(yōu)化，不需要酶解過(guò)程，前處理時(shí)間由22h減少為1h，大大縮短前處理時(shí)間且提高了加標(biāo)回收率，回收率高達(dá)80.2%～96.7%。

該研究采用乙腈-0.1%甲酸配置質(zhì)量濃度0.5～20 ng/mL的鹽酸克倫特羅標(biāo)準(zhǔn)溶液，按優(yōu)化后的液相質(zhì)譜條件進(jìn)行測(cè)定，線性關(guān)系良好，線性方程y=429.858x-53.1756（R2=0.999178），本研究還表明，鹽酸克倫特羅的平均回收率為80.2%～96.7%，相對(duì)偏差（RSD）為0.78～3.1，說(shuō)明優(yōu)化的前處理方法所得結(jié)果的回收率和精密度滿足實(shí)驗(yàn)要求，符合定量分析。

通過(guò)對(duì)市場(chǎng)上采購(gòu)的10份動(dòng)物源性食品羊肉、牛肉、豬肉樣品應(yīng)用該研究所建立的方法進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果與（原）農(nóng)業(yè)部1025號(hào)公告-18-2008《動(dòng)物源性食品中β-受體激動(dòng)劑殘留檢測(cè) 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法》一致，表明所采購(gòu)的樣品均為陰性樣品，不含有鹽酸克倫特羅成分。

各種結(jié)果表明，該研究所建立的方法具有快速、簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確的特點(diǎn)，適用于樣品數(shù)量較大時(shí)的快速定量檢測(cè)，為食品安全監(jiān)管部門提供了一個(gè)快速且準(zhǔn)確的定量檢測(cè)方法。□