miR-26a/PTEN在糖尿病小鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)變性中的作用及其機制△

石蕊 楊雨雯 付子蔚 劉丹丹 陳卓 張雪梅

糖尿病視網(wǎng)膜病變(DR)是糖尿病重要的微血管并發(fā)癥之一，也是世界范圍內(nèi)嚴重危害工作人群視覺健康的常見眼底病之一，最終可導致視力不可逆性喪失[1]。近年來研究發(fā)現(xiàn)，以視網(wǎng)膜神經(jīng)膠質(zhì)細胞激活和視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞(RGC)凋亡為主要特征的糖尿病視網(wǎng)膜神經(jīng)變性(DRN)可能是DR最早期的結(jié)構(gòu)改變，其發(fā)生早于臨床可見的微血管并發(fā)癥，并通過影響視網(wǎng)膜“神經(jīng)血管單位”的功能而促進視網(wǎng)膜微血管病變的進展[2-3]。因此，探討DRN發(fā)生的分子機制及相關(guān)信號通路，尋找可用于DR早期治療的新靶點是研究的重要方向之一。

MicroRNA(miRNA)是一類非編碼小分子，可通過調(diào)控其靶基因的表達而參與多種生物學進程，在DR的發(fā)生過程中發(fā)揮著重要的調(diào)控作用，但其與DRN的關(guān)系并不明確。miR-26a-5p(miR-26a)是重要的抑癌因子，可通過調(diào)控其靶基因PTEN的翻譯和表達，發(fā)揮誘導細胞分化和促進細胞凋亡的作用[4]，并參與了多種神經(jīng)退行性變的發(fā)生過程[5]。我們前期研究通過高通量測序技術(shù)發(fā)現(xiàn)早期DR患者外周血中miR-26a水平顯著降低[6]。本研究在前期研究的基礎(chǔ)上，通過小鼠腹腔注射鏈脲佐菌素(STZ)誘導糖尿病動物模型，觀察視網(wǎng)膜組織中miR-26a及其靶基因PTEN的表達變化，通過檢測膠質(zhì)細胞原纖維酸性蛋白(GFAP)水平明確視網(wǎng)膜膠質(zhì)細胞活化的程度，并通過玻璃體內(nèi)注射miR-26a mimic上調(diào)miR-26a的水平，檢測視網(wǎng)膜組織中PTEN及GFAP的變化情況，以評價miR-26a/PTEN在DRN發(fā)生機制中作用，為臨床尋找新的治療靶點提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物8～9周齡雄性C57BL/6J小鼠66只，體重18～22 g，購自西安交通大學醫(yī)學部動物中心。實驗動物給予充足的水和食物，實驗室溫度維持在(24±1)℃，相對濕度60%，環(huán)境為12 h光照/12 h黑暗。在建立動物模型之前，小鼠在以上環(huán)境中適應(yīng)飼養(yǎng)至少7 d。所有小鼠實驗操作均符合美國國立衛(wèi)生研究院(NIH)和西安交通大學關(guān)于實驗動物的使用規(guī)則，并盡最大努力減少實驗動物的痛苦。

1.2 主要儀器及設(shè)備STZ(福州邁新生物技術(shù)開發(fā)公司)，熒光顯微鏡(Olympus公司，日本)，血糖儀[One Touch，Ultra Vue，強生(中國) 醫(yī)療器材有限公司]，RM2125石蠟切片機(北京昊諾斯科技有限公司)， PTEN、GFAP抗體(Abcam公司，美國)，HRP標記羊抗兔IgG(Abbkine公司，美國)，PCR引物及miR-26a mimic(上海康成生物有限公司)。透射電子顯微鏡(Hitachi,H-7650,日本),超薄切片制刀機(Leica,706602,德國)。

1.3 糖尿病小鼠動物模型制備及分組66只小鼠隨機分為實驗組(n=44) 和對照組(n=22)。所有動物禁食12 h后，實驗組小鼠每天尾靜脈注射STZ(溶解于0.1 mol·L-1枸櫞酸鈉溶液，pH=4.5)65 mg·kg-1，連續(xù)5 d;對照組小鼠尾靜脈注射等量的枸櫞酸鈉溶液。72 h后用One Touch II型血糖儀通過尾靜脈采血測量兩組小鼠血糖濃度，隨機血糖濃度>16.7 mol·L-1者視為糖尿病小鼠。成模后每周測量實驗小鼠的體重及血糖濃度,同時記錄飲食、飲水量、精神狀態(tài)等變化情況。成模2周后，實驗組小鼠隨機分為糖尿病組和miR-26a 組，每組22只，miR-26a 組小鼠從第3周起，雙眼玻璃體內(nèi)注射miR-26a mimic 1.5 μL，連續(xù)3 d,糖尿病組小鼠注射等體積非靶向mimic作為空白對照。此后3組小鼠均正常喂養(yǎng)，觀察2周。

1.4 小鼠玻璃體內(nèi)注射miR-26a mimic方法miR-26a mimic玻璃體內(nèi)注射在眼科手術(shù)顯微鏡下完成；小鼠術(shù)前雙眼給予表面麻醉及散瞳后固定在手術(shù)顯微鏡下，調(diào)整視野，用5 μL微量注射器于顳上象限角膜緣后1.5 mm處進針，將1.5 μL miR-26a mimic注入miR-26a 組小鼠玻璃體內(nèi)。術(shù)畢滴左氧氟沙星眼液,每天4次，預防感染。

1.5 標本取材玻璃體內(nèi)注射2周后，3組小鼠全部用100 g·L-1水合氯醛按3.5 mg·g-1腹腔注射全身麻醉，立即摘除眼球，每組隨機選3只(6眼)小鼠角膜,中央穿刺一小口浸泡于40 g·L-1多聚甲醛固定30 min后充分水洗，沿角膜緣環(huán)形剪開眼球，去除眼前節(jié)、玻璃體，將含視網(wǎng)膜的眼杯浸泡于40 g·L-1多聚甲醛中再次固定，用于HE染色(每組3眼)和免疫熒光染色(每組3眼)。每組另取2只小鼠摘除雙眼眼球行透射電鏡檢查以觀察RGC超微結(jié)構(gòu)。15只(30眼)小鼠眼球在顯微鏡下嚴格無Rnase的低溫環(huán)境下去掉眼前節(jié)、去除玻璃體，用虹膜恢復器剝出視網(wǎng)膜，并將視網(wǎng)膜在PBS 液中漂洗，清除殘存的玻璃體，3只眼球的視網(wǎng)膜為一個檢測樣本，放入Eppendorf管中，共收集10個樣本，存于-80 ℃低溫冰箱里備用。

1.6 各組小鼠視網(wǎng)膜HE染色、RGC計數(shù)及視網(wǎng)膜厚度測量每組取3只眼球，固定24 h 、脫水3 h，透明15 min，于 60 ℃石蠟浸蠟6 h，包埋，進行HE染色。做與視神經(jīng)矢狀軸平行的視網(wǎng)膜連續(xù)切片，脫蠟、水化后，蘇木素-伊紅染液染色，脫水透明、封片，顯微鏡下觀察并拍照。

采用Luan[6]的方法測量糖尿病小鼠視網(wǎng)膜厚度。采用隨機抽樣法：對每只眼球的所有組織切片利用隨機數(shù)字表法進行抽樣，將切片盒中的所有切片編號，每隔5張抽取1張作為觀察對象。在光學顯微鏡下觀察確定好的切片，利用隨機數(shù)字表法確定首個視野所在的位置，抽取5個待測視野。在目標視野中，用鏡臺測微尺(精確度為0.01 μm)對視網(wǎng)膜總厚度及內(nèi)核層(INL)、外核層(ONL)厚度進行測量，SPOT-Basic軟件分析系統(tǒng)測量厚度，取平均值作為一次厚度測量值。

RGC計數(shù)的具體方法:在光學顯微鏡下對視網(wǎng)膜HE染色的切片顳側(cè)鋸齒緣計數(shù)到鼻側(cè)鋸齒緣，測定隨機5個獨立高倍視野中的RGC數(shù)。

1.7 透射電鏡觀察各組小鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)組織超微結(jié)構(gòu)每組4只眼球，沿角膜緣環(huán)形剪開眼球，去除角膜、晶狀體、玻璃體，將含視網(wǎng)膜的眼杯浸泡于40 g·L-1多聚甲醛中再次固定2 h，PBS沖洗15 s×3次，10 g·L-1四氧化鋨4 ℃固定2 h，PBS沖洗3次，梯度乙醇、丙醇逐級脫水，環(huán)氧樹脂EPON618浸透包埋，制作厚1 μm超薄切片，美藍染色后光學顯微鏡下定位，繼續(xù)超薄切片機切片，厚度為50～60 nm，30 g·L-1醋酸鈾-枸櫞酸鉛雙染色后，透射電鏡下觀察并拍片。

1.8 免疫熒光染色觀察各組小鼠視網(wǎng)膜中PTEN和GFAP的表達每組取3只眼球，進行包埋切片行免疫熒光染色，隨機選取10張切片脫蠟、抗原修復、封閉后甩掉血清，滴加一抗(1400)，4 ℃ 孵育過夜，PBS洗滌3次，每次5 min；滴加FITC標記的山羊抗小鼠IgG二抗(11000)37 ℃孵育30 min；DAPI 室溫孵育10 min；PBS洗滌3次，每次5 min，封片劑封片，熒光顯微鏡下觀察并照相，利用ImageJ軟件測量PTEN和GFAP表達的熒光強度。

1.9 qRT-PCR檢測各組小鼠視網(wǎng)膜中miR-26a、PTEN和GFAP的mRNA表達每組30只眼球，分離視網(wǎng)膜組織放入1 mL Trizol中，勻漿后振蕩混勻，37 ℃靜置5 min，加200 μL氯仿，劇烈振蕩，室溫靜置5 min，12 000 r·min-14 ℃離心5 min，取上清，加入異丙醇，-20 ℃保存30 min，繼續(xù)12 000 r·min-14 ℃離心15 min；棄上清，加入1 mL預冷的體積分數(shù)75%乙醇，離心，棄乙醇；室溫干燥，沉淀至透明，加入DEPC；使用NanoDrop?ND-1000測定RNA濃度和純度，所有RNA樣品符合樣品純度要求，D260/D280為1.80～2.10。

用Primescript反轉(zhuǎn)錄試劑盒(TAKARA公司)進行反轉(zhuǎn)錄，合成cDNA。使用Primer5.0軟件設(shè)計引物序列(見表 1)，管家基因GAPDH為內(nèi)參，反應(yīng)體系為25 μL：Master Mix 12 μL，P1(10 μmol·L-1上游引物)1 μL，P2(10 μmol·L-1下游引物)1 μL，cDNA 模板1 μL，雙蒸水10 μL。反應(yīng)條件：預變性95 ℃、10 min；95 ℃、10 s；60 ℃、60 s(收集熒光)，72 ℃、40 s，共40個循環(huán)。

表1 各基因的引物序列

2 結(jié)果

2.1 糖尿病動物模型評價STZ誘導糖尿病動物模型成功后2周，對照組小鼠每日正常飲水、飲食，尿量適中，活動正常；實驗組小鼠成模后開始出現(xiàn)多尿、多飲、多食，體重下降，毛色枯黃。實驗組44只小鼠，其中2只因故死亡，對照組1只死亡。治療2周時，糖尿病組1只死亡，miR-26a組1只眼內(nèi)感染后剔除分析，故最終統(tǒng)計的小鼠對照組21只(42眼)，糖尿病組20只(40眼)，miR-26a組20只(40眼)。與對照組相比，造模后2周實驗組(糖尿病組和miR-26a組)小鼠血糖濃度均有不同程度升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)(見表2)。提示糖尿病小鼠模型可滿足實驗需要。

表2 對照組和實驗組小鼠造模前后體重和血糖濃度

2.2 早期視網(wǎng)膜神經(jīng)細胞形態(tài)學評估m(xù)iR-26a mimic玻璃體內(nèi)注射2周時，HE染色結(jié)果顯示：對照組小鼠視網(wǎng)膜各層細胞排列規(guī)則有序，結(jié)構(gòu)清晰；糖尿病組小鼠視網(wǎng)膜全層厚度較正常對照組變薄，神經(jīng)節(jié)細胞層(GCL)、INL、ONL細胞排列紊亂、疏松，RGC數(shù)量減少(P<0.05)；miR-26a組小鼠視網(wǎng)膜各層厚度較糖尿病組增加，RGC數(shù)量較對照組減少，但多于糖尿病組，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)(見圖1和表3)。

表3 各組小鼠視網(wǎng)膜各層厚度及RGC計數(shù)比較

圖1 各組小鼠視網(wǎng)膜HE染色結(jié)果(×400)

2.3 透射電鏡觀察糖尿病小鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)細胞超微結(jié)構(gòu)變化miR-26a mimic玻璃體內(nèi)注射2周時，透射電鏡下觀察發(fā)現(xiàn)：對照組小鼠可見雙極細胞，細胞核多圓形，核內(nèi)常染色質(zhì)豐富，核仁可見；糖尿病組小鼠雙極細胞的細胞核形狀不規(guī)則，細胞核內(nèi)染色質(zhì)稀疏，細胞質(zhì)內(nèi)結(jié)構(gòu)空曠，細胞器減少；miR-26a 組小鼠雙極細胞結(jié)構(gòu)較糖尿病組明顯改善(見圖2)。

圖2 各組小鼠視網(wǎng)膜電鏡下超微結(jié)構(gòu)(×4000)

2.4 小鼠視網(wǎng)膜組織免疫熒光染色結(jié)果

2.4.1 各組小鼠視網(wǎng)膜組織中GFAP的表達miR-26a mimic玻璃體內(nèi)注射2周時，糖尿病組及miR-26a 組小鼠GFAP免疫熒光染色結(jié)果顯示，GFAP在視網(wǎng)膜全層均有表達(圖3)。ImageJ計算熒光強度結(jié)果提示，對照組小鼠GFAP的熒光強度為7.35±2.44，糖尿病組免疫熒光明顯增強，熒光強度為13.37±1.38，miR-26a組GFAP熒光強度較糖尿病組明顯減弱，為11.84±1.47，差異均有統(tǒng)計學意義(均為P<0.05)。

圖3 各組小鼠視網(wǎng)膜GFAP免疫熒光染色結(jié)果(×400)

2.4.2 各組小鼠視網(wǎng)膜組織中PTEN的表達糖尿病組小鼠視網(wǎng)膜內(nèi)層組織均有PTEN表達，主要位于GCL和INL，PTEN著紅色，DAPI 著色藍色顯示細胞核，紅色和藍色染色重合，提示PTEN在視網(wǎng)膜GCL及INL均有表達(圖4)。糖尿病組小鼠視網(wǎng)膜PTEN熒光強度(14.77±1.26)較對照組(5.73±0.33)明顯增強(P<0.05)，miR-26a 組小鼠視網(wǎng)膜熒光強度(10.44±1.05)較糖尿病組明顯降低(P<0.05)。

圖4 各組小鼠視網(wǎng)膜PTEN免疫熒光染色結(jié)果

2.5 各組小鼠視網(wǎng)膜中miR-26a、PTEN及GFAP的mRNA表達miR-26a mimic玻璃體內(nèi)注射2周時，qRT-PCR檢測結(jié)果顯示：糖尿病組小鼠視網(wǎng)膜miR-26a mRNA水平較對照組明顯降低(P<0.05)，而GFAP及PTEN mRNA的表達均明顯升高(均為P<0.05)；miR-26a組小鼠視網(wǎng)膜miR-26a mRNA水平較糖尿病組升高，GFAP及PTEN的mRNA表達均顯著下降，差異均有統(tǒng)計學意義(均為P<0.05)(見表3)。

表3 各組小鼠視網(wǎng)膜組織中miR-26a、GFAP及PTEN的mRNA表達

3 討論

DR是全球范圍內(nèi)影響工作人群視覺健康的重要疾病之一，其發(fā)病隱匿，病理機制復雜，早期缺乏有效控制手段，晚期治療棘手且費用高，最終可導致視力不可逆性喪失，給患者及其家庭帶來巨大的經(jīng)濟負擔和精神壓力。因此，不斷探討DR的發(fā)病機制并尋找有效的早期防治手段是臨床治療的當務(wù)之急。

關(guān)于DR發(fā)生機制的研究認為，長期的慢性血糖濃度升高所導致的視網(wǎng)膜微循環(huán)障礙是DR發(fā)病的主要病理基礎(chǔ)[7]。近年來，更多的研究認為，DR微血管病變并不能完全解釋周圍神經(jīng)易感性和早期部分視網(wǎng)膜功能喪失，高血糖同時還可導致視網(wǎng)膜神經(jīng)元的凋亡、RGC丟失、神經(jīng)膠質(zhì)細胞的活化、神經(jīng)微絲異常以及視神經(jīng)逆向軸漿運輸?shù)臏p慢[8]，且我們前期通過臨床觀察發(fā)現(xiàn)，視網(wǎng)膜神經(jīng)纖維層厚度變薄可早于可見的微血管病變[9]，這一系列改變均提示DRN可能是DR的重要結(jié)構(gòu)改變，并且此病變貫穿于DR發(fā)病的始終，病變晚期可導致視網(wǎng)膜內(nèi)層神經(jīng)元的進一步丟失，最終導致視網(wǎng)膜全層變薄、光感受器細胞凋亡和視力不可逆性喪失。DR可能是一個更復雜的神經(jīng)血管性疾病的理論被越來越多的研究者所接受[10]。因此，探討DRN的具體機制，尋找新的治療靶點是DR研究的新方向。

microRNA是一類長約22 nt的內(nèi)源性單鏈RNA,可通過降解或抑制其靶編碼蛋白質(zhì)的翻譯,從而沉默特定靶基因發(fā)揮一系列生物學作用，已成為各種疾病發(fā)生機制及靶向新型藥物開發(fā)的研究熱點之一。目前已有多種miRNA被發(fā)現(xiàn)與糖尿病及其并發(fā)癥顯著相關(guān)。miR-26a是一種高度保守的miRNA，其廣泛存在于眼內(nèi)組織中；研究發(fā)現(xiàn)，其在高糖環(huán)境下視網(wǎng)膜色素上皮細胞中低表達[11]，且與血管內(nèi)皮細胞的損傷顯著相關(guān)，但其與視網(wǎng)膜神經(jīng)細胞的關(guān)系并不明確。PTEN是miR-26a的重要靶基因之一，是一種與腫瘤發(fā)生密切相關(guān)的抑癌基因。研究發(fā)現(xiàn)，miR-26a可通過靶向調(diào)控PTEN的作用，參與低氧環(huán)境下炎癥反應(yīng)及氧化應(yīng)激的一系列病理生理過程[12]，在腫瘤、脂肪代謝及糖尿病等疾病的發(fā)病過程發(fā)揮著重要作用[13-14]。在細胞代謝方面，miR-26a可能通過影響PTEN蛋白的合成激活PI3K/AKT信號通路的表達，進而促進上皮細胞增殖和基質(zhì)細胞的凋亡[15]。高糖導致的視網(wǎng)膜神經(jīng)元的凋亡丟失是DRN的主要發(fā)病機制，但miR-26a/PTEN在視網(wǎng)膜神經(jīng)細胞損傷及DRN發(fā)病過程中的作用并不清楚。

我們前期通過高通量測序的方法確認miR-26a在早期DR且伴有不同程度DRN的患者外周血中顯著低表達，且miR-26a的水平與視網(wǎng)膜神經(jīng)纖維層厚度顯著相關(guān)，提示miR-26a可能參與了早期DRN的過程。本研究在前期研究的基礎(chǔ)上，通過建立糖尿病動物模型，并向小鼠玻璃體內(nèi)注射miR-26a mimic上調(diào)眼內(nèi)組織中miR-26a的水平，以觀察其靶基因PTEN及膠質(zhì)細胞激活標記物GFAP的表達情況，以進一步評估m(xù)iR-26a及PTEN在DRN中的作用。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，糖尿病小鼠早期可出現(xiàn)視網(wǎng)膜神經(jīng)上皮層明顯變薄，RGC丟失，INL和ONL排列紊亂，提示DRN模型制作成功。雙極細胞是視網(wǎng)膜重要的二級神經(jīng)元，其連接著視網(wǎng)膜感光細胞與RGC，是視覺通路的重要組成部分。視網(wǎng)膜超微結(jié)構(gòu)觀察發(fā)現(xiàn)，糖尿病小鼠視網(wǎng)膜雙極細胞結(jié)構(gòu)破壞明顯，提示高糖導致的視網(wǎng)膜神經(jīng)細胞損傷已經(jīng)發(fā)生。進一步行qRT-PCR檢測發(fā)現(xiàn)，糖尿病組小鼠視網(wǎng)膜組織中miR-26a mRNA表達較對照組降低，這與我們前期的研究結(jié)果一致，而其靶基因PTEN及膠質(zhì)細胞活化標記物GFAP mRNA表達均明顯升高，再次提示視網(wǎng)膜神經(jīng)元的損傷，而玻璃體內(nèi)注射miR-26a mimic后發(fā)現(xiàn)，視網(wǎng)膜組織形態(tài)及神經(jīng)細胞損傷明顯改善，miR-26a組小鼠視網(wǎng)膜組織中miR-26a mRNA表達升高，提示干預有效，其靶基因PTEN mRNA表達較糖尿病組明顯降低。

綜上，本研究結(jié)果提示：miR-26a/PTEN與糖尿病小鼠DRN密切相關(guān)，但其具體的相關(guān)通路及機制還需要進一步的細胞實驗進行驗證。本研究首次驗證了miR-26a/PTEN與DRN的關(guān)系，為臨床尋找新的治療靶點提供了一定的理論基礎(chǔ)。