骨形態(tài)發(fā)生蛋白-6對(duì)轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β2所致視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞遷移的影響△

吉夢(mèng) 劉明 馬波 劉軒 裴澄 陳麗

增生性玻璃體視網(wǎng)膜病變(PVR)是各種細(xì)胞在視網(wǎng)膜前、后表面及玻璃體內(nèi)增生蔓延形成纖維細(xì)胞膜，繼而引起視網(wǎng)膜的收縮、牽拉，進(jìn)一步導(dǎo)致?tīng)坷曰驈?fù)發(fā)性視網(wǎng)膜脫離(RD)的復(fù)雜眼科疾病[1]。其中視網(wǎng)膜色素上皮 (RPE)在玻璃體內(nèi)生長(zhǎng)因子和細(xì)胞因子的作用下，發(fā)生上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)和細(xì)胞外基質(zhì) (ECM )合成是PVR形成的關(guān)鍵環(huán)節(jié)[2-3]。由于PVR 的最終預(yù)后極差，對(duì)其早期防治是目前研究的主旨，而藥物干預(yù)更是近年來(lái)研究的熱點(diǎn)。藥物防治PVR一直都受到廣泛的關(guān)注，主要集中在抗炎、抗增殖、抑制EMT、拮抗細(xì)胞因子、信號(hào)通路抑制劑等，大多局限在基礎(chǔ)研究階段，且目前臨床試驗(yàn)暫未發(fā)現(xiàn)有藥物能夠有效防治PVR。

轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β2(TGF-β2)在PVR患者的視網(wǎng)膜前膜中異常高表達(dá)，并被標(biāo)記為EMT的誘導(dǎo)因子，目前已作為RPE細(xì)胞纖維化模型的主要誘導(dǎo)因子[4]。我們課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMP)-6可以減輕氧化應(yīng)激損傷[5]。氧化應(yīng)激可以導(dǎo)致RPE細(xì)胞的損傷，也可以加劇TGF-β2所致的RPE細(xì)胞纖維化[6]。所以本研究擬在既往研究的基礎(chǔ)上，運(yùn)用siRNA干擾BMP-6的表達(dá)，構(gòu)建BMP-6過(guò)表達(dá)質(zhì)粒，進(jìn)一步從正反兩方面觀察BMP-6對(duì) RPE細(xì)胞遷移的影響，為PVR的防治提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器RPE細(xì)胞株(美國(guó)ATCC公司)，DMEM培養(yǎng)基/F12 、胎牛血清(FBS) (Gibco公司，美國(guó))，BMP-6(NM_001718)克隆質(zhì)粒(優(yōu)寶生物，重慶)，TGF-β2 (PeproTech公司,美國(guó))，兔多克隆抗體GAPDH(杭州賢至生物科技有限公司)，兔多克隆抗體BMP-6(Affinity公司,美國(guó))，HRP標(biāo)記的羊抗兔二抗(武漢博士德生物工程有限公司)，恒溫培養(yǎng)箱(MCO-15AC,三洋生物有限公司，北京)，Transwell小室(8 μm，美國(guó)康寧)，倒置顯微鏡[IX51，奧林巴斯(中國(guó))有限公司]，PCR儀(EDC-810,東勝創(chuàng)新生物有限公司，北京)。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)及分組生長(zhǎng)狀態(tài)良好的RPE細(xì)胞使用常規(guī)DMEM/F12培養(yǎng)基(含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清、0.1 U·L-1青霉素和鏈霉素)在37 ℃、含體積分?jǐn)?shù)5%CO2飽和濕度條件下培養(yǎng)，次日貼壁生長(zhǎng)后更換為無(wú)血清培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h。取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞消化，無(wú)血清培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，用無(wú)血清培養(yǎng)基稀釋細(xì)胞濃度至5×105個(gè)·mL-1備用。細(xì)胞分組：(1)對(duì)照組：加入正常培養(yǎng)基培養(yǎng)48 h；(2)TGF-β2組：培養(yǎng)基中加入5 μg·L-1TGF-β2培養(yǎng)48 h；(3)BMP-6 siRNA組：轉(zhuǎn)染BMP-6-homo-1087后培養(yǎng)48 h；(4)BMP-6過(guò)表達(dá)組：轉(zhuǎn)染BMP-6過(guò)表達(dá)質(zhì)粒后培養(yǎng)48 h；(5)TGF-β2+BMP-6過(guò)表達(dá)組：轉(zhuǎn)染BMP-6過(guò)表達(dá)質(zhì)粒24 h后，加入5 μg·L-1TGF-β2繼續(xù)培養(yǎng)48 h。

1.2.2 BMP-6 siRNA的構(gòu)建及篩選取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的RPE細(xì)胞用培養(yǎng)基制成單細(xì)胞懸液，按每孔5×105個(gè)細(xì)胞均勻接種到6孔板中，37 ℃、含體積分?jǐn)?shù)5%CO2飽和濕度條件下培養(yǎng)至60%密度，換成無(wú)血清相應(yīng)培養(yǎng)基饑餓2 h后分別轉(zhuǎn)染小片段BMP-6-homo-1087、BMP-6-homo-1634、BMP-6-homo-885(基因序列見(jiàn)表1)，同時(shí)設(shè)置對(duì)照組，培養(yǎng)48 h后，RT-PCR 檢測(cè)BMP-6 mRNA 的表達(dá)水平，具體為：Trizol法提取所有轉(zhuǎn)染基因組和對(duì)照組細(xì)胞的RNA，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，反應(yīng)條件：50 ℃ 2 min，95 ℃ 10 min；95 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，40 個(gè)循環(huán)。最終數(shù)據(jù)以2-△△Ct進(jìn)行分析。引物序列：BMP-6上游引物為5’-CTTACGACAAGCAGCCCTTC-3’，下游引物為5’- ATCTGAAGCACTGGAGACCC-3’；GAPDH上游引物為5’-TCAAGAAGGTGGTGAAGCAGG-3’，下游引物為5’- TCAAAGGTGGAGGAGTGGGT-3’。選取抑制效果最好的片段用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

表1 BMP-6 siRNA的基因序列

1.2.3 BMP-6過(guò)表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定質(zhì)粒pIRES2-ZsGreen1和目的片段homo BMP-6(BamHI/Xho1)用BamHI和Xho1進(jìn)行雙酶切，凝膠回收純化，將回收純化的目的片段homo BMP-6(BamHI/Xho1)與回收純化的載體pIRES2-ZsGreen1(BamHI/Xho1)連接，連接產(chǎn)物命名為pIRES2-ZsGreen1-homo BMP-6。鑒定引物為測(cè)序的通用引物，上游引物在CMV區(qū)，距離MCS區(qū)74 bp，下游引物在IRES區(qū)，距離MCS區(qū)101 bp，目的序列1542 bp， PCR產(chǎn)物大小約1700 bp。引物及序列：CMV-F:5’-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3’； IRES-R:3’-CCTCACATTGCCAAAAGACG-5’。鑒定合格后，大規(guī)模提取質(zhì)粒pIRES2-ZsGreen1-homo BMP-6，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.4 Transwell 遷移實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞的遷移無(wú)血清培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，用無(wú)血清培養(yǎng)基稀釋細(xì)胞濃度至5×105個(gè)·mL-1備用；600 μL完全培養(yǎng)基加入下室，在Transwell小室上室分別加入200 μL上述無(wú)血清細(xì)胞懸液，分組處理后，于37 ℃、含體積分?jǐn)?shù)5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h；取出Transwell小室，PBS小心清洗小室一遍，體積分?jǐn)?shù)70%冰乙醇溶液固定細(xì)胞1 h；用5 g·L-1結(jié)晶紫染液染色，室溫下放置20 min，PBS清洗，用干凈的棉球?qū)⑸鲜乙粋?cè)的未遷移的細(xì)胞擦干凈，顯微鏡下觀察拍照。

1.2.5 Western blot 測(cè)定蛋白的表達(dá)對(duì)照組和5 μg·L-1TGF-β2組RPE細(xì)胞培養(yǎng)48 h后,RIPA細(xì)胞裂解液裂解各組RPE 細(xì)胞后，于4 ℃、12 000 r·min-1離心 15 min,收集上清液。 BCA定量試劑盒檢測(cè)蛋白濃度,取20 μg蛋白樣品,在聚丙烯酰胺凝膠中電泳,將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，50 g·L-1脫脂奶粉于室溫下封閉1 h,以相應(yīng)一抗BMP-6于4 ℃孵育過(guò)夜,并進(jìn)行化學(xué)發(fā)光。采用ImageJ 軟件檢測(cè)條帶灰度值，以GAPDH為內(nèi)參，分別計(jì)算各目的蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

2 結(jié)果

2.1 RT-PCR檢測(cè)驗(yàn)證BMP-6 siRNA 轉(zhuǎn)染 RPE細(xì)胞后BMP-6 mRNA的水平變化RT-PCR 檢測(cè)不同小片段BMP-6 siRNA 轉(zhuǎn)染 RPE 細(xì)胞后BMP-6 mRNA 的表達(dá)情況，結(jié)果顯示，對(duì)照組RPE細(xì)胞中BMP-6 mRNA的表達(dá)水平為1.00±0.00，轉(zhuǎn)染BMP-6-homo-1087、BMP-6-homo-1634、BMP-6-homo-885后，RPE細(xì)胞中BMP-6 mRNA相對(duì)表達(dá)水平均顯著降低，分別為0.29±0.03、0.73±0.13和0.59±0.06，與對(duì)照組相比差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P<0.05),且轉(zhuǎn)染BMP-6-homo-1087后對(duì)BMP-6 mRNA表達(dá)的抑制率最高，所以選擇BMP-6-homo-1087用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.2 TGF-β2對(duì)RPE細(xì)胞遷移的影響顯微鏡下可以看到，對(duì)照組RPE細(xì)胞呈多角形，生長(zhǎng)比較規(guī)則，TGF-β2組RPE細(xì)胞形態(tài)發(fā)生改變，呈現(xiàn)典型的紡錘形變化(圖1A、圖1B)。

Transwell法檢測(cè)細(xì)胞遷移結(jié)果顯示，對(duì)照組遷移細(xì)胞數(shù)為(63.67±4.04)個(gè)，TGF-β2組遷移細(xì)胞數(shù)明顯增多，為(122.00±5.57)個(gè)，兩組遷移細(xì)胞數(shù)相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=14.69，P=0.000)(圖1C、圖1D)。

圖1 TGF-β2對(duì)RPE細(xì)胞形態(tài)及遷移能力的影響 A：顯微鏡下觀察對(duì)照組RPE細(xì)胞形態(tài)(×100)；B：顯微鏡下觀察TGF-β2組RPE細(xì)胞形態(tài)(×100)；C：Transwell 法檢測(cè)對(duì)照組細(xì)胞遷移情況(×200)；D：Transwell 法檢測(cè)TGF-β2組細(xì)胞遷移情況(×200)。

2.3 TGF-β2對(duì)BMP-6蛋白表達(dá)的影響Western blot檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖2。對(duì)照組RPE細(xì)胞BMP-6的蛋白表達(dá)水平為0.70±0.08，TGF-β2組BMP-6蛋白表達(dá)水平顯著降低，為0.41±0.13，兩組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=3.249，P=0.031)。由此可見(jiàn)，TGF-β2作用后RPE細(xì)胞中BMP-6蛋白表達(dá)水平明顯下降。

圖2 Western blot檢測(cè)TGF-β2對(duì)RPE細(xì)胞BMP-6蛋白表達(dá)的影響

2.4 BMP-6 siRNA作用后對(duì)RPE細(xì)胞遷移的影響對(duì)照組RPE細(xì)胞形態(tài)正常，而經(jīng)過(guò) BMP-6 siRNA作用后RPE細(xì)胞形態(tài)發(fā)生改變，亦呈現(xiàn)典型的紡錘形變化(圖3A、圖3B)，與TGF-β2作用后變化相似。

Transwell法檢測(cè)細(xì)胞遷移結(jié)果顯示，對(duì)照組遷移細(xì)胞數(shù)為(57.00±7.00)個(gè)，而B(niǎo)MP-6 siRNA組遷移細(xì)胞數(shù)明顯增加，為(115.67±1.53)個(gè)，兩組相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=14.18，P=0.000)(圖3C、圖3D)。

圖3 BMP-6 siRNA對(duì)RPE細(xì)胞形態(tài)及遷移力的影響 A:顯微鏡下觀察對(duì)照組RPE細(xì)胞形態(tài)(×100)；B:顯微鏡下觀察BMP-6 siRNA組RPE細(xì)胞形態(tài)(×100)；C:Transwell 法檢測(cè)對(duì)照組細(xì)胞遷移情況(×200)；D:Transwell 法檢測(cè)BMP-6 siRNA組細(xì)胞遷移情況(×200)。

2.5 BMP-6過(guò)表達(dá)對(duì)TGF-β2所致RPE細(xì)胞遷移的影響對(duì)照組、TGF-β2組、BMP-6過(guò)表達(dá)組、TGF-β2+BMP-6過(guò)表達(dá)組細(xì)胞遷移數(shù)分別為(60.00±6.25)個(gè)、(112.00±9.64)個(gè)、(44.33±5.51)個(gè)、(90.33±3.51)個(gè)。與對(duì)照組相比，TGF-β2組細(xì)胞遷移數(shù)增加，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)；與對(duì)照組相比，BMP-6過(guò)表達(dá)組細(xì)胞遷移數(shù)略有減少，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P=0.076)；與TGF-β2組相比，TGF-β2+BMP-6過(guò)表達(dá)組細(xì)胞遷移數(shù)減少，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.016)(圖4)。

圖4 Transwell 法檢測(cè)BMP-6過(guò)表達(dá)對(duì)TGF-β2所致RPE細(xì)胞遷移能力的影響(×200) A:對(duì)照組；B：BMP-6過(guò)表達(dá)組；C：TGF-β2組；D：TGF-β2+BMP-6過(guò)表達(dá)組。

3 討論

本研究首次發(fā)現(xiàn)BMP-6可以阻止TGF-β2誘導(dǎo)的RPE細(xì)胞的遷移。本研究結(jié)果證實(shí)了BMP-6過(guò)表達(dá)可以抑制TGF-β2所致的RPE細(xì)胞的遷移，而且在體外，BMP-6 siRNA干擾BMP-6后可以促進(jìn)RPE細(xì)胞的遷移。

本研究結(jié)果顯示，TGF-β2作用后RPE細(xì)胞形態(tài)發(fā)生改變，呈現(xiàn)典型的紡錘形變化；RPE細(xì)胞經(jīng)過(guò) BMP-6 siRNA作用后，細(xì)胞形態(tài)發(fā)生改變，亦呈現(xiàn)典型的紡錘形變化。正常情況下，RPE細(xì)胞呈六邊形，整齊排列，即所謂的鋪路石樣，在相差顯微鏡的亮視野下可觀察到明顯的色素形成，并且在細(xì)胞表面表達(dá)鈣黏附蛋白E(E-cadherin) 等上皮的特征性蛋白;當(dāng)發(fā)生EMT時(shí)，細(xì)胞逐漸丟失了上皮的特征，形狀呈梭形，排列松散，這種細(xì)胞穩(wěn)定性差，極易遷移至玻璃體并改變細(xì)胞周?chē)|(zhì)的環(huán)境，促進(jìn)視網(wǎng)膜前膜的形成，而前膜的收縮導(dǎo)致?tīng)坷訰D，這是PVR的發(fā)病機(jī)制，也是影響內(nèi)眼手術(shù)治療效果的重要因素[7]。

TGF-β2在視網(wǎng)膜纖維化進(jìn)程中的 RPE 細(xì)胞去分化、ECM 合成和視網(wǎng)膜收縮過(guò)程中發(fā)揮重要作用[8]，且視網(wǎng)膜和玻璃體中TGF-β2 的表達(dá)水平與PVR的嚴(yán)重程度相關(guān)。TGF-β在誘導(dǎo)RPE細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化中起作用，這與纖維化并發(fā)癥，如PVR有關(guān)[9]。

BMP信號(hào)通路不僅參與正常組織的生長(zhǎng)和發(fā)育，還與多種腫瘤的發(fā)展有關(guān)，與腫瘤及腎臟組織的增殖及纖維化密切相關(guān)[10]，但有關(guān) BMP信號(hào)通路在PVR發(fā)病中扮演的角色還有待闡明。我們既往研究發(fā)現(xiàn)，氧化應(yīng)激可以明顯地抑制BMP-6的表達(dá)，且在體外，BMP-6可以通過(guò)MAPK及Smad信號(hào)通路對(duì)抗氧化應(yīng)激所致的細(xì)胞凋亡，起到保護(hù)RPE細(xì)胞的作用[11-12]。

在很多研究中發(fā)現(xiàn)，BMP可以對(duì)抗TGF所致的細(xì)胞的EMT。Shu等[13]研究發(fā)現(xiàn)，BMP-7可以抑制TGF-β2所致的晶狀體上皮細(xì)胞的纖維化。在癌細(xì)胞侵襲方面，有學(xué)者也證實(shí)了BMP信號(hào)通路與 TGF-β 所起的作用是相互對(duì)抗的[14]。Song等[15]最新研究發(fā)現(xiàn)，過(guò)表達(dá)BMP-7可以通過(guò)Wnt3/β-catenin信號(hào)通路逆轉(zhuǎn)TGF-β所致的EMT。

Dendooven等[16]研究發(fā)現(xiàn)，內(nèi)源性BMP-6的丟失可以加重腎臟的纖維化；Liu等[17]研究也發(fā)現(xiàn)，降低BMP-6表達(dá)可以促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的EMT，進(jìn)而導(dǎo)致乳腺癌細(xì)胞耐藥性的產(chǎn)生；但目前沒(méi)有見(jiàn)到BMP-6對(duì)RPE細(xì)胞EMT抑制作用的相關(guān)研究。在針對(duì)RPE細(xì)胞的研究中，Yao等[18]發(fā)現(xiàn)，在11比例培養(yǎng)的 ARPE-19和原代人RPE細(xì)胞中加用BMP-4可以抑制TGF-β誘導(dǎo)的EMT。BMP抑制劑Gremlin可以促進(jìn)RPE的增殖及新生血管的形成[19]。但在RPE細(xì)胞中，BMP-6可否逆轉(zhuǎn)RPE細(xì)胞的纖維化的研究尚未見(jiàn)報(bào)道。本研究結(jié)果顯示，通過(guò)正向即BMP-6過(guò)表達(dá)，反向即BMP-6干擾后均證實(shí)了BMP-6可以起到影響RPE細(xì)胞遷移的相關(guān)作用，而且BMP-6過(guò)表達(dá)可以對(duì)抗TGF-β2所致RPE細(xì)胞的遷移。

總之，我們的研究首次在RPE細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)BMP-6可以逆轉(zhuǎn)TGF-β2所致RPE細(xì)胞的遷移，具體是通過(guò)什么樣的信號(hào)通路起作用的有待進(jìn)一步研究。本研究結(jié)果強(qiáng)調(diào)了一種潛在的新機(jī)制來(lái)預(yù)防RPE細(xì)胞的纖維化，為PVR的防治提供新的視角。